Name: Isolierung von Adipose-Gewebekernen für einzellige Genomanwendungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von Einzelkernen aus reifen Adipozyten für hochwertige Einzelzell-Transkriptom-Analysen. Diese robuste Methode minimiert Kernaggregate und ermöglicht präzise Studien zur Fettgewebestruktur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken David Reynolds vom Albert Einstein Genomics Core und Jinghang Zhang vom Flow Cytometry Core für die technische Unterstützung. Wir würdigen die Unterstützung der National Institutes of Health (NIH) (DK110426) und Pilot- und Machbarkeitsstipendien vom Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541) und dem New York Obesity Research Center (DK026687) (alle nach K.S.). Wir danken auch Albert Einstein Cancer Center (CA013330) für die Kernunterstützung.

Tierpflege und Experimente wurden nach Verfahren durchgeführt, die vom Institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschuss der Albert Einstein College of Medicine genehmigt wurden.
1. Vorbereitung von Gewebeverdauungs- und Lysepuffern
<ol><li>Bereiten Sie den Gewebeverdauungspuffer vor.<ol>
<li>Bereiten Sie für jedes Gramm Fettgewebe einen Verdauungspuffer von 1 ml vor.</li>
		<li>1,5 U/ml Kollagennase D und 2,4 U/ml Dispase II abwägen und Phosphatgepufferte Saline (PBS) hinzufügen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereiten des Kernvorbereitungspuffers (NPB).<ol>
<li>Bereiten Sie 10 mM HEPES, 1,5 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Kaliumchlorid, 250 mM Saccharose und 0,1% NP-40 in nukleasefreiem Wasser vor. Gut mischen. Saccharose kann mehr Zeit in Anspruch nehmen, um sich aufzulösen als die anderen Komponenten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) Lösung vor.<ol>
<li>0,5% BSA in PBS mit EDTA-haltigem Ziel vorbereiten. Es wird empfohlen, sterilgefilterte Zellkultur-PBS zu verwenden (siehe Materialtabelle).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Enzymatische Verdauung von Fettgewebe
<ol><li>Sezieren Sie Mäuse, um Fettgewebe nach Aune et al.13zu extrahieren. Sammeln Sie isoliertes Gewebe in einer Schüssel, die PBS enthält. Übertragen Sie das Gewebe auf ein Papiertuch, um trocken zu klopfen. Dann legen Sie das Gewebe in eine saubere Schale.</li>
	<li>Calciumchlorid in den Verdauungspuffer zu einer Endkonzentration von 10 mM geben. Fügen Sie ein kleines Volumen des Verdauungspuffers in die Schale und gründlich Hackfleisch das Fettgewebe. Das benötigte Volumen des Verdauungspuffers basiert auf der Menge des isolierten Gewebes. In der Regel werden 1 ml oder weniger verwendet.</li>
	<li>Fügen Sie etwa die Hälfte des vorbereiteten Verdauungspuffers (z. B. 10 ml für fünf Mäuse) in das gehackte Gewebe ein. Mit einer serologischen Pipette die Probe in ein 50 ml konisches Zentrifugenrohr übertragen. Fügen Sie eine beliebige verbleibende Menge an Puffer hinzu, um die Schale zu waschen und in das 50 ml-Rohr mit der Probe zu übertragen. Pipette mehrmals rauf und runter. Dann mit Schütteln bei 200-210 Rpm bei 37 °C für 12-15 min bebrüten.</li>
</ol>3. Adipozyten-Isolierung
<ol><li>Fügen Sie nach der Inkubation 0,5% BSA im Verhältnis 1:1 zur Probe hinzu. Mischen Sie gut, indem Sie mehrmals nach oben und unten. Zentrifuge die Probe bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT), um die stromale Gefäßfraktion (SVF) zu drehen. Der Adipozytenanteil verbleibt in der obersten Schicht der Probe.</li>
	<li>Legen Sie einen 40-m-Zellfilter auf ein 50 ml kegelförmiges Zentrifugenrohr und filtern Sie die Probe, sammeln Sie die obere Schicht und lassen Sie den SVF an der Unterseite des Rohres zurück. Übertragen Sie die obere Schicht (Adipozytenfraktion) in ein neues Rohr, indem Sie den Filter auf den Kopf über das Rohr kippen und 0,5% BSA verwenden, um den Filter umzukehren und die Probe im Rohr zu sammeln.</li>
