Name: Nichtradioaktiver Test zur Messung der Polynukleotid-Phosphorylierung kleiner Nukleotidsubstrate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Lernen Sie einen nichtradioaktiven Test zur Messung der Kinaseaktivität von Polynukleotidkinasen auf kleinen DNA- und RNA-Substraten. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Detektion kleiner Phosphorylierungsänderungen.

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Wir danken Dr. Andrew Sikkema und Andrea Kaminski für ihre kritische Lektüre dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom US National Institute of Health Intramural Research Program unterstützt; US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS; ZIA ES103247 an R.E.S) und die Canadian Institutes of Health Research (CIHR; 146626 bis M.C.P).

1. Vorbereitung
<ol><li>Puffer und Reagenzien vorbereiten.<ol>
<li>Machen Sie 1x Reaktionspuffer, indem Sie 20 l von 1 M Tris (pH = 8,0), 40 l 5 m Natriumchlorid, 2,5 l 2 m Magnesiumchlorid, 100 l 50 % (v/v) Glycerin und RNase-freies Wasser kombinieren, um ein Gesamtvolumen von 1 ml zu erreichen.</li>
		<li>Harnstoff-Ladefarbstoff durch Kombination von 4,8 g Harnstoff, 200 l 1 M Tris (pH = 8,0), 20 l 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 0,5 ml 1% (w/v) Bromophenolblau und RNase-freiem Wasser für ein Gesamtvolumen von 10 ml.</li>
		<li>Machen Sie 10x TBE Puffer durch Kombination von 108 g Tris-Basis, 55 g Borsäure, 40 ml 0,5 M EDTA (pH = 8,0) und RNase-freiem Wasser, um ein Gesamtvolumen von 1 L zu erreichen.</li>
		<li>Machen Sie 10% (w/v) Ammoniumpersulfat (APS). Wiegen Sie 0,5 g APS und fügen Sie 3 ml RNase-freies Wasser hinzu, um den Feststoff aufzulösen. Fügen Sie RNase-freies Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 5 ml zu erreichen. Das Rohr in Folie wickeln und bei 4 °C aufbewahren. HINWEIS: Gelöste APS zerfällt im Laufe der Zeit. Ersetzen Sie die 10% APS Aktie alle 2 Wochen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erhalten Sie Polynukleotid-Kinase-Enzym.<ol>
<li>Erwerben Sie reines Las1-Grc3 PNK-Enzym2, das im Reaktionspuffer (siehe Schritt 1.1.1) in einer Lagerkonzentration von 20 M gespeichert ist. Der Speicherpuffer variiert je nach PNK.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nukleinsäuresubstrat zubereiten. HINWEIS: Dieses Protokoll überwacht die 5'-Phosphorylierung eines 27 nt RNA-Substrats, das die Las1-Grc3-Verarbeitungsstelle (C2-Site) beherbergt, die in der Saccharomyces cerevisiae vor-ribosomalen internen transkribierten Spacer 2 (SC-ITS2; siehe Tabelle 1)2,25,26enthalten ist.<ol>
<li>Chemisch synthetisieren Sie ein RNA-Oligonukleotidsubstrat, das ein 5'-Hydroxyl-Ende zusammen mit einem 3'-Fluoreszenz-Label enthält. Das Fluorophor wird zur Visualisierung der RNA verwendet. Stellen Sie sicher, dass das Fluorophor am RNA-Ende positioniert ist, das nicht für die Phosphorylierung vorgesehen ist. Als Alternative zu kommerziellen Quellen kann die interne und terminale fluoreszierende Kennzeichnung von RNA-Substraten intern mit kostengünstigen Protokollen27durchgeführt werden.</li>
		<li>Entfernen Sie überschüssiges Fluorophor aus der RNA-Etikettierungsreaktion durch HPLC-Reinigung28.</li>
		<li>Setzen Sie die lyophilisierte RNA mit RNase-freiem Wasser auf 500 nM aus.</li>
		<li>Speichern Sie RNA-Aliquots bei -80 °C für die Langzeitlagerung oder -20 °C für die kurzfristige Lagerung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die ATP-Konzentrationsserie vor.<ol>
<li>Erstellen Sie einen 20 mM-Betriebsbestand von ATP mit Reaktionspuffer (siehe Schritt 1.1.1). Verwenden Sie diesen Arbeitsbestand, um vier serielle Verdünnungen von 20 mM-0,02 mM zu erzeugen.</li>
		<li>Um die erste Verdünnung der Konzentrationsserie zu machen, mischen Sie 1 l des 20 mM ATP-Arbeitsbestands mit 9 l Reaktionspuffer. Dies führt zu einer 10-fachen Verdünnung des ATP mit einer Endkonzentration von 2 mM.</li>
		<li>Verwenden Sie den in Schritt 1.4.2 erzeugten ATP-Bestand von 2 mM, um die nächste Verdünnung in der Konzentrationsserie vorzunehmen. Mischen Sie 1 l des 2 mM ATP-Bestands mit 9 l Reaktionspuffer. Damit wird eine neue ATP-Lagerkonzentration von 0,2 mM möglich sein.</li>
		<li>Verdünnen Sie weiterhin 1 L des vorherigen ATP-Bestands mit 9 l Reaktionspuffer, um den nachfolgenden ATP-Bestand in der Konzentrationsserie herzustellen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. In-vitro-RNA-Kinase-Reaktion
HINWEIS: Dieser Test kann verwendet werden, um mehrere Variablen wie Zeit, Nukleotidspiegel oder Enzymkonzentration zu messen. Das Ziel dieses Experiments ist es, die Menge der phosphorylierten RNA in Gegenwart von konstanten Las1-Grc3-Komplex und variierenden ATP-Spiegeln zu bewerten.
<ol><li>Kombinieren Sie für jede RNA-Enzym-Kinase-Reaktion 1 l 500 nM RNA-Substrat, 8,3 l von 130 nM Las1-Grc3 und 0,2 l mit 5 mM EDTA. HINWEIS: Wenn Sie mehrere Reaktionen durchführen, bereiten Sie einen Master-Bestand des RNA-Enzym-Gemischs und aliquot 9,5 l dieser Master-Mischung zu jedem Reaktionsröhrchen vor.</li>
	<li>Starten Sie den Test.<ol>
