Ein Drosophila-Modell zur Untersuchung der Wund-induzierten Polyploidisierung

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die wundinduzierte Polyploidisierung zu untersuchen. Ein konservierender Gewebereparaturprozess, bei dem Zellen wachsen, anstatt sich in der erwachsenen Fruchtfliege zu teilen. Eine einfache Punktionswunde kann innerhalb von nur zwei Tagen polyploidienimiert werden.

Epithelzellgröße, Ploidie und Organisation, kann dann leicht beurteilt werden. Beginnen Sie mit dem Sammeln von zwei Fläschchen, die 10 bis 15 neu geschlossene weibliche Fruchtfliegen des Stammes von Interesse enthalten. Und altern die Fliegen in frischen Lebensmittelfläschchen, mit etwa fünf männlichen Fliegen pro Durchstechflasche bei 25 Grad Celsius, bis drei bis fünf Tage alt.

Für Bauchwunden verwenden Sie am Ende der Inkubation einen einzigen 0,1-Millimeter-Edelstahlstift, um mehrere Stifthalter zu montieren, wobei das scharfe Ende jedes Stifts herausschreitet. Anästhetisieren Sie die gealterten weiblichen Fruchtfliegen auf einem Kohlendioxid-Fliegenpad unter einem Stereomikroskop. Und verwenden Sie einen Pinsel, um die Fliegen in einer Reihe zu arrangieren.

Tragen Sie eine Schutzbrille, mit einem Stifthalter in der einen Hand und Zangen in der anderen, verwenden Sie die Zange, um die Fliegen mit ihren ventralen Bauch nach oben zu positionieren. Dann punktieren Sie die erwachsenen Weibchenfliegen innerhalb der epithelialen blauen rechten Region des Ziels A4 auf beiden Seiten der ventralen Mittellinie rühren Nächte und bringen die verwundeten Fliegen in die Nahrungsdurchstechsons e. Klasse zurück, bis der gewünschte experimentelle Zeitpunkt nach der Verletzung. Prüfen Sie am experimentellen Endpunkt, ob Wunde und Narbe in jeder anästhesierten Fliege unter dem Stereomikroskop vorliegen, und füllen Sie einen Brunnen einer neun Brunnenglas-Sektionsschale mit Graces Lösung.

Greifen Sie mit einem Zangenpaar eine verwundete weibliche Fliege an der Rückenseite des Thorax und tauchen Sie die Fliege in den Brunnen der Lösung ein. Mit der anderen Hand, verwenden Sie ein zweites Paar Zange zu punktieren und entfernen Sie die dorsale Nagelhaut unter Ziel A6, auf der Rückseite der Fruchtfliege. Wenn die inneren Organe nicht extrahiert werden, drücken Sie auf die Rückenseite des Bauches, um die verbleibenden Organe herauszupressen.

Verwenden Sie die Zange, um den vollen Bauch an der Thorax-Kreuzung über Ziel A2 abzufangen und den Bauch auf einen Brunnen zu übertragen, der etwa 100 Mikroliter von Graces Lösung enthält. Wenn alle Bauchmuskeln gesammelt wurden, reduzieren Sie das Volumen von Graces Lösung in der Sammlung gut auf 30 Mikroliter. Verwenden Sie Zangen in der einen Hand, um die dorsale Seite des Bauches nach unten zu halten und verwenden Sie die andere Hand, um die untere Klinge der Venedig-Federschere in die Bauchhöhle jedes Bauches einzufügen und entlang der dorsalen Mittellinie zu schneiden, bis die Bauchmuskeln vollständig geöffnet sind.

Fügen Sie 30 Mikroliter Graces Lösung in jeden Montagebereich einer trockenen Sesektierungsplatte mit 4,1 Millimeter Stiften pro Bauchmontagebereich hinzu und legen Sie den filetierten Bauch in das Tröpfchen der Lösung. Wenn alle Bauchmuskeln filetiert und platziert sind, stecken Sie den Bauch an die Schale an den vier dorsalen Ecken. Achten Sie darauf, dass die Gewebe flach liegen, ohne das Bauchgewebe zu zerreißen oder zu überdehnen.

Dann ersetzen Sie die Grace-Lösung durch 30 Mikroliter eine fixative Lösung pro Montagebereich. Und legen Sie ein Band-Etikett auf der Unterseite jeder Schale, um jede Kontroll- und Experimentiergruppe zu markieren. Um die Fliegengewebeproben zu montieren.

Nach der Färbung verwenden Sie Zangen, um den Bauch von der Sezierenderplatte unter dem Stereomikroskop zu lösen. Und verwenden Sie Zangen, um jede Probe durch ihre Rückenflanke in ca. 30 Mikroliter Montagemedium auf einzelnen Glasabdeckungsrutschen zu übertragen. Unter dem Stereomikroskop orientieren Sie das Bauchgewebe so, dass die Innenseite nach unten zum Deckelschlupf und zange, um die orientierten Bauchmuskeln an den Rand jedes Medientröpfchens zu ziehen.

Legen Sie jeden montierten Deckelschlupf auf eine beschriftete Glasrutsche. Und verwenden Sie ein Laborgewebe, um überschüssiges Montagemedium zu entfernen. Dann versiegeln Sie die Ränder der Abdeckung mit klarem Nagellack und lagern Sie die Dias in der Diabox bei vier Grad Celsius bis zu ihrer Abbildung.

Das Septat-Knoten-Protein schnell drei, das Zellknoten bezeichnet, liefert einen Indikator dafür, ob während der Zubereitung Verarbeitungsstörungen aufgetreten sind. Abdomen mit großen Kratzern von unbeflecktem Bereich, die den Wundbereich stören, müssen verworfen und nicht in die Analyse einbezogen werden. Die Wundreparatur ist abgeschlossen, wenn eine zentrale große, mehrkernige Zelle den Wundschorf bedeckt.

Lücken von mehr als 10 Mikrometern auf dem Epithelblatt gelten als Defekte bei Wundverschluss und Reepithelisierung. In dieser repräsentativen Analyse mit Fliegen mit gehemmter mitotischer Zellaktivierung waren 52% der Wunden nicht in der Lage, ein kontinuierliches Epithelblatt über dem Wundschorf zu bilden. Dieser Membran-Wundheilungsaufsatz liefert mehr Informationen über das Ausmaß des Wundreparaturfehlers, so dass Reepithelisierungsdefekte entweder als vollständig offen, teilweise geschlossen oder vollständig geschlossen gruppiert werden können.

In diesem Experiment zum Beispiel führte die Hemmung der Wundinduzierten Polyploidisierung durch die gleichzeitige Blockierung von Endoreplikation und Zellfusion zu 92% der Epithelwunden, um völlig offen zu bleiben. Während die Aktivierung des mitotischen Zellzyklus zu einem epitheliaden Wundverschlussdefekt führte. Darüber hinaus wurde die Zellzyklusaktivität durch Einbeziehung des Thymidin-Analog-EDU nachgewiesen und die epitheliale Ploidie wurde durch direkte Messung des Kern-DNA-Gehalts bestimmt.

Beim Austeilen des Bauchepithels achten Sie darauf, das Gewebe nicht mit einem der Sezierenden Werkzeuge zu berühren, da dies die Probe kratzen wird. Nach der Zerlegung können Zellproliferation, Zelltod, Zellverlustinzitionsgröße oder Kern-DNA-Gehaltsbewertungen durchgeführt werden, um die wundinduzierte Polyploidisierung besser zu verstehen. oder andere Prozesse innerhalb des Epithels.