Paralleler Hochdurchsatz-Single Molecule Kinetic Assay für standortspezifische DNA-Spaltung
6. Mai 2020
Beschrieben wird eine hochparallele Methode zur Messung der standortspezifischen DNA-Spaltung auf einzelmolekülebene. Dieses Protokoll demonstriert die Technik mithilfe der Einschränkung endonuklease NdeI. Die Methode kann leicht modifiziert werden, um jeden Prozess zu untersuchen, der zu einer standortspezifischen DNA-Spaltung führt.
Dieses Protokoll kann auf jeden Prozess angewendet werden, der zu doppelsträngigen DNA-Brüchen führt und detaillierte quantitative Daten zur Kinetik liefert. Obwohl diese Methode eine Einzelmolekülauflösung hat, misst sie bis zu 1000 DNAs in einem einzigen Experiment und liefert somit gute Statistiken. Die primäre Anwendung dieser Methode besteht darin, die Mechanismen der DNA-Bindung und -Modifikation zu untersuchen.
Wir sind beispielsweise daran interessiert, die DNA-Zielsuche zu untersuchen, die für alle DNA-bindenden Proteine relevant ist. Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal versuchen, denken Sie daran, dass einzelne Molekül-Tether empfindlich sind, und einmal Form, muss mit Sorgfalt behandelt werden. Der richtige Anteil funktionalisierter Oberflächen ist unerlässlich.
Es gibt ein paar Tricks, um den Fluss so zu machen. Neben dem Wechseln von Probenröhren während der Datenerfassung kann eine visuelle Demonstration jemandem helfen, der mit diesem Verfahren noch nicht so gut zu ende ist. Um die Deckelschlüpfer zu waschen, legen Sie sie in Färbegefäße und beschallen Sie sie 30 Minuten lang mit Ethanol.
Spülen Sie sie gründlich mit entionisiertem und destilliertem Wasser ab, tauchen Sie sie dann in ein Molkaliumhydroxid ein und beschallen Sie sie noch 30 Minuten. Wiederholen Sie die Waschsequenz, und stellen Sie sicher, dass die Abdeckungsrutschen nach jeder Wäsche mit Wasser abspülen. Bewahren Sie die gereinigten Deckelschlupfins in Färbegefäßen mit Wasser auf.
Verwenden Sie ein sauberes Rasiermesser, um acht Zentimeter lange Lade- und Austrittsrohre zu schneiden und in Löcher in einem sauberen Glasschlitten einzufügen. Epoxy die Schläuche und lassen Sie für fünf Minuten zu heilen, um es zu sichern. Doppelseitiges Klebeband mit dem Kanalmuster auf die Glasschlitten vorgeschnitten auftragen und mit Kunststoffzangen glätten, um eine gute Dichtung zu erreichen.
Ziehen Sie die Ablage vom Band, und tragen Sie einen sauberen Deckelschlupf auf, um ihn mit der Zange zu glätten. Dann, Epoxid die Kante der Abdeckung rutschen, um die Durchflusszelle zu versiegeln und lassen Sie es aushärten. Bereiten Sie die beschriftete DNA für das Tethering vor, indem Sie PCR gemäß Manuskriptanweisungen durchführen.
Reinigen Sie dann das PCR-Produkt mit einem PCR-Reinigungskit. Bereiten Sie 10 Milliliter Puffer A vor und entgasen Sie ihn in einem Vakuum-Austrocknungsor für mindestens eine Stunde. Um die Durchflusszelle zu funktionalisieren, injizieren Sie 25 Mikroliter Anti-Digoxigenin und Fab-Fragmente in PBS, in den Durchflusskanal, mit einer Gel-Ladespitze, um in die PE60-Schläuche zu passen.
Inkubieren Sie die Durchflusszelle bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Ziehen Sie nach der Inkubation 0,5 Milliliter Puffer A mit einer Spritze durch den Kanal, wobei Darauf geachtet wird, keine Luft in den Kanal zu bringen. Dann bergen Sie die Strömungszelle auf einem invertierten Mikroskop.
Schließen Sie das Auslassrohr an eine Spritzenpumpe an und legen Sie das Einlassrohr in ein Mikrozentrifugenrohr mit Puffer A. Ziehen Sie manuell mindestens 0,5 Milliliter Puffer A, um das System zu spülen und die Pumpe zu grundieren. Dann lassen Sie die Pumpe mit 10 Mikroliter pro Minute für mindestens fünf Minuten laufen, um das System zu ausdemadien. Wirbel die Stockflasche Perlen, und Pipette 1,6 Mikroliter der Perlen in 50 Mikroliter Puffer A, dann Wirbel sie wieder.