<li>Stellen Sie den Wärmeblock auf 37 °C ein.</li>
		<li>Mischen Sie in 10 s Intervallen 0,5 l eines ATP-Substocks aus der ATP-Konzentrationsserie, die in Schritt 1.4 mit einem RNA-Enzym-Gemisch hergestellt wird, und legen Sie die Reaktion in den 37 °C-Wärmeblock. ANMERKUNG: Fügen Sie 0,5 L Reaktionspuffer anstelle von ATP zu einer RNA-Enzym-Mischung für eine PNK-Negativkontrolle hinzu. Verwenden Sie auch eine andere notwendige Kontrolle (d. h. RNA-Substrat in Abwesenheit von PNK-Enzym).</li>
		<li>Inkubieren Sie die Reaktionen für 60 min bei 37 °C. HINWEIS: Fluoreszierend markierte RNA ist lichtempfindlich; daher die Reaktionen mit Folie abdecken.</li>
		<li>Mit der gleichen Reihenfolge wie in Schritt 2.2.2, löschen Sie jede Reaktion alle 10 s, indem Sie die Reaktion mit 10 l Harnstoff-Ladefarbstoff saugen (siehe Schritt 1.1.2). HINWEIS: Zusätzlich zu 4 M Harnstoff kann in diesem Schritt Proteinase K hinzugefügt werden, um das Enzym zu abbauen. Befolgen Sie die Anweisungen des Lieferanten, um die erforderliche Proteasemenge und Reaktionsbedingungen zu bestimmen.</li>
		<li>Verwenden Sie die abgeschreckten In-vitro-RNA-Kinase-Reaktionen sofort für die nachgeschaltete Analyse (siehe Abschnitt 3) oder speichern Sie sie bei -20 °C, um zu einem späteren Zeitpunkt analysiert zu werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Gelelektrophorese
<ol><li>15% Acrylamid/8 M Harnstoffgellösung zubereiten. VORSICHT: Acrylamid muss mit Vorsicht behandelt werden, da es sich um ein Neurotoxin handelt. Tragen Sie beim Umgang mit Handschuhen, laborierter Kleidung und Brille immer Handschuhe und Schutzbrillen.<ol>
<li>In einem 150 ml Glasbecher 22,5 ml vorgemischtes 40%-Acrylamid/Bis-Acrylamid 29:1-Lösung, 6 ml 10x TBE (siehe Schritt 1.1.3), 28,8 g Harnstoff und RNase-freies Wasser mit einem Gesamtvolumen von 59 ml kombinieren. Rühren Sie die Lösung vorsichtig. HINWEIS: Je nach Länge des RNA-Substrats kann die Veränderung des Polyacrylamidanteils die Auflösung zwischen nichtphosphorylierter und phosphorylierter RNA verbessern.</li>
		<li>Um den Harnstoff aufzulösen, erhitzen Sie die Lösung in der Mikrowelle für 20 s, rühren Sie die Flüssigkeit, und legen Sie die Lösung sofort wieder in die Mikrowelle für weitere 20 s. Rühren Sie die Lösung vorsichtig, bis sich der Harnstoff vollständig auflöst.</li>
		<li>Kühlen Sie die Lösung langsam ab, indem Sie den Glasbecher in ein flaches Wasserbad mit kaltem Wasser legen. Stellen Sie sicher, dass der Grad des kalten Wassers, das den Glasbecher umgibt, über dem Niveau der Lösung im Glasbecher liegt. Dies wird eine effiziente Wärmeübertragung fördern. Warten Sie 5 min. HINWEIS: Fahren Sie nicht mit diesem Protokoll fort, wenn sich der Glasbecher warm anfühlt; sollte das Wasser unter 25 °C liegen. Wenn es sich nach 5 min noch warm anfühlt, dann ersetzen Sie das Wasser im Wasserbad durch frisches kaltes Wasser und warten Sie weitere 5 min.</li>
		<li>Filtern und entgasen Sie die Lösung mit einer Einwegfiltrationseinheit von 0,22 m, um Partikel und mikroskopische Luftblasen zu entfernen.</li>
	</ol></li>
	<li>Gießen Sie das denaturierende Gel.<ol>
<li>Verwenden Sie Seife und warmes Wasser, um eine kurze und lange Glasplatte für Gele mit Gesamtabmessungen von 31,0 cm x 38,5 cm zu reinigen. Sprühen Sie jede Glasplatte mit 95% Ethanol und wischen Sie das Glas ab, um Feuchtigkeit zu entfernen. HINWEIS: Eine der beiden Platten kann silikonisiert werden, um Schäden am Gel beim Trennen des Glasplatten-Sandwiches zu verhindern. Dieser Schritt ist jedoch nicht notwendig, da dieses Protokoll entwickelt wurde, um die RNA zu visualisieren, ohne die Glasplatten zu trennen.</li>
		<li>Legen Sie die lange Glasplatte horizontal auf eine Box, so dass sie von der Tischplatte erhöht wird. VORSICHT: Acrylamid ist giftig, daher muss die Gelgießstation mit Bankpapier abgedeckt werden, das jede verschüttete Flüssigkeit aufnehmen kann und nach Abschluss des Verfahrens sofort in einen Abfallbeutel gelegt werden kann.</li>
		<li>Legen Sie einen sauberen 0,4 mm Abstandsraum an den langen Rändern der langen Glasplatte.</li>
		<li>Legen Sie die kurze Glasplatte auf die lange Platte und stellen Sie sicher, dass die Kanten der kurzen Platte, der langen Platte und der Abstandshalter ausgerichtet sind. Klemmen Sie jede Seite mit drei gleichmäßig verteilten Metallklemmen.</li>
		<li>Fügen Sie der in Schritt 3.1 zubereiteten 15% Acrylamid/8 M Harnstofflösung 24 l TEMED hinzu und mischen Sie die Lösung.</li>
		<li>Fügen Sie der Lösung in Schritt 3.2.5 600 l von 10 % (w/v) APS (siehe Schritt 1.1.4) hinzu und mischen Sie die Lösung vorsichtig.</li>
		<li>Gießen Sie sofort die Lösung zwischen die Glasplatten. HINWEIS: Um Blasen zu vermeiden, tippen Sie auf das Glas, während die Lösung gegossen wird.</li>
		<li>Fügen Sie vorsichtig einen sauberen, 0,4 mm, 32 gut Kamm auf die Oberseite der Glasplatte Sandwich.</li>
		<li>Mindestens 30 min für die Polymerisation des Acrylamids zulassen.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie das denaturierende Gel aus.<ol>
<li>Stellen Sie den Wärmeblock auf 75 °C ein.</li>