	<li>Bringen Sie das Gesamtvolumen von 0,5 % BSA auf 10-15 ml basierend auf Probengröße und Pipette nach oben und unten mit einer serologischen Pipette oder schütteln Sie kurz nach oben und unten, um die Probe zu mischen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 300 x g für 5 min bei RT wieder.</li>
</ol>4. Kernisolierung
<ol><li>Verwenden Sie eine Breitbohrpipettenspitze und übertragen Sie vorsichtig die obere Schicht der Probe auf einen 100-m-Zellfilter, der auf einem neuen vorgekühlten Rohr auf Eis platziert wird, wodurch Rest-SVF zurückbleibt.</li>
	<li>Spülen/waschen Sie den Filter mit einer ausreichenden Menge NPB und entsorgen Sie den Filter. Von diesem Schritt vorwärts haben die Probe auf Eis so oft wie möglich und arbeiten schnell, um undichte und/oder ungesunde Kerne zu vermeiden. Es ist hilfreich, Mikrozentrifugenrohre vorzukühlen, die in zukünftigen Schritten auf Eis verwendet werden.</li>
	<li>Legen Sie die Probe auf Eis für nicht mehr als 2 min mit intermittierenden sanften Inverting der Röhre zu mischen. Die Inkubationszeit auf Eis sollte für die Probengröße und die Art der Adipozyten optimiert werden. Zentrifuge bei 1.000 x g bei 4 °C für 10 min.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml NPB wieder auf. Übertragen Sie die Probe in ein sauberes Mikrozentrifugenrohr. Vermeiden Sie beim Übertragen das Berühren der Wände des Rohres, die Schmutz und Lipid enthalten. Fügen Sie der Probe 0,6 U/L-RNase-Inhibitor hinzu und mischen Sie sie. Zentrifugieren Sie wieder bei 1.000 x g bei 4 °C für 10 min. HINWEIS: Zentrifugationsgeschwindigkeit und -zeit sollten bei kleineren Proben in diesem Schritt verringert werden.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie sich in 1 ml Nuclei Wash Buffer (2% BSA/PBS + 0,6 U/L RNase-Inhibitor) wieder auf.</li>
	<li>Doppelfilter in ein Randrohr mit stapelbaren 30-mm-Filtern. Waschfilter mit einem kleinen Volumen (ca. 300 l) Nuclei Wash Buffer. Alternativ können Sie für kleinere Proben einen 30-mm-Filter verwenden, der in ein Mikrozentrifugenrohr passt und direkt hineinfiltert.</li>
	<li>Bestätigen Sie die erfolgreiche Isolierung gesunder Kerne.<ol>
<li>Färben Sie ein kleines Aliquot der Probe mit Trypan und verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler, um die durchschnittliche totabgestorbene Größe und prozentuale abgestorbene Zellen zu bewerten. Die durchschnittliche Totgröße für eine Probe, die hauptsächlich Kerne enthält, sollte zwischen 7-10 m liegen. Die Größe der Kerne liegt in der Regel bei etwa 8 m.</li>
		<li>Färben Sie ein kleines Aliquot der Probe mit DAPI und untersuchen Sie unter dem Mikroskop mit einem 20-fachen Objektiv oder höher. Die Kernmembran sollte intakt sein und die Kerne sollten rund sein.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. FACS Reinigungs- und Kernkonzentrationsschritt
<ol><li>Gehen Sie sofort zum FACS-Schritt, um Die Kerne zu säubern und überschüssigen Schmutz zu entfernen. Der Auflistungspuffer sollte Nuclei Wash Buffer enthalten. Während FACS wird der Puffer verdünnt. Die Vorbereitung einer höheren Konzentration von BSA- und RNase-Inhibitoren zur Berücksichtigung der Verdünnung während der Sortierung ist hilfreich. Der FACS-Sammelblock sollte sich im Kühlmodus befinden.</li>
	<li>Nach dem Sortieren der Kerne zentrifugieren Sie bei 500 x g für 5 min bei 4 °C, um die Probe zu konzentrieren. Rekonstituieren Sie sich in einem geeigneten Volumen von Nuclei Wash Buffer, um eine Konzentration von 500-1.500 Kernen/L zu erreichen. Versuchen Sie nicht, alle Überstandzuerkennen zu entfernen. Dies führt zum Verlust von Kernen.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Hämozytometer und ein DAPI-gefärbtes Aliquot für eine endgültige Zählung und um die Kerne zu visualisieren. Fahren Sie dann sofort mit snRNA-seq gemäß dem Herstellerprotokoll fort.</li>
</ol>

