Methylierte RNA-Immunpräzipitierung Assay zur Studie m5C Modifikation bei Arabidopsis
14. Mai 2020
Der methylierte RNA-Immunpräzipitationstest ist eine Antikörper-basierte Methode zur Anreicherung für methylierte RNA-Fragmente. Gekoppelt mit einer tiefen Sequenzierung führt dies zur Identifizierung von Transkripten, die die m5C-Modifikation tragen.
Die Immunpräzipitation mit methylierter RNA, auch MeRIP genannt, ist eine Methode zur Identifizierung methylierter Gruppen in ganzen Transkriptomen. Es kann an RNA-Extrakte vieler Modellorganismen angepasst werden. Die Methode ist einfach, erfordert keine harte chemische Behandlung und kann verwendet werden, um jede RNA-Modifikation zu kartieren, solange sie spezifisch variabel ist.
Um die RNA-Probe zu extrahieren, mahlen Sie zunächst 200 Milligramm der interessierenden Pflanzengewebeprobe zu Pulver in flüssigem Stickstoff und achten Sie darauf, dass das Gewebe während des gesamten Eingriffs gefroren bleibt. Geben Sie als Nächstes einen Milliliter RNA-Extraktionsreagenz, das Guanidinthiocyanat und saures Phenol enthält, zum gemahlenen Pflanzengewebe und mischen Sie es gut durch Inversion, wobei Sie darauf achten, dass das gesamte Gewebe nass ist. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren Sie die Proben und überführen den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen.
Geben Sie 200 Mikroliter 1-Brom-3-chlorpropan in den Überstand und wirbeln Sie die Probe kräftig durch. Trennen Sie die Phasen durch Zentrifugation und überführen Sie etwa 500 Mikroliter der oberen wässrigen Phase in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 500 Mikroliter Isopropanol und 50 Mikroliter drei molare Natriumacetate in die Probe und mischen Sie gut durch Inversion.
Inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius, bevor Sie die RNA durch Zentrifugation ausfällen. Nach dem Entsorgen des Überstands das Pellet zweimal mit 500 Mikrolitern 80 % Ethanol und einmal mit 500 Mikrolitern 99 % Ethanol waschen. Trocknen Sie das Pellet nach der letzten Wäsche fünf bis 10 Minuten lang, bevor Sie es in 30 Mikrolitern RNase-freiem Wasser auflösen.
Messen Sie die RNA-Konzentration auf einem Spektralphotometer und verdauen Sie 20 Mikrogramm der RNA-Probe in einem DNase-Wasser und einer Pufferlösung. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius verwenden Sie ein geeignetes Volumen des DNase-Inaktivierungsreagenzes, um das Enzym zu entfernen, und überprüfen Sie die Qualität und Reinheit der isolierten RNA durch Kapillarelektrophorese gemäß den Standardprotokollen. Wenn die RNA-Integritätszahl der verdauten DNase-Probe höher als sieben ist, geben Sie mindestens 12 Mikrogramm jeder RNA-Probe in ein neues Röhrchen.
Gießen Sie 0,1 Nanogramm jedes zuvor hergestellten In-vitro-Transkripts, ein methyliertes und ein nicht-methyliertes, pro drei Mikrogramm RNA-Probe hinzu und bringen Sie das endgültige Volumen in jedem Röhrchen auf 80 Mikroliter mit RNase-freiem Wasser. Beschallen Sie dann das gesamte Volumen jeder RNA-Probe in einzelnen Beschallungsröhrchen und bestätigen Sie die Wirksamkeit der Beschallung und die Konzentration der RNA-Proben durch Kapillarelektrophorese. Die durchschnittliche Größe der fragmentierten RNA sollte etwa 100 Nukleotide betragen.
Für die Immunpräzipitation der methylierten RNA geben Sie neun Mikrogramm jeder beschallten RNA-Probe und bis zu 60 Mikroliter RNase-freies Wasser in neue einzelne Röhrchen mit geringer Bindung und erhitzen Sie die RNA 10 Minuten lang in einem Wasserbad auf 70 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation kühlen Sie die Proben 10 Minuten lang in einem Eiswasserbad ab und überführen Sie 20 Mikroliter jeder Probe in ein neues Röhrchen mit niedriger Bindung für die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius als Eingabe. Geben Sie RNase-freies Wasser zu den restlichen 40 Mikrolitern jeder Probe bis zu einem Endvolumen von 860 Mikrolitern und teilen Sie jede Probe in ein Röhrchen mit geringer Bindung für die Immunpräzipitation und ein Röhrchen mit niedriger Bindung als Scheinprobe auf.
Geben Sie 50 Mikroliter 10X MeRIP-Puffer und 10 Mikroliter RNase-Inhibitor zu jeder Probe. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter Anti-M5C-Antikörper in die Immunpräzipitationsröhrchen und 10 Mikroliter Wasser in die Scheinröhrchen. Verschließen Sie die Röhrchen mit Parafilm und inkubieren Sie die Proben 12 bis 14 Stunden lang bei vier Grad Celsius mit Überkopfdrehung.