		<li>Entfernen Sie die Metallklemmen, die das Glasplatten-Sandwich zusammenhalten, und waschen und trocknen Sie das Glasplatten-Sandwich gründlich.</li>
		<li>Legen Sie das Glasplatten-Sandwich in das Gelgerät mit der kurzen Platte nach innen gerichtet.</li>
		<li>Bereiten Sie 0,5x TBE Laufpuffer vor, indem Sie 100 ml 10x TBE mit 1,9 L RNase-freiem Wasser kombinieren. Fügen Sie 600 ml des Laufpuffers in die oberen und unteren Kammern des Gelapparats ein.</li>
		<li>Entfernen Sie den Kamm vorsichtig und spülen Sie die Brunnen gründlich mit einer Spritze. HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend für die Entfernung von Harnstoff aus den Brunnen.</li>
		<li>Vorlauf das Gel für 30 min bei 50 W. Spannung ist ca. 2.000 V. VORSICHT: Dieses Gelgerät arbeitet mit einer hohen Wattleistung und Benutzer sollten Vorsichtsmaßnahmen an den Stellen an den Stellen anstellen.</li>
		<li>Spülen Sie die Brunnen gründlich mit einer Spritze. HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend für das gleichmäßige Laden von Proben in die Brunnen.</li>
		<li>Pulsdrehen Sie die abgeschreckten Reaktionen ab Schritt 2.2.5. Dann die Rohre bei 75 °C für 3 min inkubieren. Wiederholen Sie den Pulsdreh.</li>
		<li>Laden Sie sofort 10 l Probe pro Bohrgut und führen Sie das Gel für 3 h bei 50 W. HINWEIS: Fluoreszierend markierte RNA ist lichtempfindlich; daher das Gelgerät mit Folie bedecken.</li>
	</ol></li>
	<li>Bild das denaturierende Gel.<ol>
<li>Schalten Sie die Stromversorgung aus und entleeren Sie die obere Kammer des Gelgeräts.</li>
		<li>Waschen und trocknen Sie die Außenseite des Glasplatten-Sandwiches mit Seife und Wasser. Bedecken Sie das Glasplatten-Sandwich mit Folie, während Sie das Gel transportieren.</li>
		<li>Montieren Sie das Glasplatten-Sandwich auf die Bühne eines Laserscanners, der in der Lage ist, quantitative und empfindliche Fluoreszenzzuerkennen durchzuführen. HINWEIS: Dieses Gel ist extrem dünn für maximale Auflösung. Aus diesem Grund wurde dieses Protokoll entwickelt, um die Schwierigkeiten zu vermeiden, das Gel aus dem Glasplatten-Sandwich zu entfernen, indem die fluoreszierend markierte RNA direkt durch die Glasplatten visualisiert wird. Die Verwendung von handelsüblichen Niedrigfluoreszenz-Glasplatten wird das erfasste Signal erhöhen, indem das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert wird.</li>
		<li>Stellen Sie die Anregungs- und Emissionswellenlängen des Laserscanners für das gewünschte Fluorophor ein. HINWEIS: Die optimalen Anregungs- und Emissionswellenlängen können sich für bestimmte Fluorophore unterscheiden. Für das FAM-Fluorophor betragen die Anregungs- und Emissionswellenlängen 495 nm bzw. 535 nm.</li>
		<li>Definieren Sie den bereich, der auf der Laserscanner-Bühne visualisiert werden soll, und stellen Sie das Gel gemäß den Anweisungen des Herstellers ab (Abbildung 1).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Bildanalyse und Signalquantifizierung
<ol><li>Laden Sie das in Schritt 3.4.5 aufgenommene digitale Gelbild in bildprocesing-Software (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Klicken und ziehen Sie mithilfe der linken Maustaste auf ein Rechteck, um ein Vorlagenfeld zu definieren, um die Grenzen auf dem digitalen Gelbild zu markieren, das zur Quantifizierung jedes RNA-Bands verwendet wird. Das RNA-Band, das in der Reaktionsmischung gesehen wird, die in Abwesenheit von PNK-Enzym eingestellt ist, ist in der Regel ein gutes Band, um diese Vorlage zu erzeugen. HINWEIS: Um Verzerrungen durch Hintergrundsignale zu vermeiden, ist es wichtig, dass der Bereich, der jedes gemessene RNA-Band umgibt, identisch ist. Aus diesem Grund ist es am besten, die gleiche Vorlagenbox zu verwenden, um jedes RNA-Band abzugrenzen.</li>
	<li>Öffnen Sie den ROI-Manager unter "Werkzeuge" und markieren Sie die Position des Vorlagenfelds, indem Sie auf "Hinzufügen" klicken. HINWEIS: Quantitationsprogramme können auch automatisch nach dem Software-Benutzerhandbuch Boxen zeichnen.</li>
	<li>Klicken und ziehen Sie mit der linken Maustaste das Vorlagenfeld auf das nächste RNA-Band, und wiederholen Sie Schritt 4.3. Kontinuierliche diesen Prozess, bis die Position aller nicht phosphorylierten und phosphorylierten RNA-Bänder in jeder Reaktion markiert ist.</li>
	<li>Messen Sie die integrierte Dichte in jedem Feld, indem Sie im ROI Manager auf"Messen"klicken.</li>
	<li>Um die relative Menge der phosphorylierten RNA in einer Reaktion zu berechnen, teilen Sie die integrierte Dichte des phosphorylierten RNA-Bandes durch die Summe der integrierten Dichten der nicht phosphorylierten und phosphorylierten RNA-Bänder aus derselben Reaktion. Dieser Ansatz kann auch angewendet werden, um die relative Menge der nichtphosphorylierten RNA zu berechnen.</li>
	<li>Um die Ansammlung von phosphoryliertem RNA-Produkt und der entsprechenden Erschöpfung des nichtphosphorylierten RNA-Substrats über die ATP-Konzentrationsserie zu visualisieren, zeichnen Sie die relative Menge der in Schritt 4.6 berechneten RNA-Menge gegen die ATP-Konzentration auf.</li>
</ol>