<ol><li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+importance+of+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).</li>
<li>van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-activated+brown+adipose+tissue+in+healthy+men%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cold-activated brown adipose tissue in healthy men.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).</li>
<li>Virtanen, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+brown+adipose+tissue+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional brown adipose tissue in healthy adults.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).</li>
<li>Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+evidence+for+active+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).</li>
<li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+incidence+of+metabolically+active+brown+adipose+tissue+in+healthy+adult+humans%3A+effects+of+cold+exposure+and+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity.</a> Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).</li>
<li>Yoneshiro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruited+brown+adipose+tissue+as+an+antiobesity+agent+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).</li>
<li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+brown+adipose+tissue+by+a+%CE%B23-adrenergic+receptor+agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).</li>
<li>Song, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-+and+high-thermogenic+brown+adipocyte+subpopulations+coexist+in+murine+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).</li>
<li>Cinti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CL316%2C243+and+cold+stress+induce+heterogeneous+expression+of+UCP1+mRNA+and+protein+in+rodent+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+stress+induces+glycolytic+beige+fat+formation+via+a+myogenic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state.</a> Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PloS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Transcriptional+and+Epigenomic+Profiling+from+Specific+Cell+Types+within+Heterogeneous+Tissues+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li>
<li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige%2Fbrite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).</li>
<li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+digital+transcriptional+profiling+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells.</a> Nature Communications. 8, 14049(2017).</li>
<li>Pollen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-coverage+single-cell+mRNA+sequencing+reveals+cellular+heterogeneity+and+activated+signaling+pathways+in+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex.</a> Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).</li>
<li>Hayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+full-length+total+RNA+sequencing+uncovers+dynamics+of+recursive+splicing+and+enhancer+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs.</a> Nature Communications. 9 (1), 619(2018).</li>
<li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+chromatin+landscapes+of+human+immune+cell+development+and+intratumoral+T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion.</a> Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+epitope+and+transcriptome+measurement+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.</a> Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).</li>
<li>Peterson, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+quantification+of+proteins+and+transcripts+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells.</a> Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).</li>
<li>Gaublomme, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+multiplexing+with+barcoded+antibodies+for+single-nucleus+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics.</a> Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Es wird eine einfache und robuste Methode zur Isolierung einzelner Kerne und zur Untersuchung der Heterogenität des Fettgewebes vorgestellt. Im Vergleich zur Sequenzierung der gesamten Gewebe-RNA bietet dieser Workflow einen unvoreingenommenen Blick auf die zelluläre Heterogenität und populationsspezifische Marker. Dies ist signifikant und innovativ für die Weiterentwicklung der Adipozytenbiologie, des molekularen Stoffwechsels und der Adipositasforschung.
Dieses Protokoll ist speziell für die...

