Name: Forward Genetic Screen Mit transgenem CalciumReporter Aequorin, um neuartige Ziele bei der Calciumsignalisierung zu identifizieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Entdecken Sie die klassische Forward-Genetik-Screening-Methode mit EMS-Mutagenese und dem Calcium-Reporter Aequorin in Arabidopsis. Dieses Protokoll ermöglicht die Identifizierung neuer Gene im Calcium-Signalweg.

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Wir danken dem National Institute of Plant Genome Research - Phytotron Facility for plant growth, Bombay Locale für das Videoshooting und dem Department of Biotechnology- eLibrary Consortium für den Zugang zu E-Ressourcen. Diese Arbeit wurde vom Department of Biotechnology, Indien durch das National Institute of Plant Genome Research Core Grant, Max-Planck Gesellschaft-India Partner Group-Programm, unterstützt; und CSIR-Junior Research Fellowship (zu D.M und S.M) und Department of Biotechnology-Junior Research Fellowship (zu R.P).

1. EMS-Mutagenese und Einzelstammbaum-basierte Saatgutsammlung (1-3 Monate)
<ol><li>Wiegen Sie 150 mg Samen (7500) Aequorin für EMS-Mutagenese (M0 Samen). Wiegen Sie weitere 150 mg Samen als Kontrolle verwendet werden.</li>
	<li>Die Samen in ein 50 ml-Rohr geben und 25 ml 0,2% EMS (v/v) (VORSICHT) (zur Behandlung) oder 25 ml autoklaviertes Wasser (zur Kontrolle) hinzufügen. HINWEIS: Ethylmethansulfonat ist ein chemisches Mittel zur Erbeinung von Pflanzenmaterial.</li>
	<li>Versiegeln Sie das Rohr mit Parafilm und wickeln Sie es in Aluminiumfolie. Drehen Sie das Rohr Ende-über-Ende für 18 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Lassen Sie die Samen absetzen. Entfernen Sie die EMS-Lösung sorgfältig und entsorgen Sie sie in einem Abfallbehälter mit 1 M NaOH in gleichen Mengen (NaOH hilft, EMS zu neutralisieren/inaktivieren, damit es sicher entsorgt werden kann). Entsorgen Sie die gebrauchten Kunststoffe in einer 1 M NaOH-Lösung. HINWEIS: Entsorgen Sie die Rückwürfe nach 24 h gemäß den Laborverfahren für gefährlicheS Material.</li>
	<li>Waschen Sie die mutagenisierten Samen mindestens 8 Mal mit 40 ml autoklavierten Wassers gründlich. Entsorgen Sie EMS, das Wasser in einem NaOH-Abfallbehälter enthält, wie oben erwähnt.</li>
	<li>Für die Endwäsche 40 ml 100 ml Natriumthiosulfat hinzufügen und 3 Mal ausspülen, um Emsspuren zu entfernen.</li>
	<li>Die Samen in 40 ml autoklaviertem Wasser für 1 h einweichen, um EMS aus den Samen zu diffundieren, und legen Sie sie dann auf Filterpapier, bis sie vollständig trocken sind.</li>
	<li>Die Samen in ein Mikrozentrifugenrohr geben und die Samen bei 4 °C in 40 ml autoklaviertem Wasser für 2-4 Tage schichten. Dies hilft bei der Bruch samenRuhe und sorgt für homogenes Wachstum.</li>
	<li>Übertragen Sie sowohl die mutagenisierten Samen (M0) als auch die Kontrollsamen auf den Boden (Bodenzusammensetzung: Agropet: Bodenrit, 1:1) und übertragen Sie sie in Wachstumsräume mit einer 16 h hellen/8 h dunklen Photoperiode, einer Lichtintensität von 150 molm, 2s1 und 70% relative Luftfeuchtigkeit.</li>