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<li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3%2FLas1+pre-rRNA+processing+complex%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), 721-738 (2018).</li>
<li>Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+final+step+in+the+formation+of+25S+rRNA+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+performed+by+5%27--%3E3%27+exonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'-->3' exonucleases.</a> RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).</li>
<li>Pillon, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+reveals+active+site+coordination+within+a+multienzyme+pre-rRNA+processing+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex.</a> Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).</li>
<li>Solomatin, S., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+site-specific+labeling+of+RNA+with+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes.</a> Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Beschrieben ist ein Test zur Messung der Kinase-Aktivität von Grc3 PNK auf fluoreszierend markierten Nukleotidsubstraten. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um andere PNK-Enzyme durch Anpassung des Reaktionspuffers und des Oligonukleotidsubstrats zu charakterisieren. Beispielsweise fordert das Protokoll eine Rückverfolgungsmenge von EDTA. Die Zugabe von EDTA ist aus zwei Gründen von Vorteil: Erstens begünstigt dieser Ansatz Magnesium-gebundene Grc3, indem verhindert wird, dass das Enzym an die Rückverfolgbarkeit vo...

Polynukleotid-Kiinasen (PNK) spielen in vielen DNA- und RNA-Verarbeitungswegen eine entscheidende Rolle, wie z. B. DNA-Reparatur und Ribosome-Montage1,2,3,4,5. Diese grundlegenden Enzyme katalysieren die Übertragung des terminalen (Gamma)-Monophosphats von einem Nukleosidtriphosphat (NTP, am häufigsten ATP) auf das 5' Hydroxylende eines Nukleotidsubstrats. Eines der am besten charakterisierten PNKs ist das Bakteriophagen T4 PNK, das eine breite Substratspezifität hat und von molekularbiologischen Labors stark genutzt wird, um radioaktive Isotopenetiketten auf den 5 Endpunkt eines DNA- oder RNA-Substrats6,7,8,9,10,11,12zu integrieren. Ein weiteres Beispiel für ein PNK-Enzym ist CLP1, das in Eukarya, Eubacteria und Archaea vorkommt und in mehrere RNA-Verarbeitungswege4,13,14,15verwickelt ist.
Historisch gesehen sind die meisten Assays, die die Aktivität der Polynukleotidkinase messen, von der Kennzeichnung radioaktiver Isotope und der anschließenden Autoradiographie5,16abhängig. In den letzten Jahren wurden eine Reihe zusätzlicher Assays entwickelt, um die PNK-Aktivität zu messen, darunter Einzelmolekülansätze, Mikrochip-Elektrophorese, molekulare Leuchttürme sowie kolorimetrische und lumineszenzbasierte Assays17,18,19,20,21,22. Während viele dieser neuen Ansätze verbesserte Nachweisgrenzen bieten und den Einsatz von Radioaktivität vermeiden, hat jeder Nachteile, wie Kosten, Abhängigkeit von immobilisiertem Harz und Einschränkungen bei der Substratauswahl.
Grc3 ist eine Polynukleotidkinase, die eine zentrale Rolle bei der Verarbeitung von präribosomaler RNA2,3,23spielt. Grc3 bildet einen obligaten Komplex mit der Endoribonuklease Las1, die den Internal Transcribed Spacer 2 (ITS2) der präribosomalen RNA3spaltet. Die Spaltung des ITS2 durch Las1 erzeugt ein Produkt, das ein 5' Hydroxyl beherbergt, das anschließend von der Grc3-Kinase3phosphoryliert wird. Um die Nukleotid- und Substratspezifität von Grc3 zu untersuchen, war ein kostengünstiger Test erforderlich, der das Testen verschiedener Oligonukleotidsubstrate ermöglichte. Daher wurde ein PNK-Phosphorylierungstest mit fluoreszierend markierten Substraten entwickelt. Dieser Test wurde erfolgreich verwendet, um festzustellen, dass Grc3 jedes NTP für Phosphoryltransferaktivität nutzen kann, begünstigt aber ATP24. Dieses Protokoll passt den ursprünglichen Assay an, um die PNK-Aktivität von Grc3 auf einer RNA-Mimik seines präribosomalen RNA-Substrats zu messen (SC-ITS2, Tabelle 1). Ein herausfordernder Aspekt dieses fluoreszenzbasierten Ansatzes ist die Abhängigkeit von großen Polyacrylamid-Gelen, um phosphorylierte und nicht phosphorylierte Substrate effektiv zu lösen. Das Protokoll enthält spezifische Details darüber, wie diese großen Gele gegossen werden und dabei häufige Fallstricke vermieden werden können.
Die Arbeit mit RNA erfordert besondere Sorgfalt, da sie stark anfällig für Degradation ist. Es gibt einfache vorbeugende Schritte, um ribonuklease-Kontamination zu begrenzen. Eine separate RNA-Workstation, die leicht mit einem RNase-Inhibitor-haltigen Reinigungsmittel behandelt werden kann, ist oft hilfreich. Bei der Handhabung von Proben und der Verwendung von RNase-freien zertifizierten Verbrauchsmaterialien ist immer Handschuhe zu tragen. Da Wasser eine weitere häufige Kontaminationsquelle ist, ist es am besten, frisch gereinigtes Wasser zu verwenden und alle Lösungen mit einem 0,22 m-Filter zu sterilisieren.