Studien haben gezeigt, dass braunes Fettgewebe (BAT) eine bemerkenswerte Fähigkeit hat, Energie abzuleiten. Zwei Arten von thermogenen Adipozyten mit unterschiedlichen Entwicklungsmerkmalen existieren sowohl bei Nagetieren als auch beim Menschen: Beige-Adipozyten und klassische braune Adipozyten. Während sich klassische braune Adipozyten meist in interscapularen BVT-Depots befinden, entstehen beige adipozyten sporadisch in weißem Fettgewebe (WAT) als Reaktion auf bestimmte physiologische Hinweise, wie chronische Kälteexposition, ein Prozess, der als "Browning" oder "Beiging" bezeichnet wird. Durch den Einsatz von fortgeschrittener Bildgebung ist nun klar, dass erwachsene Menschen über erhebliche Depots von UCP1+ BAT verfügen, insbesondere in der supktoicularen Region1,2,3,4. Die Menge der erwachsenen menschlichen BAT korreliert umgekehrt mit Fettleibigkeit und kann durch externe Hinweise erhöht werden, wie chronische Kälteexposition5,6 oder 3-adrenergen Rezeptoragonisten7. DIE von BVT vermittelten Energieausgaben können einen praktikablen Ansatz zur Bekämpfung von Fettleibigkeit bieten.
Bis vor kurzem galten thermogene Adipozyten als homogene Population. Studien haben jedoch die Existenz mehrerer Subtypen oder Subpopulationen aufgedeckt, die sich in Entwicklungsherkunft, Substratnutzung und Transkriptom8,,9,10unterscheiden. Zum Beispiel wurde kürzlich eine Art von Beige-Adipozyten beschrieben, die bevorzugt Glukose für die Thermogenese verwendet, die g-beige adipocyte, vor kurzem10beschrieben. Das unvollständige Verständnis von Zelltypen in braunem und beigeem Fettgewebe und das Fehlen spezifischer Marker stellen ein kritisches Hindernis für die Untersuchung ihrer biologischen Funktionen dar.
Herkömmliche Methoden zur Isolierung von Subpopulationen von Zellen basieren auf der Expression nur einiger bekannter Markergene. Jüngste Fortschritte in der einzelzelligen Genomik ermöglichen die Verwendung globaler Genexpressionsdaten einzelner Zellen, um eine unvoreingenommene Schätzung der Anzahl der Subpopulationen in einem Gewebe zu liefern. Das Endziel dieses Protokolls ist es, alle Fettgewebe-Subtypen unter verschiedenen thermogenen Reizen in einer einzelzelligen Auflösung zu bestimmen. Im Gegensatz zu anderen Geweben und Zelltypen ist die Bestimmung zellulärer Subtypen von Fettgewebe aufgrund der Fragilität von lipidgefüllten Adipozyten eine Herausforderung. Dieses Papier führt ein robustes Protokoll ein, um einzelne Kerne aus Fettgewebe für die nachgeschaltete Anwendung zur SnRNA-Sequenzierung zu isolieren. Wichtig ist, dass aktuelle Literatur, die gut aufeinander abgestimmte Single-Nuklei-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) und einzellige RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) vergleicht, zeigte, dass snRNA-seq mit scRNA-seq in der Zelltyp-Detektion vergleichbar ist und in der zellulären Abdeckung für ein komplexes Gewebe wie das Gehirnüberlegen ist 11. Dieses Protokoll kombiniert eine Dichtegradientenzentrifugationsmethode, die von Rosen et al.12 für Fettgewebe optimiert wurde, mit einem "Cleanup"-Schritt der Kerne mit einem MoFlo XDP High Speed Sorter. Wie in den repräsentativen Ergebnissen zu sehen ist, identifizierte eine Analyse von 7.500 einzelnen Kernen aus dem interskapulären braunen Fettgewebe der Maus mehrere Zelltypen in scheinbar homogenen braunen Adipozyten. Insgesamt kann dieses einfache und robuste Protokoll angewendet werden, um die Organisation von Adipozyten und adipose-residenten Zellen auf Gewebeebene, die Identifizierung subtypspezifischer Markergene und die Entwicklung von Phänotypisierung von adipose-selektiven Knockout/transgenen Mäusen zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>autoMACS Spüllösung</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>PBS mit EDTA; sterilfiltriert</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1595</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>Küvettenfilter 100 &mu; m</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Zellenfilter 40&mu; m</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics (30 &mu; m)</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Automatisierter Zellzähler</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fischer</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (30 & Mikro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td>Stapelbare Filter</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>MoFloXDP Zellsortierer</td><td>Beckman Coulter</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Protector RNase Inhibitor</td><td>Roche</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher</td><td>S5-3</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von adipose-gewebekernen für einzellige genomanwendungen

