Längsschnitt in Vivo Bildgebung und Quantifizierung der menschlichen Pankreas-Islet-Grafting- und Beitragenden Wirtszellen in der Vorderen Augenkammer

Ziel dieses Protokolls ist es, die Dynamik des menschlichen Pankreas-Islet-Entransplantierungsprozesses und des beitragenden Wirts- und Spenderzellen kontinuierlich zu überwachen. Dies wird durch die Transplantation menschlicher Inselchen in die vordere Augenkammer (ACE) eines NOD erreicht. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-Mausempfänger gefolgt von wiederholter 2-Photonen-Bildgebung.

Der ACE ist eine optimale Bildgebung. Es unterstützt, es in der langfristigen In-vivo-Bildgebung von Isletzellen zu wiederholen, um ihre Funktion und Lebensfähigkeit in einer Transplantationssituation zu untersuchen. Es kann auch erweitert werden, um andere Aspekte unter physiologischen und pathologischen Bedingungen in Echtzeit zu untersuchen.

Der Vorteil der ACE-Technik liegt darin, dass die gleichen einzelnen menschlichen Pankreasinseln über einen längeren Zeitraum nicht invasiv mit subzellulärer Auflösung verfolgt werden können. Die Erfolgsraten der Beta-Zellersatztherapie verbessern sich weiter. Die Bewertung der Effizienz der Islettransplantation und des Überlebens in vivo bleibt jedoch eine Herausforderung.

Diese Methode könnte helfen, die Ergebnisse von Letentransplantationen zu bewerten und zu optimieren. Dieser Ansatz ist nicht nur auf Pankreasinseln beschränkt. Es ist auch gut geeignet, um betroffene Gewebe zu untersuchen.

Zum Beispiel bei diabetischen Komplikationen, wie Nierenglomeruli oder Leberstücken, um nur einige zu nennen. Um die Maus auf ein warmes Heizkissen zu stellen, positionieren Sie sie im Kopfhalter und setzen Sie sie auf die Nasenmaske. Verwenden Sie Daumen und Zeigefinger, um den Kopf leicht zu heben.

Befestigen Sie es mit den Metallteilen an den Seiten. Stellen Sie sicher, dass die Ohrstücke den Kopf direkt unter den Ohren fixieren. Subkutane Buprenorphin-Lösung in den Rücken der Maus injizieren.

Ziehen Sie vorsichtig die Augenlider des Auges zurück, um mit stumpfer Zange transplantiert zu werden. Das Auge herausstecken und locker mit einer Pinzette fixieren, die mit einem Polythenrohr bedeckt ist. Nach der Übertragung der Augenlider auf eine Petrischale mit PBS, nehmen Sie etwa 20 bis 30 Inselchen in den Augenkantoular.

Mit einem 25-Grad-Nadelstand nach oben, legen Sie die Spitze vorsichtig in die Hornhaut und machen Sie einen einzigen seitlichen Schnitt. Heben Sie die Hornhaut vorsichtig mit der mit Inselchen vorinstallierten Kanüle an und geben Sie die Inselchen langsam ins Auge. Ziehen Sie die Kanüle langsam zurück und tragen Sie Augengel auf das Auge auf.

Nach 10 Minuten entfernen Sie die Zange, halten Sie das Augenlid und setzen Sie das Auge wieder in seine normale Position. Zur Abbildung von implantierten menschlichen Inselchen mit zwei Photonenmikroskopie die Kopfhalterplattform unter das Mikroskop stellen und Augengel als Tauchflüssigkeit zwischen Hornhaut und Linse auf das Auge verabreichen. Positionieren Sie das Auge unter dem Objektiv und bildnisieren Sie die implantierten menschlichen Inselchen, wie im Textmanuskript beschrieben.

Um die Autofluoreszenz zu entfernen, gehen Sie zur Registerkarte Bildverarbeitung, wählen Sie Kanalarithmetik und geben Sie Kanal einminus Kanal zwei ein. Dadurch wird ein neuer Kanal vier erstellt. Benennen Sie es vasculature um.

Wiederholen Sie diesen Vorgang und geben Sie Kanal drei minus Kanal zwei ein, um einen neuen Kanal fünf zu erstellen und ihn alle Tomate umzubenennen. Um die Fläche zu definieren, erstellen Sie manuell eine neue Oberfläche, und wählen Sie manuell bearbeiten im Assistenten aus. Halten Sie den Zeiger im Auswahlmodus und in der 3D-Ansicht.

Klicken Sie auf Lautstärke, um Abschnitte zu visualisieren. Wählen Sie auf der Registerkarte Zeichnung Kontur aus, und klicken Sie auf Zeichnen, um konturen um den Rahmen der kleinen Einzelze zu zeichnen, beginnend mit Segmentposition 1. Wechseln Sie dann zu einer neuen Slice-Position, und wiederholen Sie Zeichnungskonturen.

Beenden Sie das Segment mit dem letzten Slice oben auf der Kleinen und dem Ende, indem Sie auf die Registerkarte Oberfläche erstellen klicken. Nächstes Segment, Islet Vaskulatur und Islet Tomatenfluoreszenz mit Islet Maske. Wählen Sie das zuvor definierte Islet-Maskenobjekt aus, wechseln Sie zur Registerkarte Bearbeiten und klicken Sie auf die Registerkarte Maske alle, die ein neues Fenster öffnet.