	<li>Um festzustellen, ob die Mutagenese erfolgreich war, achten Sie auf eine reduzierte Keimgeschwindigkeit und das Kornlingswachstum und die Chlorophyll-Sektorierung18 (Abbildung 1A). Vergleichen Sie die mutagenisierten Pflanzen mit den Kontrollpflanzen, um diese physiologischen und Entwicklungsunterschiede zu identifizieren. HINWEIS: Für die Ernte von Samen aus M1-Pflanzen können verschiedene Methoden verwendet werden. In diesem Protokoll haben wir die Single-Stammbaum-basierte Saatgutsammlungsmethode verwendet. Jede M1-Anlage erhält eine eindeutige Nummer, beginnend von A1 bis A3500.</li>
	<li>Bewahren Sie einzeln nummerierte Pflanzen als diskrete Anlagenlinien auf (Abbildung 1B).</li>
	<li>Nach der Reifung Samen aus diesen einzelnen mutierten Pflanzen ernten und als einzelne M1-Linien lagern (Abbildung 2). Aus der einzelnen Stammbaum-basierten Saatgutsammlung erhielten wir rund 5000 M1 Linien, von denen 3500 M1 Linien abgeschirmt wurden.</li>
</ol>2. Hochdurchsatz-Screening zur Auswahl von Mutanten (8 Monate)
<ol><li>Identifizieren Sie neue Mutanten basierend auf der Ca2+-Antwort auf einen ausgewählten Stimulus. Hier haben wir H2O2 als Beispiel verwendet.</li>
	<li>Zur Identifizierung von Mutanten wird die M2-Generation überprüft. Da sich rezessive Mutanten bei 1/8-Frequenz in der Generation M2 nach EMS-Mutagenese14trennen, deckt das Screening von 8-12 M2-Segrederpflanzen eine2M1-Linie ab und identifiziert einen homozygoten rezessiven Mutanten (mit 12 Sämlingen erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, einen Mutanten zu finden). Testen Sie von jeder unabhängigen M1-Linie 12 M2 Sämlinge auf Ca2+-Antwort auf H2O2 (12 M2 Sämlinge pro M1 Linie).</li>
	<li>Verwenden Sie eine hochdurchsatzhohe Samensterilisation und hydroponisches Pflanzenwachstumsprotokoll19. Fast 12-15 M2 Samen pro M1 Linie in einzelne Brunnen einer 24-Well-Gewebekulturplatte legen und mit Chlorgas (40 ml 12% Natriumhypochlorit und Salzsäure, 3:1, v/v) in einem Trockenhaus für 4 h in einer Dunstabzugshaube sterilisieren. Öffnen Sie nach dem Eingriff den Trockenbau und lassen Sie ihn über Nacht, damit Chlorgas verdunstet.</li>
	<li>Nach der Sterilisation Platten nach draußen bringen und flüssige 1/2 MS-Medien (halbfeste MS ohne Agar) in einzelne Brunnen geben. Versiegeln Sie die Platten mit Parafilm und schichten Sie die Samen für 2-4 Tage bei 4 °C und bewegen Sie dann Dies in eine Wachstumskammer mit 10 h Licht / 14 h dunkle Photoperiode bei 20-22 °C mit 70% relativer Luftfeuchtigkeit.</li>
	<li>Sobald die Sämlinge 8-12 Tage alt sind, legen Sie 12 M2 Sämlinge aus jeder Linie einzeln in eine 96-Well-Leuchtkraftplatte. Verwenden Sie zur Messung des Ca2+-Ansprechs auf H2O2einen Luminometer-Plattenleser.</li>
	<li>Nach der Setzlingsübertragung 150 l 5-10 M Coelentrazin-Lösung (in autoklaviertem Wasser aus einem 5 mM-Bestand in Methanol verdünnt) (VORSICHT) in einzelne Brunnen in einem dunklen/schwachlichten Bereich geben und bei 21 °C 8 h im Dunkeln lagern. HINWEIS: Coelentrazin ist eine prothetische Gruppe, die an Apo-Aequorin bindet und es zu funktionellem Aequorin umbildet. Coelentrazin ist lichtempfindlich und wird daher in dunkel gefärbten Flaschen gelagert, die vor Licht geschützt sind.</li>
	<li>Führen Sie am nächsten Tag einen mutierten Bildschirm mit 10 mM H2O2 als Stimulus aus und messen Sie die anschließende Ca2+-Antwort. </li>