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

Braunes und beiges Fett sind spezialisierte Fettgewebe, die Energie für die Thermogenese durch UCP1 (Uncoupling Protein-1) abhängige und unabhängige Wege ableiten. Bis vor kurzem galten thermogene Adipozyten als homogene Population. Neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass es mehrere Subtypen oder Subpopulationen gibt, die sich in Entwicklungsherkunft, Substratverwendung und Transkriptom unterscheiden. Trotz der Fortschritte in der einzelligen Genomik war die unvoreingenommene Zersetzung von Fettgeweben in zelluläre Subtypen aufgrund der zerbrechlichen Natur von lipidgefüllten Adipozyten eine Herausforderung. Das vorgestellte Protokoll wurde entwickelt, um diese Hindernisse durch eine effektive Isolierung einzelner Kerne aus Fettgewebe für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich der RNA-Sequenzierung, zu umgehen. Die zelluläre Heterogenität kann dann durch RNA-Sequenzierung und bioinformatische Analysen analysiert werden.

Unsortierte Adipozytenkerne enthalten Trümmer und Doublets, die bei der nachgeschalteten einzelzelligen RNA-Sequenzierung Rauschen und hohen Hintergrund erzeugen. Die repräsentative FACS-Gate-Strategie ist in Abbildung 1dargestellt. Die Kerne wurden zuerst auf der Grundlage von Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) (A) ausgewählt, dann wurden nur Singlets auf der Grundlage der Kombination von Breite und Höhen von SSC (B</str...

Diese Veröffentlichung beschreibt ein Protokoll zur Isolierung von Kernen aus ausgereiften Adipozyten, zur Reinigung durch fluoreszenzaktivierte Sortierung und zur einzelligen Transkriptomik.

Isolierung von Adipose-Gewebekernen für einzellige Genomanwendungen

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...