Geben Sie am nächsten Morgen 40 Mikroliter Kügelchen in ein 15-Milliliter-Röhrchen pro Probe. Waschen Sie die Kügelchen mit drei fünfminütigen Wäschen mit 800 Mikrolitern MeRIP-Puffer und Überkopfrotation pro Probe und Waschgang, wobei Sie die Kügelchen nach jedem Waschgang auf einem Magneten sammeln, damit der Puffer verworfen werden kann. Nach dem dritten Waschen resuspendieren Sie die Kügelchen in 40 Mikrolitern frischem MeRIP-Puffer pro Probe und geben Sie 40 Mikroliter resuspendierte Kügelchen in die Immunpräzipitations- und Scheinprobenröhrchen für eine zweistündige Inkubation bei vier Grad Celsius mit Überkopfdrehung.
Legen Sie die Röhrchen am Ende der Inkubation für eine Minute auf ein Magnetgestell, bevor Sie den Überstand vorsichtig entsorgen, ohne die Kügelchen zu stören. Waschen Sie die Kügelchen fünfmal in 700 Mikrolitern MeRIP-Puffer, ergänzt mit 0,01 % Tween-20 für 10 Minuten pro Waschgang bei Raumtemperatur mit Überkopfrotation. Nach dem letzten Waschen resuspendieren Sie die Kügelchen in 200 Mikrolitern Proteinase-K-Verdauungspuffer und 3,5 Mikrolitern Proteinase K für eine dreistündige Inkubation bei 50 Grad Celsius mit Schütteln bei 800 Umdrehungen pro Minute.
Am Ende der Inkubation extrahieren Sie die RNA mit 800 Mikrolitern RNA-Extraktionsreagenz und dem sauren Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktionsprotokoll, wie gezeigt. Nach der Extraktion resuspendieren Sie das extrahierte RNA-Pellet in genau 20 Mikrolitern RNase-freiem Wasser. In dieser Abbildung ist ein repräsentativer Lauf einer guten RNA-Probe dargestellt.
In der gleichen Probe nach der Beschallung ist das Vorhandensein eines gleichmäßigen, nach links verschobenen Peaks mit einer Größe von etwa 100 Nukleotiden zu beobachten. Die niedrigere Konzentration wird sowohl durch den Verlust von RNA während der Fragmentierung als auch durch das vergrößerte Volumen der Probe verursacht. Die Qualität der Immunpräzipitation und der Scheinproben kann mittels quantitativer reverser Transkriptase-PCR beurteilt werden.
In dieser repräsentativen Analyse wurden etwa 80 % des methylierten In-vitro-Transkripts in der Immunpräzipitationsprobe wiedergefunden, während nur etwa 2 % in der Scheinprobe wiedergefunden wurden. Bei der nicht-methylierten Kontrolle lag die Wiederfindung sowohl in der Immunpräzipitations- als auch in der Scheinprobe unter 1 %. Nach der Tiefensequenzierung und dem Abgleich der Reads mit dem Genom können Peak-Calling-Algorithmen angewendet werden, um die statistisch signifikanten Fenster zu identifizieren, die in den Immunpräzipitationsproben im Vergleich zur Eingabe angereichert sind.
Anhand der Sequenzierungsdaten können wir das Motiv identifizieren, bei dem die RNA-Methylierung am häufigsten auftritt, und dieses Motiv kann als Köder dienen, um spezifische Bindungsproteine herunterzuziehen.
Übersicht
Der methylisierte RNA-Immunpräzipitations-Assay (MeRIP) ist eine leistungsstarke Technik zur Anreicherung methylierter RNA-Fragmente aus gesamten Transkriptomen. Diese Methode ermöglicht in Kombination mit Deep-Sequencing die Identifizierung von Transkripten, die die m⁵C-Modifikation tragen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Molekularbiologie
Hintergrund
- MeRIP dient zum Nachweis methylierter Gruppen in RNA.
- Die Methode ist an verschiedene Modellorganismen anpassbar.
- Sie verzichtet auf aggressive chemische Behandlungen und ist daher benutzerfreundlich.
- Bestimmte Variablen ermöglichen die Kartierung beliebiger RNA-Modifikationen.
Zweck der Studie
- Zur Anreicherung methylierter RNA-Fragmente.
- Zur Identifizierung von Transkripten mit m5C-Modifikationen.
- Um die Untersuchung von RNA-Modifikationen in verschiedenen biologischen Kontexten zu erleichtern.
Verwendete Methoden
- RNA-Extraktion aus Pflanzengewebe unter Verwendung von Guanidiniumthiocyanat und saurem Phenol.
- Sonolyse zur Fragmentierung der RNA in etwa 100 Nukleotide lange Stücke.
- Immunpräzipitation mit Anti-M5C-Antikörper.
- Tiefensequenzierung der angereicherten RNA-Proben.
Hauptergebnisse
- Etwa 80 % der methylierten Transkripte wurden in der Immunpräzipitationsprobe zurückgewonnen.
- Weniger als 2 % der methylierten Transkripte wurden in der Kontrollprobe ohne Antikörper zurückgewonnen.