	<li>Für die gleichzeitige Messung von 24 Bohrwerten können Sie ein automatisiertes kinetisches Programm erstellen, das den Hintergrund für 1 min misst, gefolgt von Reizzugabe (40 l) und Messung für 10 min, gefolgt von einer Gesamtaquorinentladung (2 M CaCl2 in 150 l 20% Ethanol) für 1-2 min. ANMERKUNG: Zur Quantifizierung des gemessenen Ca2+ und als zusätzliche Kontrolle für funktionelles Aequorin ist eine Endentladung für das gesamte Aequorin erforderlich. Die Endentladung ist eine kurze Laufzeit von 1-2 min und verursacht keinen signifikanten Pflanzentod. Alternativ können die Pflanzen nach dem Entladungsschritt absterben, dann die spezifische M1-Leitung erneut abschirmen und ohne Entladung retten. Solche Mutanten können in M3- und M4-Generationen mit dem Entladungsschritt bestätigt werden.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Scanmethode im 24-Well-Format, die jede Zeile im 7-s-Intervall mit 300 ms Integrationszeit pro Messpunkt misst. Verwenden Sie einen Wildtyp sämungsmittel als Steuerelement in jeder Zeile für den Vergleich und die Auswertung der Mutante. HINWEIS: Eine einzelne 96-Well-Platte mit M2 Sämlingen deckt 8 einzelne M1-Linie (8 M1*12= 96 M2) ab und kann in 2,5 h gesiebt werden und jeden Tag würden 32 M1 Linien gesiebt, 640 M1 Pflanzen pro Monat. Das gesamte Screening-Verfahren, nachdem die Pflanzen fertig sind, würde etwa 8 Monate dauern.</li>
	<li>Identifizieren Sie Mutanten basierend auf dem Verlust oder reduzierten Ca2+ Antwort mit H2O2. Retten Sie die ausgewählten Mutanten durch einen antibiotischen Waschprozess. Waschen Sie den Sämling mit 25 mg/L Cefotaxame Lösung zweimal und dann auf Rettungsmedium übertragen, das 25 mg/L Cefotaxme in 1/2 MS Agar enthält.</li>
	<li>Wachsen Sie die Platten bei einem 10 h Licht / 14 h dunkle Photoperiode, um eine mutierte Pflanze zu erhalten. Die Cefotaxame-Waschanlage hilft, schädliche Mikroorganismen am Sämling zu entfernen. Da die Sämlinge nach der Rekonstitution unversiegelt gehalten werden, minimieren Sie die Kontamination, wenn sie wieder in einen sterilen Zustand zurückversetzt werden.</li>
	<li>Übertragen Sie die mutierte Pflanze auf den Boden, um die homozygote M3-Population zu erhalten.</li>
</ol>3. Datenanalyse und Mutantenidentifikation (1-3 Monate)
HINWEIS: Die Messwerte der obigen Methode sind in relativen Lichteinheiten (RLU) angegeben.
<ol><li>Für die Berechnung der [Ca2+]Zytkonzentration verwenden Sie die folgende Konzentrationsgleichung20. pCa = 0,332588(-log (L/Lmax))+ 5,5593 Lumineszenzzählungen () und gesamtzahlshaltig (max ).</li>
	<li>Konvertieren Sie die erhaltenen pCa-Werte in [Ca2+]Cyt-Werte in M, indem Sie mit 106multiplizieren. Dann grafisch gegen eine Aequorin (transgene Col-0 aequorin) Steuerung zur Identifizierung vonvermeintlichenH 2 O2 Mutanten auf Ca2+ Antwort.</li>
	<li>Rettungssämlinge, die einen Verlust oder eine reduzierte Reaktion auf H2O2 Anwendung gerettet zeigen.</li>
	<li>Nach der Reifung Samen von der geretteten Mutante ernten und auf H2O2 in M3 Sämlinge reagieren. Wenn alle 12 M3 Sämlinge eine Ca2+-Antwort aufweisen, die der Mutterpflanze ähnelt, betrachten Sie die Population als eine homozygote M3-mutierte Population. Wenn alle 12 Sämlinge nicht eine solche Antwort zeigen, dann nehmen Sie sie zu M4 Generation und re-screen, um homozygote Bevölkerung zu erhalten.</li>
	<li>Sobald eine homozygote Pflanzenlinie erhalten wurde, identifizieren Sie das Gen, das zu einem veränderten Phänotyp führt, indem Sie die Nächste Generation sequenzieren.</li>
</ol>