<table><tbody><tr><td>0,4 mm 34-Well-Kamm</td><td>BioRad</td><td>1653848</td><td></td></tr><tr><td>0,4 mm Spacer</td><td>BioRad</td><td>1653812</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA ph 8,0</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3130</td><td></td></tr><tr><td>1M Magnesiumchlorid</td><td>KD Medical</td><td>CAC-5290</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris pH 8,0</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3360</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamid/Bis-Lösung 29:1</td><td>BioRad</td><td></td><td></td>1610146</tr><tr><td>5M Natriumchlorid</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3720</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat (APS)</td><td>BioRad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A2383-1G</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Sigma</td><td>B0394</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau Natriumsalz</td><td>Sigma</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>Glasplatten</td><td>Thomas Scientific</td><td>1188K51</td><td></td></tr><tr><td>Hoefer SQ3 Sequenzierer</td><td>Hoefer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Image J Software</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td><a href="https://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij/</a></td></tr><tr><td>Markierte RNA-Oligonukleotide</td><td>IDT</td><td>Custom Order</td><td></td></tr><tr><td>Pharmacia EPS 3500 Netzteil</td><td>Pharmacia</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip 0,22 μm Filter</td><td>Millipore</td><td>5FCP00525</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BioRad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>tris base</td><td>Sigma</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon FLA 9500 Gel Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Pure DEPC Water</td><td>Invitrogen</td><td>750023</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Pure Glycerol</td><td>Invitrogen</td><td>19E1056865</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Fisher Chemical</td><td>U15-500</td><td></td></tr></tbody></table>

nichtradioaktiver test zur messung der polynukleotid-phosphorylierung kleiner nukleotidsubstrate