Die Zersetzung von Fettgewebe in Subtypen war aufgrund der zerbrechlichen Natur von Adipozyten eine Herausforderung. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um dies durch eine effektive Isolierung einzelner Kerne zu überwinden. Dieser Workflow bietet hochgereinigte Einzelkerne mit minimierten Kernaggregaten und zellulären Ablagerungen.Dies ist vorteilhaft für einzellige Transkriptom-Profile von Tausenden von Zellen. Dieses einfache und robuste Protokoll kann angewendet werden, um die Organisation von Adipozyten auf Gewebeebene in ihren adipose residenten Zellen zu untersuchen. Und insbesondere zur Entwicklung von Phänotypisierung, Fettknockout und transgenen Mäusen.Die visuelle Demonstration dieses Protokolls ist von entscheidender Bedeutung, damit Personen, die nicht über viel Erfahrung im Umgang mit Adipozyten verfügen, die Heterogenität von Adipose replizieren und einblickindieeen können. Nachdem Sie Fettgewebe von Mäusen gesammelt haben, klopfen Sie es mit einem Papiertuch trocken und legen Sie es in eine saubere Schale. Calciumchlorid in den Verdauungspuffer zu einer Endkonzentration von 10 mM geben.Dann fügen Sie ein kleines Volumen in das Gewebe und gründlich Hackfleisch. Fügen Sie etwa die Hälfte der Menge des vorbereiteten Verdauungspuffers in das gehackte Gewebe. Und verwenden Sie eine serologische Pipette, um die Probe in ein 50 ml Zentrifugenrohr zu übertragen.Waschen Sie die Schale mit dem restlichen Puffer und fügen Sie sie dem 50 ml Rohr hinzu. Pipette die Probe auf und ab mehrmals. Dann bebrüten Sie es für 12 bis 15 Minuten bei 37 Grad Celsius, während es bei 200 bis 210 Rpm schüttelt.Nach der Inkubation 0,5%BSA zu der Probe bei einem Volumenverhältnis von 1 bis 1 hinzufügen und durch Pipettieren gut mischen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 300 xg für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um die stromovaskuläre Fraktion zu drehen und die Adipozytenfraktion oben zu lassen. Filtern Sie den oberen Bruch durch einen 400 m Zellfilter in ein 50 ml Rohr.Drehen Sie dann den Filter auf den Kopf über das Rohr und übertragen Sie die Adipozyten in ein neues Rohr mit 0,5%BSA, um den Filter umzukehren. Bringen Sie das Gesamtvolumen der BSA auf 10 bis 15 ml und pipette die Probe mit serologischer Pipette nach oben und unten. Dann zentrieren Sie es wieder bei 300 xg für fünf Minuten bei Raumtemperatur.Nach der Zentrifugation verwenden Sie eine breitbohrungspipette Spitze, um die obere Schicht der Probe sorgfältig auf einen 100 m Zellfilter auf einem neuen vorgekühlten Rohr auf Eis zu übertragen. Spülen Sie den Filter mit einer ausreichenden Menge an Kernvorbereitungspuffer, und entsorgen Sie ihn dann. Von diesem Schritt vorwärts, halten Sie eine Probe auf Eis und arbeiten schnell.Lassen Sie die Probe bis zu zwei Minuten zeitweilig auf Eis und invertieren Sie die Röhre zum Mischen. Dann Zentrifuge bei 1000 xg und 4 Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml Kernvorbereitungspuffer wieder auf.Übertragen Sie die Probe in ein sauberes Mikrozentrifugenrohr, um zu vermeiden, dass die Wände des alten Rohres berührt werden. Fügen Sie 0,6 Einheiten pro L RNase-Hemmer hinzu und mischen Sie ihn. Zentrifugieren Sie die Probe dann für weitere 10 Minuten.Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie ein Pellet und 1 ml Kernwaschpuffer wieder auf. Filtern Sie die Probe mit stapelbaren 30 m Filtern in ein Sauberes Rohr. Dann waschen Sie die Filter mit ca. 300 L Kernwaschpuffer.Um die erfolgreiche Isolierung gesunder Kerne zu bestätigen, färben Sie ein kleines Aliquot der Probe mit Trypan und verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler, um die durchschnittliche Totgröße und Prozent der abgestorbenen Zellen zu bewerten. Stain in einem kleinen Aliquot der Probe mit DAPI und untersuchen Sie es unter dem Mikroskop mit einem 20X Objektiv oder höher. Die Kerne sollten rund sein und eine intakte Kernmembran haben.Weiße Pfeile zeigen Kerne ohne intakte Membran an. Nach dem Aufräumen der Kerne mit FACS, konzentrieren Sie diese Probe durch Zentrifugieren bei 500 xg für fünf Minuten bei 4 Grad Celsius. Dann rekonstituieren Sie es in einem entsprechenden Volumen von Kernen Waschpuffer.Um eine 50 bis 1500 Kerne pro L-Konzentration zu erreichen und mit einzelligen Kernen RNA seq fortzufahren. Um Zellablagerungen und Doublets zu entfernen, werden Adipozytenkerne nach Größe und Granularität sortiert, um kernnukleare Aggregate und Multiplets auszuschließen. Und schließlich für DAPI positive Ereignisse.Diese Einstufungsstrategie führt zu hochgereinigten Einzelkernen mit minimalen Aggregaten und Ablagerungen. Bei der Mikroskopie sollten die sortierten Kerne rund sein und eine intakte Membran haben. Eine erfolgreiche Reinigung der Kerne kann auch mit Echtzeit-qRT-PCR mit Primern für entstehende Ucp1 mRNA, einem Markergen für braune Adipozyten, durchgeführt werden.Die Chromplattform ermittelte ein Transkriptom von 7500 Kernen aus murinem interscapularem braunem Fettgewebe. Sieben verschiedene Zelltypen wurden mit t-SNE-Dimensionsreduktion und k-Mittel-Clustering aufgedeckt. Alle Cluster exprimierten Fabp4, ein Pan-Adipozyten-Gen und eine Teilmenge einen hohen Gehalt an Ucp1 mRNA.Kerne isoliert und dann bestätigt, obwohl dieses Protokoll kann praktisch jede Single-Zell-Level-Gen-Expression-Plattform einschließlich Chrom von 10x Genomics unterzogen werden.

isolation-adipose-tissue-nuclei-for-single-cell-genomic

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Durch die drastische und negative Zusammenhang zwischen Fettleibigkeit und andere Begleiterkrankungen, Forschung über die Rolle Fettgewebe spielt in Krankheit und die allgemeine Gesundheit gerechtfertigt ist. Wir stellen ein Protokoll für die Isolierung und Entfernung von Fettgewebe Depots ermöglicht die Untersuchung von Fettgewebe unter Verwendung von in situ und in vitro-Verfahren.