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<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+sensor+HPCA1+is+an+LRR+receptor+kinase+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis.</a> Nature. 578, 577-581 (2020).</li>
</ol>

Keiner der Autoren hat Interessenkonflikte zu erklären.

EMS-Mutagenese ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Mutationen in der Population zu erzeugen. Die klassischen Vorwärts-Gen-Screens, die EMS verwenden, waren aus zwei Hauptgründen ein wirksames Instrument, um neuartige Gene zu identifizieren: Erstens erfordern sie keine vorherigen Annahmen über die Genidentität, und zweitens führen sie keine Verzerrung ein. Es gibt mehrere Methoden, um ein Screening-Populationen wie EMS, T-DNA-Einfügungen, Strahlungen usw. zu erzeugen. Von allen Methoden hat die EMS-basierte Mutagenese n...

Eine Veränderung der zytosolischen Kalziumkonzentration (Ca2+)bei wahrnehmungsgemäßem biotischem oder abiotischem Reiz ist ein gut untersuchtes frühentwickeltes Signalereignis, das viele Signalwege1,2,3,4aktiviert. Eine Zelle in ihrem basalen Ruhezustand behält eine niedrigere Ca2+-Konzentration im Cytosol und Sequester-Überschuss Ca2+ in verschiedenen intrazellulären Organellen und extrazellulären Apoplasten bei, was zu einem steilen Ca2+ Gradienten5,6führt. Bei der Signalwahrnehmung steigen ca2+-Spiegel im Cytosol aufgrund eines Zustroms von Ca2+ aus extrazellulären und/oder intrazellulären Quellen und erzeugen eine Reize spezifische Calciumsignatur7,8,9. Ca2+ Höhen im Cytosol werden durch viele Reize aktiviert, aber spezifität wird durch verschiedene Speicher, die Ca2+,eine einzigartige Ca2+ Signatur und geeignete Sensorproteine10,11.
Die Verwendung von Alkylierungsmittel, Ethylmethansulfonat (EMS) für die Mutagenese, ist ein leistungsfähiges Werkzeug in klassischen vorwärtsgenetischen Bildschirmen, um mehrere unabhängige Gene zu identifizieren, die an einem Prozess beteiligt sind. EMS ist ein chemisches Mutagen, das hauptsächlich C bis T und G zu A überführt, nach dem Zufallsprinzip im gesamten Genom übergeht und eine Veränderung von 1 bp in jedem 125 kb des Genoms erzeugt. Die EMS-Mutagenese induziert 1000 Einzelbasispaaränderungen, entweder Insertion/Deletionen (InDel) oder Single Nukleotide Polymorphism (SNP) pro Genom12. EMS-induzierte Mutationen sind mehrfache Punktmutationen mit einer Mutationshäufigkeit von 1/300 bis 1/30000 pro Ort. Dies reduziert die1 Anzahl der M 1-Pflanzen, die benötigt werden, um eine Mutation in einem bestimmten Gen zu finden. Ein M 1-Saatgut-Bevölkerungsbereich von 2000-3000 wird in der Regel verwendet, um Mutationen von Interesse in Arabidopsis thaliana13,14zu erhalten.1
Aequorin-Transgenen sind Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) Ökotyp-Pflanzen, die p35S-Apoaequorin (pMAQ2) im Cytosol15exdrücken. Aequorin ist2+ ein Ca 2+-Bindungsprotein, das aus Apoprotein und einer prothetischen Gruppe besteht, die aus Luziferinmolekül Coelenterazin besteht. Die Bindung von Ca2+ an Aequorin, das drei Ca2+ bindende EF-Hands-Standorte hat, führt dazu, dass Coelenterazin oxidiert und gecyclt wird, um das Dioxetanon-Zwischenprodukt zu erhalten, gefolgt von einer konformen Veränderung des Proteins, begleitet von der Freisetzung von Kohlendioxid und Singlet-erregtem Coelenteramid16. Das so erzeugte Coelenteramid strahlt einmaxblaues Licht aus, das durch das Leuchtkraftmesser17erfasst werden kann. Die extrem schnellen Ca2+ Höhen können so in Echtzeit gemessen und für schnelle vorwärts gerichtete genetische Abschirmungen genutzt werden. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Spezifität der Kalzium-Antwort zu nutzen, um neue Schlüsselakteure zu identifizieren, die an der Ca2+-Signatur beteiligt sind. Um diese Aufgabe zu erfüllen, verwenden wir EMS-Mutagenese in transgenem Aequorin und identifizieren die SNPs, die mit veränderter Ca2+-Signalisierung verbunden sind. Das Protokoll identifiziert Mutanten, die keine oder reduzierte Ca2+-Höhen bei Anuleaddition aufweisen. Diese Mutanten können dann kartiert werden, um die Gene zu identifizieren, die für die Ca2+-Antwort verantwortlich sind. Die Methode ist auf jede Art von flüssigen Reizen in Pflanzen anwendbar, die zu einer Ca2+ Höhe führt. Da ca2+ Höhe eine der ersten Reaktionen in der Pflanzenabwehr Signalweg ist, kann die Identifizierung von vorgelagerten Reaktionskomponenten Kandidaten für die Gentechnik liefern, um widerstandsfähige Pflanzen zu entwickeln.

