Paralleler Hochdurchsatz-Single Molecule Kinetic Assay für standortspezifische DNA-Spaltung

Dieses Protokoll kann auf jeden Prozess angewendet werden, der zu doppelsträngigen DNA-Brüchen führt und detaillierte quantitative Daten zur Kinetik liefert. Obwohl diese Methode eine Einzelmolekülauflösung hat, misst sie bis zu 1000 DNAs in einem einzigen Experiment und liefert somit gute Statistiken. Die primäre Anwendung dieser Methode besteht darin, die Mechanismen der DNA-Bindung und -Modifikation zu untersuchen.

Wir sind beispielsweise daran interessiert, die DNA-Zielsuche zu untersuchen, die für alle DNA-bindenden Proteine relevant ist. Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal versuchen, denken Sie daran, dass einzelne Molekül-Tether empfindlich sind, und einmal Form, muss mit Sorgfalt behandelt werden. Der richtige Anteil funktionalisierter Oberflächen ist unerlässlich.

Es gibt ein paar Tricks, um den Fluss so zu machen. Neben dem Wechseln von Probenröhren während der Datenerfassung kann eine visuelle Demonstration jemandem helfen, der mit diesem Verfahren noch nicht so gut zu ende ist. Um die Deckelschlüpfer zu waschen, legen Sie sie in Färbegefäße und beschallen Sie sie 30 Minuten lang mit Ethanol.

Spülen Sie sie gründlich mit entionisiertem und destilliertem Wasser ab, tauchen Sie sie dann in ein Molkaliumhydroxid ein und beschallen Sie sie noch 30 Minuten. Wiederholen Sie die Waschsequenz, und stellen Sie sicher, dass die Abdeckungsrutschen nach jeder Wäsche mit Wasser abspülen. Bewahren Sie die gereinigten Deckelschlupfins in Färbegefäßen mit Wasser auf.

Verwenden Sie ein sauberes Rasiermesser, um acht Zentimeter lange Lade- und Austrittsrohre zu schneiden und in Löcher in einem sauberen Glasschlitten einzufügen. Epoxy die Schläuche und lassen Sie für fünf Minuten zu heilen, um es zu sichern. Doppelseitiges Klebeband mit dem Kanalmuster auf die Glasschlitten vorgeschnitten auftragen und mit Kunststoffzangen glätten, um eine gute Dichtung zu erreichen.

Ziehen Sie die Ablage vom Band, und tragen Sie einen sauberen Deckelschlupf auf, um ihn mit der Zange zu glätten. Dann, Epoxid die Kante der Abdeckung rutschen, um die Durchflusszelle zu versiegeln und lassen Sie es aushärten. Bereiten Sie die beschriftete DNA für das Tethering vor, indem Sie PCR gemäß Manuskriptanweisungen durchführen.

Reinigen Sie dann das PCR-Produkt mit einem PCR-Reinigungskit. Bereiten Sie 10 Milliliter Puffer A vor und entgasen Sie ihn in einem Vakuum-Austrocknungsor für mindestens eine Stunde. Um die Durchflusszelle zu funktionalisieren, injizieren Sie 25 Mikroliter Anti-Digoxigenin und Fab-Fragmente in PBS, in den Durchflusskanal, mit einer Gel-Ladespitze, um in die PE60-Schläuche zu passen.

Inkubieren Sie die Durchflusszelle bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Ziehen Sie nach der Inkubation 0,5 Milliliter Puffer A mit einer Spritze durch den Kanal, wobei Darauf geachtet wird, keine Luft in den Kanal zu bringen. Dann bergen Sie die Strömungszelle auf einem invertierten Mikroskop.

Schließen Sie das Auslassrohr an eine Spritzenpumpe an und legen Sie das Einlassrohr in ein Mikrozentrifugenrohr mit Puffer A. Ziehen Sie manuell mindestens 0,5 Milliliter Puffer A, um das System zu spülen und die Pumpe zu grundieren. Dann lassen Sie die Pumpe mit 10 Mikroliter pro Minute für mindestens fünf Minuten laufen, um das System zu ausdemadien. Wirbel die Stockflasche Perlen, und Pipette 1,6 Mikroliter der Perlen in 50 Mikroliter Puffer A, dann Wirbel sie wieder.

Legen Sie die Perlen auf einen magnetischen Separator und Pipette aus dem Puffer. Sie in 50 Mikroliter Puffer A wieder aussetzen und wirbeln. Nach der letzten Wäsche die Perlen in 100 Mikroliter Puffer A für eine Endkonzentration von 160 Mikrogramm pro Milliliter wieder aufhängen.

Bereiten Sie 480 Mikroliter 0,5 Picomolar beschriftetES DNA-Substrat in Puffer A und Pipette 20 Mikroliter Perlensuspension in die verdünnte DNA vor. Legen Sie die Mischung drei Minuten lang auf einen Rotator. Nach den drei Minuten die Probe sofort mit einer Durchflussrate von 10 Mikrolitern pro Minute für 15 Minuten in den Kanal laden, oder bis genügend Perlenanriss beobachtet wird.

Waschen Sie den Kanal aller freien Perlen, indem Sie das Einlassrohr auf ein frisches Rohr von Puffer A umschalten und mit 50 Mikroliterpro Minute mindestens 10 Minuten einfließen lassen oder bis keine losen Perlen beobachtet werden. Und es ist hilfreich, ein Inline-Ventil zu verwenden, um den Durchfluss abzuschneiden und die Schläuche zu schalten. Schalten Sie Schläuche in einer sanften Bewegung und stellen Sie sicher, dass Flüssigkeitsgehalte in neuen und alten Probenröhrchen passen, um Rückfluss zu vermeiden.

Vor dem Sammeln von Daten, bereiten Sie die richtige Konzentration des DNA-Spaltungsenzyms vor, und legen Sie das Einlassrohr in die Probe ein. Senken Sie den Magneten über der Durchflusszelle. Stellen Sie die Pumpe so ein, dass 80 Mikroliter Probe auf 150 Mikroliter pro Minute injiziert werden, und beginnen Sie mit der Datenerfassung.

Eine Minute nach der Datenerfassung, aktivieren Sie die Pumpe. Hier ist ein repräsentatives Bild der gefesselten Perlen vor und nach der Reaktion zu sehen. Die Datenanalyse wurde durchgeführt, um die Anzahl der Perlen zu quantifizieren, die während der Spaltungsreaktion noch gebunden sind.

Diese Technik wurde verwendet, um die standortspezifischen DNA-Spaltungsraten von Nde1 für Proteinkonzentrationen zwischen 0,25 und vier Einheiten pro Milliliter und zwei verschiedene Magnesiumkonzentrationen zu messen. Jede Bedingung wurde mindestens zweimal repliziert, mit ein paar 100 bis 1000 gebundene DNA ist pro Experiment. Bei ausreichend niedrigen Proteinkonzentrationen ist die Rate proportional zu Protein und unabhängig von Magnesium.

Bei hohen Proteinkonzentrationen ist die Rate von Magnesium abhängig, aber unabhängig von der Proteinkonzentration. Beachten Sie beim Versuch dieses Protokolls, dass Luftblasen im Schlauch- und Durchflusskanal das Experiment ausführen können. Achten Sie darauf, keine Luft in die Leitungen zu lassen, während Sie den Schlauch wechseln, und entgasen Sie alle Puffer, bevor Sie sie verwenden.

Die Tethering-Methode ermöglicht es, die Wirkung von Spannung in der DNA auf die Reaktion zu untersuchen. Dies kann erreicht werden, indem die Magnetstärke variiert oder der Durchfluss während der Datenerfassung angewendet wird.