Legen Sie die Perlen auf einen magnetischen Separator und Pipette aus dem Puffer. Sie in 50 Mikroliter Puffer A wieder aussetzen und wirbeln. Nach der letzten Wäsche die Perlen in 100 Mikroliter Puffer A für eine Endkonzentration von 160 Mikrogramm pro Milliliter wieder aufhängen.
Bereiten Sie 480 Mikroliter 0,5 Picomolar beschriftetES DNA-Substrat in Puffer A und Pipette 20 Mikroliter Perlensuspension in die verdünnte DNA vor. Legen Sie die Mischung drei Minuten lang auf einen Rotator. Nach den drei Minuten die Probe sofort mit einer Durchflussrate von 10 Mikrolitern pro Minute für 15 Minuten in den Kanal laden, oder bis genügend Perlenanriss beobachtet wird.
Waschen Sie den Kanal aller freien Perlen, indem Sie das Einlassrohr auf ein frisches Rohr von Puffer A umschalten und mit 50 Mikroliterpro Minute mindestens 10 Minuten einfließen lassen oder bis keine losen Perlen beobachtet werden. Und es ist hilfreich, ein Inline-Ventil zu verwenden, um den Durchfluss abzuschneiden und die Schläuche zu schalten. Schalten Sie Schläuche in einer sanften Bewegung und stellen Sie sicher, dass Flüssigkeitsgehalte in neuen und alten Probenröhrchen passen, um Rückfluss zu vermeiden.
Vor dem Sammeln von Daten, bereiten Sie die richtige Konzentration des DNA-Spaltungsenzyms vor, und legen Sie das Einlassrohr in die Probe ein. Senken Sie den Magneten über der Durchflusszelle. Stellen Sie die Pumpe so ein, dass 80 Mikroliter Probe auf 150 Mikroliter pro Minute injiziert werden, und beginnen Sie mit der Datenerfassung.
Eine Minute nach der Datenerfassung, aktivieren Sie die Pumpe. Hier ist ein repräsentatives Bild der gefesselten Perlen vor und nach der Reaktion zu sehen. Die Datenanalyse wurde durchgeführt, um die Anzahl der Perlen zu quantifizieren, die während der Spaltungsreaktion noch gebunden sind.
Diese Technik wurde verwendet, um die standortspezifischen DNA-Spaltungsraten von Nde1 für Proteinkonzentrationen zwischen 0,25 und vier Einheiten pro Milliliter und zwei verschiedene Magnesiumkonzentrationen zu messen. Jede Bedingung wurde mindestens zweimal repliziert, mit ein paar 100 bis 1000 gebundene DNA ist pro Experiment. Bei ausreichend niedrigen Proteinkonzentrationen ist die Rate proportional zu Protein und unabhängig von Magnesium.
Bei hohen Proteinkonzentrationen ist die Rate von Magnesium abhängig, aber unabhängig von der Proteinkonzentration. Beachten Sie beim Versuch dieses Protokolls, dass Luftblasen im Schlauch- und Durchflusskanal das Experiment ausführen können. Achten Sie darauf, keine Luft in die Leitungen zu lassen, während Sie den Schlauch wechseln, und entgasen Sie alle Puffer, bevor Sie sie verwenden.
Die Tethering-Methode ermöglicht es, die Wirkung von Spannung in der DNA auf die Reaktion zu untersuchen. Dies kann erreicht werden, indem die Magnetstärke variiert oder der Durchfluss während der Datenerfassung angewendet wird.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Diese Studie stellt eine hochparallelisierte Methode zur Analyse positionsabhängiger DNA-Spaltung auf Einzelmolekülebene vor, mit Fokus auf die Restriktionsendonuklease NdeI. Das Protokoll ist anpassbar für verschiedene Prozesse, die zu DNA-Strangbrüchen führen, und zeigt eine hohe statistische Robustheit, indem bis zu 1000 DNA-Moleküle in einem einzigen Experiment analysiert werden.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Molekularbiologie
- DNA-Bindungsmechanismen
- Einzel-Molekül-Analyse
Hintergrund
- Bedeutung des Verständnisses von DNA-Bindungs- und Modifikationsprozessen
- Relevanz für DNA-bindende Proteine
- Herausforderungen beim Umgang mit Einzelmolekül-Verankerungen
Verwendete Methoden
- Messung mit Einzelmolekülauflösung
- Experimenteller Aufbau mit funktionalisierten Oberflächen und PCR
- Datenerfassung und -analyse mittels Durchflusszelle und bildgebender Verfahren
Hauptergebnisse
- Quantitative Daten zu DNA-Spaltungsraten bei variierenden Protein- und Magnesiumkonzentrationen
- Einfluss von Zugspannung auf DNA-Spaltungsreaktionen
- Deutliche Beziehung zwischen ProteinKonzentration und Reaktionsgeschwindigkeiten unter verschiedenen Bedingungen
Schlussfolgerungen
- Diese Technik ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der Dynamik von DNA-Wechselwirkungen
- Bietet bedeutende Einblicke in die enzymatische Aktivität und ihre biologischen Implikationen
Häufig gestellte Fragen