<table><tbody><tr><td>24-Well-Gewebekulturplatte</td><td>Jetbiofil</td><td>11024</td><td>für den Anbau von Sämlingen</td></tr><tr><td>96-Well-Weiß-Cliniplate</td><td>Thermo Scientific</td><td>9502887</td><td>für Luminometer-Messungen</td></tr><tr><td>Aequorin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agropet</td><td>Lab Chem India</td><td></td><td>für das Pflanzenwachstum</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>12135</td><td>für die Entleerung Lösung</td></tr><tr><td>Coelenterazin</td><td>PJK</td><td>55779-48-1</td><td>Prothesengruppe für Aequorin</td></tr><tr><td>Ehtylmethansulfonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0880-5G</td><td>für die Samenmutagenese</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Analysereagenz</td><td>1170</td><td>für die Entladungslösung</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Merck Life Sciences</td><td>1.93001.0521</td><td>Versterlungslösung</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>15465</td><td>als Stimulus für die Kalziumerhöhung</td></tr><tr><td>Luminoskan-Aufstieg</td><td>Thermo Scientific</td><td>5300172</td><td>Aequorin-Lumineszenzmessung</td></tr><tr><td>MES-Puffer</td><td>Himedia</td><td>RM1128-100G</td><td>Pflanzenwachstum</td></tr><tr><td>Murashige und skoog media</td><td>Himedia</td><td>PT021-25L</td><td>Pflanzenwachstum</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>27805</td><td>zur Neutralisierung EMS</td></tr><tr><td>Natriumhypochlorit</td><td>Merck Life Sciences</td><td>1.93607.5021</td><td>Versterlungslösung</td></tr><tr><td>Natriumthiosulfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>28005</td><td>zum Waschen von Saatgut in Schritt 1.6</td></tr><tr><td>soilrite</td><td>Lab Chem India</td><td></td><td>für das Pflanzenwachstum</td></tr><tr><td>Quadrattöpfe</td><td>Lab Chem India</td><td></td><td>für das Pflanzenwachstum</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td>Pflanzenwachstum</td></tr><tr><td>Taxim</td><td>Alkem</td><td>7180720</td><td>zur Rettung von Sämlingen</td></tr></tbody></table>

forward genetic screen mit transgenem calciumreporter aequorin, um neuartige ziele bei der calciumsignalisierung zu identifizieren