Wählen Sie den Vaskulaturkanal im Dropdown-Menü der Kanalauswahl aus und aktivieren Sie den doppelten Kanal der Optionen, bevor Sie die Maske anwenden. Konstante innen, außen und setzen Voxel Außenfläche auf 0.000, die einen neuen Kanal sechs schafft. Benennen Sie diese Kanalinsel Vaskulatur um.

Wiederholen Sie die vorherigen Schritte und wählen Sie die Tomate alle im Dropdown-Menü der Kanalauswahl aus, um den neuen Kanal zu erstellen, ihn umzubenennen, Inseltomate. Erstellen Sie dann eine neue Oberfläche im Szenenmenü, und wählen Sie im Assistenten die automatische Erstellung aus. Legen Sie den Quellkanal auf die zuvor erstellte Inselvaskulatur fest, und wählen Sie die Hintergrundsubtraktion aus.

Optional Filter verwenden. Wählen Sie z. B. Volume aus, und passen Sie den Filter im Fenster an, wodurch ausgewählte Serviceobjekte entfernt werden können. Beenden Sie den Assistenten, und benennen Sie das neue Oberflächenobjekt, die Fläche Vaskulatur.

Gehen Sie im Islet Vaskulature-Serviceobjekt zur Registerkarte Bearbeiten und klicken Sie auf die Registerkarte "Maske alle", die ein neues Fenster öffnet. Wählen Sie den Inseltomatenkanal im Dropdown-Menü der Kanalauswahl aus und stellen Sie die Voxel außerhalb der Oberfläche auf 10.000 ein, wodurch ein neuer Kanal entsteht. Benennen Sie diese Kanal Insel Tomaten Vaskulatur um.

Um Tomatenkapsel-Fluoreszenzsignal zu segmentieren, wählen Sie Kanalarithmetik in der Registerkarte Bildverarbeitung und geben Sie Kanal sieben minus Kanal acht ein, um den neuen Kanal zu erstellen. Benennen Sie es Tomatenkapsel um. Erstellen Sie eine neue Oberfläche, wie zuvor beschrieben, und wählen Sie Quellkanäle, Islet Tomatenvaskulatur oder Tomatenkapsel im Assistenten.

Führen Sie dann eine Hintergrundsubtraktion durch. Öffnen Sie die Rückstreudatei der Islet, und erstellen Sie eine neue Oberfläche. Wählen Sie im Assistenten die automatische Erstellung aus, und definieren Sie den Interessenbereich.

Passen Sie bei Bedarf den Schwellenwert in absoluter Intensität an. Das Oberflächenobjekt kann angeklickt oder deaktiviert werden, um es mit der entsprechenden Kanalintensität abzuhaken. Schließen Sie nach Abschluss des Assistenten.

Führen Sie schließlich die Quantifizierung durch, wählen Sie ein erstelltes Oberflächenobjekt im Szenenmenü aus, und wechseln Sie zur Registerkarte Statistik. Um detaillierte Volumendaten abzurufen, wählen Sie die detaillierte Registerkarte aus und wählen Sie bestimmte Werte und Volumen aus dem Dropdown-Menü aus. Um den Gesamtvolumenwert abzurufen, wechseln Sie zur detaillierten Registerkarte, und wählen Sie Durchschnittswerte aus.

Dieses Protokoll wurde verwendet, um nicht gekennzeichnete menschliche Inselchen in die innere Kammer des Auges von acht Wochen alten weiblichen roten fluoreszierenden Empfängermäusen zu transplantieren. Interaktive Bildgebungssoftware wurde dann verwendet, um quantitative Daten aus den Bildern zu extrahieren. In vivo fluoreszens Bildgebung, die menschlichen Islet Transplantate wurde durch erhebliche Interferenzen von Gewebe-Autofluoreszenz, die nicht bei Mäuse-Islet-Transplantate beobachtet wurde kompromittiert.

Um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, wurde der Autofluoreszenzkanal subtrahiert. Dann wurden die Islet-Grenze namens Islet-Maske und die entsprechenden Kanäle manuell definiert. Schließlich wurde die Segmentierung des Tomatensignals in die Augenlidvaskulatur und Die Augenlidkapsel und die endgültige Oberflächenwiedergabe verwendet, um quantitative Daten zu extrahieren.

Hier als repräsentative Längsbildgebungssitzung des gleichen menschlichen Islettransplantats nach zwei Wochen, zwei Monaten, fünf Monaten und acht Monaten nach der Transplantation. MIP-Bilder von ursprünglich aufgezeichneten Rohdaten, verarbeitete Bilder nach der automatischen Fluoreszenzentfernung der Islet und eine segmentierte Islet-Objekte werden angezeigt. Achten Sie bei der Einführung der Augenlidinjektion darauf, die Inselchen in einem kleinen Volumen vorzuladen und verwenden Sie flexible Doppellichtarme auf Ihrem Stereomikroskop, um den Augenkammerraum hervorzuheben, um die Inselchen erfolgreich in den ACE zu injizieren.

Nach der In-vivo-Bildgebung können die Augen fixiert und weiter auf Antikörperfärbung und konventionelle Histologie untersucht werden. Diese Technik ist sehr nützlich für funktionelle Studien einzelner menschlicher Inseln in Echtzeit und unter physiologischen Bedingungen, insbesondere im Rahmen von Vaskularisations-, Lebensfähigkeits- und Stoffwechselstudien.