Proteinextrakt-Präparation und Co-Immunpräzipitation von Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll bietet ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für die Probenentnahme, Extraktvorbereitung und Immunpräzipitation zur Bestätigung eines erfolgreichen Protein-Pulldowns und zum Nachweis von co-immunpräzipitierten Proteinen von Interesse. Die Proteinextrakt-Aufbereitung kann für bis zu 24 Proben durchgeführt werden und ist mit einer Reihe von Downstream-Anwendungen kompatibel, einschließlich Immunpräzipitation und RNA-Pull-Down-Experimenten. Diese Methode kann angepasst werden, um die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen zwei oder mehr endogenen, endogen markierten oder überexprimierten C.elegans-Proteinen in einer Vielzahl von genetischen Hintergründen zu erleichtern.

visuelle Demonstration dieses Protokolls soll den Forschern die Vorbereitung von Proteinextrakten und die Immunpräzipitation erleichtern und hoffentlich diejenigen ermutigen, die neu in den Techniken sind, sie in ihrer Forschung zu verwenden. Um eine Wurmprobe zu entnehmen, säen Sie zuerst gemischte oder synchronisierte Würmer auf festen Nematodenwachstumsmediumplatten bei der erforderlichen Temperatur aus und lassen Sie die Würmer bis zum gewünschten Stadium wachsen. Am Ende der Inkubation die Würmer mit M9-Puffer in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen waschen und die Würmer durch Zentrifugation pelletieren.

Am Ende der Zentrifugation wird der Überstand entfernt und die Würmer pro Waschgang weitere drei bis fünf Mal in frischem M9-Puffer gewaschen. Wenn der Überstand nicht mehr trüb ist, führen Sie eine letzte Wäsche mit doppelt destilliertem Wasser durch und geben Sie das lose Wurmpellet in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Pelletieren Sie die Würmer mit einer zusätzlichen Zentrifugation und entsorgen Sie den restlichen Überstand, um ein gepacktes Wurmpellet zu erhalten.

Um einen Extrakt aus dem gesammelten Wurmpellet herzustellen, fügen Sie einem empfohlenen Pellet mit einem Volumen von 300 Mikrolitern ein gleiches Volumen eiskalten 2X-Lysepuffer hinzu und mischen Sie die resultierende Suspension kräftig. Schleudern Sie die Probe herunter, um die Mischung am Boden des Röhrchens zu sammeln, und geben Sie den Röhrcheninhalt in ein 1,5-Milliliter-RNAse-freies Röhrchen mit Metallkügelchen. Nachdem Sie das Röhrchen fest verschlossen haben, geben Sie die Probe bei vier Grad Celsius in einen Kugelmühlen-Homogenisator und achten Sie darauf, dass die Probe im Homogenisator ausbalanciert ist.

Homogenisieren Sie die Probe vier Minuten lang bei höchster Geschwindigkeit, bevor Sie die Probe in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen ohne Beads überführen. Schleudern Sie die Probe herunter, um den Proteinextrakt zu klären, und übertragen Sie den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis, ohne den weißen, trüben Niederschlag an der Oberseite der Probe zu übertragen. Legen Sie 10 Mikroliter des geklärten Extrakts beiseite, um die Gesamtproteinkonzentration gemäß den Standardprotokollen zu bestimmen, und verdünnen Sie die Probe sofort auf fünf oder 10 Milligramm Protein pro Milliliter eiskaltem 1X-Lysepuffer auf Eis.

Für die Immunpräzipitation des interessierenden Proteins resuspendieren Sie zunächst die magnetischen Kügelchen durch Inversion und überführen Sie 150 Mikroliter der 50X-Bead-Suspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Magnetisieren Sie die Perlen auf Eis gegen einen Magnetständer für etwa eine Minute. Wenn die Lösung klar ist, den Überstand verwerfen.

Nehmen Sie das Röhrchen vom Magnetständer und waschen Sie die Kügelchen mit drei 300-Mikroliter-Volumina 1X Lysepuffer. Nach dem letzten Waschen resuspendieren Sie die Kügelchen in 150 Mikrolitern eiskaltem Lysepuffer und überführen Sie 75 Mikroliter der Kügelchenaufschlämmung auf zwei Milligramm der Proteinextraktprobe. Nach einer einstündigen Inkubation bei vier Grad Celsius unter leichtem Rühren legen Sie das Probenröhrchen im Magneten für etwa eine Minute auf Eis.

Wenn die Kügelchen vollständig magnetisiert sind und die Probe klar ist, wird der Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt, ohne die Kügelchen zu stören. Legen Sie 10 % der Probe für die Western-Blot-Analyse beiseite und geben Sie 20 Mikrogramm affinitätsgereinigten Antikörper für eine einstündige Inkubation bei vier Grad Celsius unter sanftem Rühren in das vorgeklärte Lysat. Am Ende der Inkubation geben Sie die restlichen 75 Mikroliter der vorgewaschenen Bead-Suspension in das Antikörperlysatgemisch für eine weitere einstündige Inkubation bei vier Grad Celsius unter leichtem Rühren.

Legen Sie die Probe am Ende der Inkubation für etwa eine Minute wieder auf den Magneten. Wenn die Kügelchen vollständig magnetisiert sind und die Probe klar ist, waschen Sie die Kügelchen mit dem Immunpräzipitat dreimal in 450 Mikrolitern Waschpuffer auf Eis. Nach dem letzten Waschen resuspendieren Sie das Bead-Pellet in 20 Mikrolitern 2X SDS Beta-Mercaptoethanol Protein Gel Loading Buffer und kochen Sie die Probe fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius.

Für den Nachweis der immunpräzipitierten Proteine durch Western-Blot-Analyse laden Sie die denaturierte Proteinprobe auf ein SDS-PAGE-Gel, ohne die Kügelchen zu übertragen, und führen Sie eine Western-Blot-Analyse gemäß Standardprotokollen mit den entsprechenden Antikörpern für die interessierenden Proteine durch, und weisen Sie dann die Banden mit Meerrettichperoxidase-basierter Chemilumineszenz nach. Das demonstrierte Beadmill-Homogenisator-Protokoll ist in der Gesamtproteinextraktion vergleichbar mit Dounce-basierten Methoden zur effizienten Extraktion von nuklearen und zytoplasmatischen Proteinen. In dieser Analyse wurde festgestellt, dass Argonaute-Proteine mit Mitgliedern der GW182-Proteinfamilie interagieren und die microRNA-induzierten Silencing-Komplexe bilden, die an die Ziel-Boten-RNAs binden und deren Expression unterdrücken.

Die demonstrierten Extrakt- und Immunpräzipitationsprotokolle können auch zur erfolgreichen Rückgewinnung von ALG-1- und HRPK-1-spezifischen Co-Immunpräzipitaten verwendet werden. Darüber hinaus ergab die Untersuchung der ALG-1:AIN-1-Interaktion in einer Vielzahl von genetischen Hintergründen, dass HRPK-1 für die ALG-1:AIN-1 microRNA-induzierte Silencing-Komplex-Assemblierung unnötig ist. Es ist darauf zu achten, dass die Proteinextraktion und die Immunpräzipitation bei vier Grad Celsius oder auf Eis durchgeführt werden, um die Stabilität der Proben zu erhalten.

Dieses Gesamtproteinextrakt-Präparat ist kompatibel mit Protein-Immunpräzipitations- und microRNA-Pull-Down-Experimenten, bei denen ein microRNA-komplementäres Oligonukleotid verwendet wird, und erleichtert die nachgelagerte Sammlung von Protein- und RNA-Komponenten.