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynukleotid-Kinasen (PNKs) sind Enzyme, die die Phosphorylierung des 5'-Hydroxylendes von DNA- und RNA-Oligonukleotiden katalysieren. Die Aktivität von PNKs kann mit direkten oder indirekten Ansätzen quantifiziert werden. Hier wird ein direkter In-vitro-Ansatz zur Messung der PNK-Aktivität vorgestellt, der auf einem fluoreszierend markierten Oligonukleotidsubstrat und polyacrylamidgelelektrophorese beruht. Dieser Ansatz ermöglicht die Auflösung der phosphorylierten Produkte bei gleichzeitiger Vermeidung der Verwendung von radioaktiv markierten Substraten. Das Protokoll beschreibt, wie die Phosphorylierungsreaktion eingerichtet, große Polyacrylamid-Gele zubereitet und betrieben werden und die Reaktionsprodukte quantifiziert werden. Der technisch anspruchsvollste Teil dieses Assays ist das Gießen und Betreiben der großen Polyacrylamidgele; daher werden wichtige Details zur Überwindung gemeinsamer Schwierigkeiten bereitgestellt. Dieses Protokoll wurde für Grc3 optimiert, ein PNK, das sich mit seinem Bindungspartner, der Las1-Nuklease, zu einem obligaten präribosomalen RNA-Verarbeitungskomplex zusammensetzt. Dieses Protokoll kann jedoch angepasst werden, um die Aktivität anderer PNK-Enzyme zu messen. Darüber hinaus kann dieser Test auch modifiziert werden, um die Auswirkungen verschiedener Komponenten der Reaktion zu bestimmen, wie z. B. Nukleosidtriphosphat, Metallionen und Oligonukleotide.

Abbildung 1zeigt ein erfolgreiches repräsentatives Denaturierungsgel einer Titration von ATP mit einer festen Menge an Las1-Grc3-Komplex . Die Zugabe des Enzyms führte zu einer Las1-vermittelten RNA-Spaltung des SC-ITS2-RNA-Substrats, was zu einem definierten RNA-Fragment (5-OH C2 RNA) führte. Nach Zugabe von ATP wurde das C2-RNA-Fragment durch Grc3 PNK (5-P C2 RNA) phosphoryliert. Bei der Denaturierung von Gelen wandert die phosphorylierte RNA schneller als ...

Dieses Protokoll beschreibt einen nicht radioaktiven Test zur Messung der Kinaseaktivität von Polynukleotid-Kinasen (PNKs) auf kleinen DNA- und RNA-Substraten.

Nichtradioaktiver Test zur Messung der Polynukleotid-Phosphorylierung kleiner Nukleotidsubstrate