Exekutive Branchenrelevanz
Methoden zur kinetischen Einzelmolekül-Analyse mit hohem Durchsatz für die standortspezifische DNA-Spaltung ermöglichen die quantitative Untersuchung von DNA-Protein-Wechselwirkungen, die für die Genom-Editierung und die Aufklärung molekularer Mechanismen entscheidend sind. Dieser Ansatz liefert statistisch aussagekräftige kinetische Daten an hunderten bis tausenden von Molekülen und unterstützt so eine verlässliche Vorhersage in der frühen Entdeckungsphase sowie die Absicherung mechanistischer Risiken. Aufgrund ihrer Skalierbarkeit und quantitativen Ausgabeergebnisse eignet sich die Methode als wiederverwendbare Plattform für die Zielvalidierung und die Entwicklung von Assays in biopharmazeutischen Forschungs- und Entwicklungsportfolios.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht eine detaillierte kinetische Analyse von DNA-Bindungs- und -Spaltmechanismen auf Einzelmolekülebene.
- Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung durch Quantifizierung der Enzymaktivität unter verschiedenen Bedingungen.
- Erleichtert die mechanistische Ent风险bewertung, indem Abhängigkeiten von Cofaktoren und Proteinkonzentrationen aufgedeckt werden.
- Liefert robuste statistische Daten für eine hypothesengetriebene Portfolio-Priorisierung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte, quantitative Einzelmolekül-Systeme für nachgeschaltete Screening-Workflows vor.
- Liefert reproduzierbare, informationsreiche kinetische Daten, die für die Assay-Standardisierung geeignet sind.
- Ermöglicht die parallele Analyse von bis zu 1.000 Molekülen und unterstützt damit Skalierbarkeit und Plattformwiederverwendung.
- Erhöht die Zuverlässigkeit der Evaluierung von Verbindungen oder Enzymen, indem die Variabilität des Systems minimiert wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt mechanistische Befunde gegebenenfalls mit krankheitsrelevanten DNA-Modifikationsprozessen.
- Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem quantitative mechanistische Referenzgrößen bereitgestellt werden.
- Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung auf der Grundlage robuster kinetischer Daten.
- Bietet eine prädiktive Entschärfung von Risiken für translationsorientierte Biomarkerstrategien, die DNA-Schneidevorgänge beinhalten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieser kinetische Test integriert sich in den Entdeckungsprozess von frühen mechanistischen Studien über die Testentwicklung bis hin zur präklinischen Forschung und unterstützt die Identifizierung von Leitverbindungen und die Zielvalidierung.
- Entdeckungsbiochemie: Quantifiziert die Kinetik des DNA-Schnitts, um die Mechanismen von Signalwegen aufzuklären und Zielstrukturen zu validieren.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Ergebnisse zur Beurteilung der Assaytauglichkeit und zur Evaluierung von Verbindungen.
- Analytik: Ermöglicht den statistischen Vergleich von Reaktionsgeschwindigkeiten unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet mechanistische Erkenntnisse mit präklinischen Modellen, wenn die DNA-Spaltung für eine Erkrankung relevant ist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als skalierbare und anpassungsfähige Plattform für vielfältige Untersuchungen von DNA-Protein-Interaktionen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten in Studien zur DNA-Spaltung.
- Operationaler Wert: Standardisiert kinetische Einzelmolekül-Messungen hinsichtlich Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen und verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem bereits früh robuste kinetische Daten bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Fördert die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Gen-Editierungs- und DNA-zielgerichteten Programmen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Einzelmolekül-Biophysik und im Aufbau mikrofluidischer Assays.
- Setzt Zugang zu Videomikroskopie, Durchflusszellen-Apparaturen und Werkzeugen zur quantitativen Bildanalyse voraus.
- Erfordert eine strikte, übergreifende Standardisierung der Probenvorbereitung und der Datenanalyseprotokolle zwischen den Teams.
- Die Anpassung an verschiedene DNA-Substrate oder Enzyme kann eine Optimierung der Protokolle erfordern.
- Sorgfältiges Umgang mit empfindlichen Verankerungen und die Vermeidung von Luftblasen sind entscheidend für den experimentellen Erfolg.