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Vorwärtsgenetische Screens waren wichtige Werkzeuge bei der unvoreingenommenen Identifizierung genetischer Komponenten, die an mehreren biologischen Pfaden beteiligt sind. Die Grundlage des Bildschirms ist es, eine mutierte Population zu erzeugen, die mit einem Phänotyp von Interesse gescreent werden kann. EMS (Ethylmethansulfonat) ist ein häufig verwendetes Alkylierungsmittel zur Induktion zufälliger Mutation in einem klassischen Vorwärts-Genbild, um mehrere Gene zu identifizieren, die an einem bestimmten Prozess beteiligt sind. Zytosololische Kalzium (Ca2+) Höhe ist ein wichtiger früher Signalweg, der bei der Stresswahrnehmung aktiviert wird. Die Identität von Rezeptoren, Kanälen, Pumpen und Transportern von Ca2+ ist jedoch in vielen Studiensystemen noch immer schwer fassbar. Aequorin ist ein zelluläres Kalziumreporter-Protein, das aus Aequorea victoria isoliert und stabil in Arabidopsis exprimiert wird. Unter Ausnutzung dieser, haben wir einen vorwärts genetischen Bildschirm entworfen, in dem wir EMS-mutagenisiert die Aequorin transgen. Die Samen der mutierten Pflanzen wurden gesammelt (M1) und screening für den Phänotyp von Interesse wurde in der Segrekung (M2) Population durchgeführt. Mit einem 96-Well-High-Throughput Ca2+ Messprotokoll können mehrere neuartige Mutanten identifiziert werden, die eine unterschiedliche Kalziumantwort haben und in Echtzeit gemessen werden. Die Mutanten mit dem Phänotyp von Interesse werden gerettet und vermehrt, bis eine homozygote mutierte Pflanzenpopulation gewonnen wird. Dieses Protokoll bietet eine Methode für vorwärtsgerichtete genetische Bildschirme im Ca2+-Reporterhintergrund und identifiziert neuartige Ca2+ regulierte Ziele.

Die EMS-Population wurde auf H2O2 induzierte Ca2+ Höhe untersucht. Wie bereits erwähnt, wurden aus jeder M1-Linie 12 einzelne M2 Sämlinge gescreent. In Abbildung 3wird eine solche M1-Linie mit jedem Panel dargestellt, das 12 einzelne M2 Sämlinge zeigt. Ein Wildtyp-Aequorin wird als Steuerung für den Vergleich und die Bewertung der mutierten Reaktion verwendet. Eine rezessive Mutante trennt sich im Verhältnis 1:7 (Mu...

Ein vorwärtsgerichteter genetischer Screen, der auf der Ca2+-Höhe als Auslese basiert, führt zur Identifizierung genetischer Komponenten, die an kalziumabhängigen Signalwegen in Pflanzen beteiligt sind.

Forward Genetic Screen Mit transgenem CalciumReporter Aequorin, um neuartige Ziele bei der Calciumsignalisierung zu identifizieren