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Diese Methode kann wichtige Fragen zur Phosphorylierung des Fünf-Prim-Endes von DNA- oder RNA-Molekülen durch eine spezielle Klasse von Enzymen beantworten, die als Polynukleotidkinase bekannt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Auflösung hat, sehr kleine Veränderungen in DNA- und RNA-Substraten zu erkennen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der RNA-Enzymkinase-Reaktionen.Kombinieren Sie für jede Reaktion einen Mikroliter 500 nanomolarer RNA-Substrat. 8,3 Mikroliter 130 Nanomolar zuletzt, GRC drei und 0,2 Mikroliter von fünf Millimolar EDTA. Stellen Sie den Wärmeblock auf 37 Grad Celsius ein.Mischen Sie dann 0,5 Mikroliter eines ATP-Unterbestands aus der Konzentrationsreihe mit einem RNA-Enzymgemisch und legen Sie die Reaktion auf den Wärmeblock. Mischen Sie die Reaktionen weiter und legen Sie sie in zehn Sekunden intervallen auf den Wärmeblock. Nach einer 60-minütigen Inkubation auf dem Wärmeblock, löschen Sie jede Reaktion, indem Sie es mit 10 Mikroliter Harnstoff-Ladefarbstoff.Führen Sie sofort eine nachgelagerte Analyse durch oder speichern Sie die Reaktionen bei negativen 20 Grad Celsius, um zu einem späteren Zeitpunkt analysiert zu werden. Zur Herstellung einer 15%denaturierenden Acrylamid-Gel-Lösung 22,5 Milliliter vorgemischter 40%29 zu einer Acrylamid/Bis-Acrylamid-Lösung kombinieren. Sechs Milliliter von zehn x TBE.28,8 Gramm Harnstoff. Und RNase freies Wasser mit einem Gesamtvolumen von 59 Millilitern. Dann rühren Sie die Lösung vorsichtig.Erhitzen Sie die Lösung in der Mikrowelle für 20 Sekunden. Rühren Sie es und geben Sie es sofort für weitere 20 Sekunden in die Mikrowelle zurück. Rühren Sie die Lösung vorsichtig, bis der Harnstoff vollständig gelöst ist.Legen Sie den Glasbecher in ein flaches Wasserbad, das fünf Minuten lang kaltes Wasser enthält, und stellen Sie sicher, dass der Gehalt an kaltem Wasser, das den Glasbecher umgibt, über dem Niveau der Lösung im Inneren des Glasbechers liegt. Wenn die Lösung kühl ist, filtern und entgasen Sie sie mit einer Einwegfiltereinheit von 0,2 Mikrometern, um Partikel und mikroskopische Luftblasen zu entfernen. Waschen Sie eine kurze und lange Glasplatte mit Seife und Wasser, dann sprühen Sie jede Platte mit 95% Ethanol und wischen Sie das Glas, um feuchtigkeit zu entfernen.Heben Sie die lange Platte von der Bank oben, indem Sie sie auf eine Box legen. Positionieren Sie dann 0,4 Millimeter Abstandshalter entlang der langen Kanten der Platte. Legen Sie die kurze Platte auf die lange Platte, um sicherzustellen, dass die Kanten der kurzen Platte, der langen Platte und der Abstandshalter ausgerichtet sind.Dann klemmen Sie jede Seite mit drei gleichmäßig verteilten Metallklemmen. 24 Mikroliter TEMED in die Acrylamidlösung geben und mischen. Dann 600 Mikroliter 10%APS hinzufügen und sofort die Lösung zwischen die Glasplatten gießen.Das Gießen der Acrylamidlösung zwischen das Glasplatten-Sandwich kann wirklich eine Herausforderung sein. Um Luftblasen zu vermeiden, tippen Sie auf das Glasplatten-Sandwich, während Sie Ihre Lösung gießen. Fügen Sie vorsichtig einen sauberen 32-Well-Kamm an die Oberseite des Glasplatten-Sandwiches.Und lassen Sie das Acrylamid für 30 Minuten polymerisieren. Um das Gel auszuführen, stellen Sie den Wärmeblock auf 75 Grad Celsius ein. Entfernen Sie die Metallklemmen.Und gründlich waschen und trocknen Sie die Glasplatte Sandwich. Positionieren Sie das Plattensandwich und das Gelgerät mit der kurzen Platte nach vorne und bereiten Sie 0,5 X TBE Laufpuffer vor, indem Sie 100 Milliliter 10 X TBE mit 1,9 Literr RNase-freiem Wasser kombinieren. Fügen Sie 600 Milliliter des Laufpuffers in die oberen und unteren Kammern des Geräts.Entfernen Sie den Kamm vorsichtig vom Gel und spülen Sie die Brunnen gründlich mit einer Spritze ab. Führen Sie das Gel mit 50 Watt für 30 Minuten vor. Dann spülen Sie die Brunnen wieder ab.Drehen Sie die Löschreaktionen und bebrüten sie drei Minuten lang bei 75 Grad Celsius. Wiederholen Sie den Pulsspin und laden Sie sofort 10 Mikroliter jeder Probe auf das Gel. Dann laufen Sie das Gel für drei Stunden bei 50 Watt.Wenn der Lauf beendet ist, schalten Sie die Stromversorgung aus und entleeren Sie die obere Kammer des Geräts. Waschen und trocknen Sie die Außenseite des Glasplatten-Sandwiches. Dann mit Folie bedecken und zur Bildgebung auf einen Laserscanner übertragen.Montieren Sie das Glasplatten-Sandwich auf die Bühne des Laserscanners. Stellen Sie die Anregungs- und Emissionswellenlängen für den gewünschten Boden für das Gel ein und stellen Sie es ab. Hier ist ein repräsentatives erfolgreiches Denaturierungsgel einer Titration von ATP mit einer festen Menge von zuletzt einem GRC drei Komplex gezeigt.Die Zugabe des Enzyms führte zu einer letzten vermittelten RNA-Spaltung des Saccharomyces cerevisiae ITS zwei RNA-Substrat, was zu einem definierten RNA-Fragment führte. Nach Zugabe von ATP wurde das C2-RNA-Fragment durch GrC3 PNK phosphoryliert. Um die Phosphorylierung des C2-RNA-Fragments zu visualisieren, wurde die relative Menge an nicht phosphorylierter und phosphorylierter C2-RNA gegen die ATP-Konzentration dargestellt.Unser repräsentatives erfolgloses Denaturierungsgel wird hier gezeigt. Das 21 Nukleotid-RNA-Substrat enthielt Abbauprodukte, die sich mit dem phosphorylierten Produkt überlappten und eine genaue Quantifizierung der Phosphorylierung unmöglich machten. Im Gegensatz dazu konnte das kürzeste RNA-Abbauprodukt erfolgreich analysiert werden, da dieser Bereich des Gels keine zusätzlichen RNA-Arten enthielt, die eine genaue Quantifizierung seines phosphorylierten Gegenstücks behinderten.Das Wichtigste, was Sie beim Versuch dieses Protokolls beachten sollten, ist, die Brunnen des Gels zu spülen, um eine gleichmäßige Belastung Ihrer Probe zu gewährleisten. Nach diesem Verfahren konnte ein RNA-Umsatzexperiment durchgeführt werden. Um die Raten des RNA-Abbaus zu messen, signalisiert die Phosphorylierung oft die Initiierung des RNA-Abbaus.Diese Technik ebnet den Weg für die Beantwortung detaillierter Fragen über die Aktivitätsspezifität und Kinetik von Polynukleotid-Kiinasen.

