Loop-vermittelte isotherme Amplifikation zum Screening von Salmonellen in Tierfutter und Bestätigung von Salmonellen aus der Kulturisolierung

Diese Salmonella LAMP-Methode wurde in das bakteriologische Analysehandbuch der FDA aufgenommen, sowohl als Screening-Methode in Tiernahrung als auch als Bestätigungsmethode für mutmaßliche Salmonellen-Isolate. Die Methode ist schnell, zuverlässig und robust. Zu den Hauptvorteilen im Vergleich zur PCR gehören schnelle Tests, einfache Instrumentierung, eine niedrige falsch-negative Rate und ein flexibler Arbeitsablauf.

Ein schnelles Screening auf Krankheitserreger wie Salmonellen spielt eine wichtige Rolle bei der schnellen Erkennung eines potenziell kontaminierten Produkts und kann Krankheiten oder Ausbrüche bei Mensch und Tier verhindern. Beginnen Sie mit der Vorbereitung von DNA-Vorlagen für den LAMP-Assay. Es gibt zwei Arten von Proben, die zur Herstellung von DNA-Vorlagen verwendet werden.

Zur Herstellung von Schablonen aus tierischen Lebensmittelproben werden 25 Gramm der Lebensmittelprobe aseptisch in einen sterilen Filterbeutel gewogen. Geben Sie 225 Milliliter steriles gepuffertes Peptonwasser in den Beutel und inkubieren Sie ihn 24 Stunden lang bei 35 Grad Celsius. Nach der Inkubation einen Milliliter von der gefilterten Seite des Beutels in ein Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen eine Minute lang bei 900 mal G. Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Die Probe wird zwei Minuten lang bei 16.000 G zentrifugiert.

Und um den Überstand zu entsorgen, resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern des Probenvorbereitungsreagenzes und erhitzen Sie es 10 Minuten lang bei 100 Grad Celsius in einem trockenen Heizblock. Kühlen Sie die Probe dann auf Raumtemperatur ab und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius. Die zweite Art von Probe für diesen LAMP-Assay stammt direkt aus mutmaßlichen Salmonellenkulturen.

Um DNA-Vorlagen herzustellen, geben Sie 500 Mikroliter einer Salmonellenkultur über Nacht in ein Mikrozentrifugenröhrchen und erhitzen Sie es in einem 100 Grad Celsius heißen Block für 10 Minuten. Kühlen Sie die Probe dann auf Raumtemperatur ab und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius. Um eine Kreuzkontamination zu vermeiden, trennen Sie die Bereiche, die für die Vorbereitung des LAMP-Mastermixes und die Zugabe der DNA-Templates verwendet werden.

Reinigen Sie die Arbeitsflächen mit Isopropanol und einer DNA und der Abbaulösung der DNA. Reinigen Sie dann die Pipetten und Röhrchenstreifenhalter. Tauen Sie den isothermen Master Mix, den 10X Primer Mix, das Wasser in molekularer Qualität, die Positivkontroll-DNA und die DNA-Templates bei Raumtemperatur auf.

Schalten Sie das LAMP-Gerät ein und geben Sie die relevanten Probeninformationen ein. Bereiten Sie den LAMP Master Mix nach handschriftlicher Anleitung zu, wirbeln und zentrifugieren Sie ihn kurz und verteilen Sie 23 Mikroliter des Master Mix in jede Vertiefung eines Röhrchenstreifens. Alle DNA-Templates vortexen und kurz zentrifugieren.

Geben Sie dann zwei Mikroliter DNA-Vorlage in die entsprechende Vertiefung und verschließen Sie die Vertiefung fest. Entfernen Sie den Tubenstreifen aus der Halterung und schnippen Sie ihn, um sicherzustellen, dass sich alle Reagenzien am Boden des Röhrchens angesammelt haben. Legen Sie den Röhrenstreifen in das LAMP-Instrument ein und starten Sie den LAMP-Lauf.

Tippen Sie während der LAMP-Reaktion auf die Registerkarten Temperatur, Verstärkung und Anneal, um die dynamischen Änderungen verschiedener Parameter während des LAMP-Laufs anzuzeigen. Die LAMP-Ergebnisse können in Echtzeit oder mit Hilfe der LAMP-Software auf der LAMP-Instrumententafel angezeigt werden. Um die Ergebnisse auf der Instrumententafel zu interpretieren, öffnen Sie die gewünschte LAMP-Strecke.