- Unmethylierte Kontrollen zeigten in beiden Bedingungen eine Rückgewinnung unter 1 %.
- Statistisch signifikante, in Immunpräzipitationsproben angereicherte Bereiche wurden mithilfe von Peak-Aufruf-Algorithmen identifiziert.
Schlussfolgerungen
- MeRIP ist eine effektive Methode zur Untersuchung der RNA-Methylierung.
- Die Technik liefert Einblicke in RNA-Modifikationen über verschiedene Organismen hinweg.
- Tiefensequenzierung verbessert das Verständnis von transkriptomweiten Modifikationen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
MeRIP-seq ermöglicht die transkriptomweite Kartierung von RNA-Basenmodifikationen wie m5C, ohne vorherige Sequenzkenntnis oder harsche chemische Behandlungen zu erfordern. Diese Fähigkeit unterstützt die Target-Validierung und die mechanistische Risikominderung in der frühen Entdeckungsphase, indem epitranskriptomische Veränderungen mit phänotypischen Ergebnissen verknüpft werden. Die Methode liefert quantitative, reproduzierbare Anreicherungsdaten, die die Entwicklung von Assays und die Bereitschaft für Screening von Inhibitoren oder Modulatoren RNA-modifizierender Enzyme unterstützen können.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht RNA-Modifikationslandschaften, um die funktionellen Rollen von m5C bei der Genregulation und Signalwegaktivität zu klären.
- Operativer Wert: Ermöglicht die biologische Entlastung von RNA-bindenden Proteinen oder Methyltransferase-Zielen durch direkte Anreicherung modifizierter Transkripte.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem m5C-Anreicherung mit phänotypischen Messgrößen in krankheitsrelevanten Systemen korreliert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt validierte, modificationsangereicherte RNA-Pools für nachgeschaltete Bindungs- oder Funktionsassays.
- Operativer Wert: Liefert standardisierte, quantitative Eingabemengen zur Assay-Normalisierung und Reproduzierbarkeit über verschiedene Screening-Kampagnen hinweg.
- Skalierbarkeit: Funktioniert mit fragmentierter RNA aus verschiedenen Modellsystemen und ermöglicht so die Zielvalidierung über Artengrenzen hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet entdeckungsorientierte epitranskriptomische Befunde mit präklinischen Modellen über konservierte Modifikationsmotive.
- Mechanistische Entlastung: Beschränkt methylierte Bereiche auf Fenster mit wenigen Nukleotiden und erleichtert so die anschließende Validierung mit methodenbasierter Auflösung auf Basisebene.
- Biomarker-Korrelation: Identifiziert Modifikationsmuster, die als translationale Biomarker dienen könnten, wenn sie mit der phänotypischen Schwere korrelieren.
Pipeline- und Workflow-Integration
MeRIP-seq fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung an Zielstrukturen bis hin zur Optimierung von Leitverbindungen ein, insbesondere wenn RNA-Modifikationen als treibende Faktoren für Krankheitsmechanismen oder Arzneimittelwirkungen vermutet werden.
- Entdeckungsbiochemie: Überprüft Hypothesen zur Funktion von Writer-/Eraser-/Reader-Proteinen, indem Änderungen in der Landschaft der RNA-Modifikationen gemessen werden.
- Screening: Bereitet modifizierte RNA-Fraktionen für den Einsatz in RIP-, EMSA- oder Bindungsassays auf, um die Wirkung von Substanzen auf die Enzymaktivität zu bewerten.
- Analytik: Erstellt sequenzbasierte Anreicherungswerte und Peak-Detektionen, die einen quantitativen Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen oder genetischen Hintergründen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verknüpft m5C-Veränderungen mit der Aktivität von Signalwegen in Krankheitsmodellen, sofern durch phänotypische oder genetische Daten gestützt.
- Unternehmenstechnische Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Untersuchung beliebiger RNA-Modifikationen mit antikörperabhängiger Spezifität und reduziert damit den Aufwand für erneute Entwicklungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unklarheiten in RNA-Regulationsnetzwerken, indem direkte Nachweise des Modifikationszustands bereitgestellt werden.
- Operationaler Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Immunpräzipitation und stringente Mock-Kontrollen.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem Zielstrukturen entrisikt werden, deren phänotypische Effekte über RNA-Modifikationen vermittelt sind.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf der Häufigkeit von Modifikationen und funktioneller Anreicherung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit RNA, in Immunpräzipitation und in der Herstellung von Sequenzierbibliotheken.
- Setzt Zugang zu Beschallungsgeräten, Werkzeugen für die magnetische Trennung sowie quantitativen PCR- oder Sequenzierplattformen voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Antikörpervalidierung, dem Blockieren von Kügelchen und den Stringenzbedingungen.
- Muss die Variabilität der RNA-Fragmentierungseffizienz und der Zugänglichkeit von Modifikationen zwischen verschiedenen Probenarten berücksichtigen.
- Ist ohne ergänzende Methoden auf die Kartierung von Modifikationen beschränkt und nicht auf Einzelnukleotid-Auflösung anwendbar.