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Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In diesem Video demonstrieren wir eine denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese zur Trennung von phosphorylierten RNA-Spezies von ihren nicht-phosphorylierten Gegenstücken. Die RNA-Spezies werden für die Laserdetektion auf dem Gel fluoreszenzmarkiert.

Denaturierende Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese für die RNA-Analyse: Eine Technik zur Trennung von fluoreszenzmarkierten phosphorylierten RNA-Oligonukleotiden von ihren nicht-phosphorylierten Äquivalenten

Dieses Video demonstriert eine empfindliche Quantifizierungstechnik der Proteinphosphorylierung mit einem Einzelmolekül-Pull-Down-Assay. Die Funktionalisierung von Polyethylenglykol-Biotin und die Verwendung von markierten Antikörpern erhöht den Nachweis von phosphoryliertem Tyrosin mit Spezifität.

Einzelmolekül-Pull-Down-Assay für die Proteinphosphorylierungsanalyse: Eine Hochdurchsatztechnik zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung in Zelllysat

Leucin-reichen Repeat-Kinasen 1 und 2 (LRRK1 und LRRK2) sind Multidomänen-Proteine, die sowohl GTPase und Kinase-Domänen kodieren, und die in Zellen phosphoryliert sind. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur LRRK1 und LRRK2 in Zellen mit 32 P-Orthophosphat zu kennzeichnen, wodurch ein Mittel, um ihre Gesamtzell Phosphorylierung zu messen bietet.

Metabolische Markierung von Leucin Rich-Repeat-Kinasen 1 und 2 mit radioaktivem Phosphat

Das hier beschriebene Protokoll stellt eine einfache und reproduzierbare Methode dar, die Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) verwendet, um den Purinstoffwechsel an chronischen lymphatischen Leukämie (CLL)-Zellen zu messen, die unter verschiedenen Bedingungen kultiviert wurden.

HPLC-basierten Assay extrazelluläre Nucleotid / Nukleosid Metabolismus in menschlichen chronischer lymphatischer Leukämie-Zellen zu überwachen

Wir berichten und demonstrieren einen optimierten Nitrocellulose-Bindungsassay, der zur Quantifizierung der Autophosphorylierung von gereinigten bakteriellen Histidinkinasen verwendet werden kann. Unsere Methode hat mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen SDS-PAGE-basierten Techniken und stellt eine wertvolle Alternative zur Charakterisierung dieser wichtigen Proteine dar.

Quantifizierung der Bakterien Histidinkinase Autophosphorylierung eine Nitrocellulose-Bindungsassay unter Verwendung

Proteinkinasen sind hochentwickelte Signalisierungsenzyme und Gerüste, die für die inter- und intrazelluläre Signaltransduktion kritisch sind. Wir stellen ein Protokoll zur Messung der Kinaseaktivität durch die Verwendung von radioaktiv markiertem Adenosintriphosphat ([γ- 32 P] ATP) vor, ein zuverlässiges Verfahren zur Erleichterung der zellulären Signalregulation.

Test der Proteinkinase-Aktivität mit radioaktiv markiertem ATP

Peptid-Konkurrenz-Assays sind weit verbreitet in einer Vielzahl von molekularen und immunologischen Experimenten verwendet. Dieses Papier beschreibt eine detaillierte Methode für einen in vitro- Oligopeptid-konkurrierenden Kinase-Assay und die damit verbundenen Validierungsverfahren, die nützlich sein können, um spezifische Phosphorylierungsstellen zu finden.

Oligopeptid-Konkurrenz-Assay zur Phosphorylierungsbestimmung

Wir beschreiben eine einfache Methode für schnelle Quantifizierung von anorganischen Polyphosphat in verschiedenen Bakterien, einschließlich gramnegative und grampositive mykobakteriellen Arten.

Prüfung für anorganisches Polyphosphat in Bakterien

Ein Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH)-gekoppelter ATPase-Assay wurde an das semihohe Durchsatzscreening von kleinen Molekül-Myosininhibitoren angepasst. Dieser kinetische Assay wird in einem 384-Well-Mikroplattenformat mit einem Gesamtreaktionsvolumen von nur 20 l pro Brunnen ausgeführt. Die Plattform sollte für praktisch jedes ADP-produzierende Enzym gelten.

Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren

Hier wird ein Protokoll zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen vorgestellt, wobei Beispiele von Ligasen-, Nuklease- und Polymerase-Enzymen verwendet werden. Der Assay verwendet fluoreszenzmarkierte und unmarkierte Oligonukleotide, die zu Duplexen kombiniert werden können, die RNA- und/oder DNA-Schäden oder Signalwegzwischenstufen nachahmen, was die Charakterisierung des Enzymverhaltens ermöglicht.

Verwendung modifizierter synthetischer Oligonukleotide zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen

Lernen Sie einen nichtradioaktiven Test zur Messung der Kinaseaktivität von Polynukleotidkinasen auf kleinen DNA- und RNA-Substraten. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Detektion kleiner Phosphorylierungsänderungen.

Nichtradioaktiver Test zur Messung der Polynukleotid-Phosphorylierung kleiner Nukleotidsubstrate

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