Lokalisierung, Identifizierung und Exzision Murine Fettgewebe Depots

Die Isolierung einzelner Kerne beruht auf der Dissoziation und der Waschmittel-basierten Permeabilisierung der Zellmembran, Schritte, die optimiert werden müssen und anfällig für die Einführung technischer Artefakte sind. Wir zeigen ein Waschmittel- und enzymfreies Protokoll zur schnellen Isolierung intakter Kerne direkt aus dem gesamten Gewebe, das Kerne liefert, die für Single-Nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) oder ATAC-seq geeignet sind.

Kernisolierung aus ganzem Gewebe mit einer Waschmittel- und enzymfreien Methode

Dieses Protokoll beschreibt den technischen Ansatz zur Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Depots aus weißem Fettgewebe (WAT) durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder immunomagnetische Kügelchentrennung.

Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Fettdepots

Diese Studie beschreibt eine neue Methode zur Isolierung von murinen braunen Adipozyten für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse.

Isolierung von braunen Adipozyten aus murinem interskapulärem braunem Fettgewebe für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung hochwertiger Kerne aus gefrorenen Mausnieren vor, das die Repräsentation von medullären Nierenzelltypen verbessert und die Genexpressionsartefakte aus der enzymatischen Gewebedissoziation vermeidet.

Zellkernisolierung aus der Niere adulter Mäuse für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von Kernen aus schockgefrorenem, archiviertem Lebergewebe für Einzelkern-RNA-seq, ATAC-seq und Gelenk-Multiomics (RNA-seq und ATAC-seq) vor.

Isolierung von Zellkernen aus schockgefrorenem Lebergewebe für Einzelzell-Multiomics

Wir präsentieren ein Protokoll für den Assay von Transposase-zugänglichem Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (ATAC-seq) speziell an Adipozyten mittels Zellkernsortierung mit Fettgewebe, das aus transgenen Reportermäusen mit nukleärer Fluoreszenzmarkierung isoliert wurde.

Adipozyten-spezifischer ATAC-Seq mit Fettgewebe mittels fluoreszenzaktivierter Zellkernsortierung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Präparation von Zellkernen beschreibt. Nach Mikrodissektion und enzymatischer Dissoziation von Herzgewebe in Einzelzellen wurden die Vorläuferzellen eingefroren, gefolgt von der Isolierung von reinen lebensfähigen Zellen, die für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung und den Einzelkern-Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierungsanalysen verwendet wurden.

Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung

Die Studie beschreibt ein einfaches, schnelles und teilautomatisiertes Protokoll zur Isolierung hochwertiger Zellkerne aus gefrorenem Säugetiergewebe für die nachgeschaltete Einzelkern-RNA-Sequenzierung.

Ein einfaches, schnelles und teilautomatisiertes Protokoll für die Isolierung von Einzelkernen aus gefrorenem Säugetiergewebe für die Einzelkernsequenzierung

Die Biologie des intermuskulären Fettgewebes (IMAT) ist aufgrund der begrenzten Zugänglichkeit von menschlichem Gewebe weitgehend unerforscht. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die Zellkernisolierung und die Bibliotheksvorbereitung von gefrorenen humanen IMAT für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung, um die zelluläre Zusammensetzung dieses einzigartigen Fettdepots zu identifizieren.

Isolierung von Zellkernen aus humanem intermuskulärem Fettgewebe und nachgeschaltete Einzelkern-RNA-Sequenzierung

Erfahren Sie die Isolierung von Einzelkernen aus reifen Adipozyten für hochwertige Einzelzell-Transkriptom-Analysen. Diese robuste Methode minimiert Kernaggregate und ermöglicht präzise Studien zur Fettgewebestruktur.

Isolierung von Adipose-Gewebekernen für einzellige Genomanwendungen

Weitere Videos entdecken