Beachten Sie die fünf Registerkarten, die jeder Ausführung zugeordnet sind. Auf den Registerkarten "Profil" und "Temperatur" werden die programmierten und tatsächlichen Temperaturen in den Probenvertiefungen angezeigt, während die LAMP-Reaktion fortschreitet. Die Registerkarten Amplifikation und Anneal zeigen Fluoreszenzmesswerte und Änderungen der Fluoreszenz während der Amplifikations- bzw. Annealphase an.

Die Registerkarte Ergebnisse zeigt die tabellarische Ansicht der LAMP-Ergebnisse, die gemäß den Anweisungen der Handschriften interpretiert werden können. Die zweite Möglichkeit, LAMP-Ergebnisse anzuzeigen, ist die Verwendung der LAMP-Software. Um die Ergebnisse mit der Software zu interpretieren, klicken Sie auf das Computersymbol im linken Bereich und navigieren Sie zum Dateispeicherort, um den gewünschten LAMP-Lauf zu laden.

Beachten Sie die sieben Registerkarten, die jedem Lauf zugeordnet sind. Auf den Registerkarten "Profil" und "Temperatur" werden die programmierten und tatsächlichen Temperaturen in den Probenvertiefungen angezeigt, während die LAMP-Reaktion fortschreitet. Auf den Registerkarten "Amplifikation" und "Amplifikationsrate" werden Fluoreszenzmesswerte und Änderungen der Fluoreszenz während der Amplifikationsphase angezeigt.

Die Registerkarten "Anneal" und "Annealderivat" zeigen Fluoreszenzmesswerte und Änderungen der Fluoreszenz während der Annealphase an. Auf der Registerkarte Ergebnisse wird eine tabellarische Ansicht der LAMP-Ergebnisse angezeigt. Es gibt vier Spalten mit den Titeln "Graph Name", "Well Number", "Well Name" und "Peak Value".

Die Ampere-Zeit- und Anneal-Ableitungen aller acht Samples werden angezeigt. Die Ergebnisse können gemäß den Anweisungen des Manuskripts interpretiert werden. Die LAMP-Instrumententafel und die LAMP-Software können verwendet werden, um die Ergebnisse des Assays anzuzeigen.

In diesem LAMP-Lauf sind die Proben S1 bis S6 zehnfache serielle Verdünnungen des Salmonella enterica serovar Infantis ATCC 51741, die zwischen 1,1 Millionen und 11 koloniebildenden Einheiten pro Reaktion liegen. Die Positivkontrolle oder PC ist Salmonella enterica Serovar Typhimurium LT2 mit 17.000 koloniebildenden Einheiten pro Reaktion, und die No-Template-Kontrolle (NTC) ist Wasser in molekularer Qualität. Die NTC-Vertiefung hat eine leere Tmax und eine aneale Temperatur von ca. 81 Grad Celsius auf der LAMP-Instrumententafel sowie eine leere Tmax und eine leere Anneal-Temperatur in der LAMP-Software.

Die Positivkontrollvertiefung hat eine Tmax von sieben Minuten und 45 Sekunden und eine Glühtemperatur von etwa 90 Grad Celsius auf beiden Plattformen. Die Proben S1 bis S6 weisen eine Tmax zwischen sechs Minuten und 30 Sekunden sowie 12 Minuten und 15 Sekunden und eine Glühtemperatur von etwa 90 Grad Celsius auf, was auf eine positive Detektion hinweist. LAMP ist sehr effektiv und erzeugt eine große Menge an DNA.

Daher ist es von entscheidender Bedeutung, dass die besten Laborpraktiken angewendet werden, um Kreuzkontaminationen zu verhindern. Wenden Sie bei der Herstellung Ihrer DNA-Vorlagen ähnliche Verfahren an, da Anreicherungen aus kontaminiertem Tierfutter einen hohen Salmonellengehalt aufweisen können. Ein positives LAMP-Screening von Proben aus tierischen Lebensmitteln sollte durch Kulturisolierung gemäß den Verfahren im bakteriologischen Analysehandbuch der FDA bestätigt werden.

Negative Proben können als solche gemeldet werden. Die Aufnahme dieser LAMP-Methode in das bakteriologische Analysehandbuch der FDA ebnet den Weg für eine breitere Anwendung dieser schnellen, robusten und benutzerfreundlichen Technologie in der Lebensmittelsicherheitsprüfung.