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

Ziel dieses Protokolls ist es, eine Methode zu identifizieren, die zur Identifizierung neuartiger Gene verwendet werden kann, die an der Calciumsignalisierung beteiligt sind. Dazu verwenden wir den klassischen vorwärts genetischen Bildschirm. Calciumsignalisierung ist ein wichtiger Abwehrweg in mehreren Anlagensystemen.Um die Gene zu identifizieren, die an diesem Pfad beteiligt sind, haben wir den klassischen vorwärtsgenetischen Bildschirm verwendet. Bei dieser Methode würde EMS als Alkylierungsmittel verwendet werden, um zufällige Mutationen in den Pflanzensystemen einzuführen. Die entwickelte Mutantengeneration kann dann zum Screening auf einen Phänotyp von Interesse verwendet werden.Sobald der Phänotyp von Interesse identifiziert wurde, kann das kausale Gen kartiert werden. In dieser Studie verwenden wir die Modellpflanze Arabidopsis, die den Kalziumreporter Aequorin im Spektrum hat. Wiegen Sie 150 mg Samen von Aequorin für EMS-Mutagenese und weitere 150 mg Samen zur Kontrolle.Die Samen in eine 50 ml Falcon-Röhre geben und 2%EMS oder autoklaviertes Wasser hinzufügen. Seien Sie bei der Verwendung von EMS vorsichtig, da es krebserregend ist. Schutzausrüstungen sollten während der Verwendung von EMS getragen werden und jede Art von Verschüttung sollte verhindert werden.Versiegeln Sie die Falcon-Rohre mit Paraffin und wickeln Sie sie mit Aluminiumfolie. Drehen Sie das Rohrende bei Raumtemperatur 18 Stunden lang über das Ende. Lassen Sie die Samen die EMS-Lösung sorgfältig absetzen und entfernen und entsorgen Sie sie in einem Abfallbehälter, der einen Mol NaOH enthält.Waschen Sie die mutagenisierten Samen mindestens achtmal mit 40 ml autoklaviertem Wasser. Für die Endwäsche 100 Millimolar Natriumthiosulfat hinzufügen und mindestens dreimal ausspülen, um Emsspuren zu entfernen. Die Samen in 40 ml autoklaviertem Wasser für eine Stunde einweichen, um EMS aus den Samen zu diffundieren und dann auf Whatman-Papier zu legen, bis es vollständig trocken ist.Die Samen nach Eppendorf geben und bei vier Grad Celsius für zwei bis vier Tage zur Schichtung brüten. Übertragen Sie sowohl die mutagenisierten Samen als auch die mit Wasser behandelten Samen auf den Boden und übertragen Sie sie in Wachstumsräume mit 16-stündigem Licht und achtstündiger dunkler Fotoperiode bei 22 Grad Celsius und 70 % relativer Luftfeuchtigkeit. Um festzustellen, ob die Mutagenese erfolgreich war, suchen Sie nach Chlorophyll-Sektor.Wir haben die einzige Stammbaum-basierte Saatgut-Sammlungsmethode verwendet und jede M1-Pflanze erhält eine eindeutige Nummer. Nach der Reifung werden die Samen aus diesen einzelnen mutierten Pflanzen geerntet und als einzelne M1-Linien gelagert. Es wird ein Hochdurchsatz-Samensterilisations- und hydroponisches Pflanzenwurzelprotokoll verwendet, das von Ranf et al.Am ersten Tag legen Sie fast 12 bis 15 M2 Samen pro M1 eine Linie in einzelne Brunnen einer 24-Well-Gewebekulturplatte und sterilisieren mit Natriumhypochlorit und Salzsäurelösung im Verhältnis drei ist zu eins. Dadurch wird Chlorgas freigegeben, das die Samen sterilisiert. Lassen Sie die Platte für die Nacht, um das verbleibende Chlorgas vollständig zu verdampfen.Nach der Sterilisation halbfeste flüssige MS-Medien in einzelne Brunnen geben und die Samen zwei bis vier Tage bei vier Grad Celsius schichten und die Samen dann in eine Wachstumskammer mit einer Fotoperiode von 10 Stunden Licht und 14 Stunden Dunkelheit bei 22 Grad Celsius, 70% relative Luftfeuchtigkeit bewegen. Am 14. Tag, wenn die Sämlinge acht bis zwölf Tage alt sind, legen Sie 12 M2 Sämlinge aus jeder Linie einzeln in eine 96-Well-Leuchtkraftplatte. Nach dem Sämlingstransfer 150 Mikroliter der fünf mikromollaren Coelenterazin-Lösung in einzelnen Brunnen hinzufügen und acht Stunden bei 21 Grad Celsius im Dunkeln lagern.Coelenterazin ist eine prothetische Gruppe, die an Apoaequorin bindet, um funktionelles Aequorin zu bilden. Coelenterazin ist lichtempfindlich und wird daher in dunkel gefärbten, lichtgeschützten Flaschen gelagert. Am nächsten Tag werden Siebmutanten mit Wasserstoffperoxid als Stimulus verwendet und die anschließende Kalziumhöhe gemessen.Für die gleichzeitige Messung von 24 Bohrwerten wird ein automatisiertes kinetisches Programm erstellt, das eine Minute lang den Hintergrund misst, gefolgt von Stimulusaddition und Messung für 10 Minuten, gefolgt von einer Entladungsinjektion 150 Mikroliter und einer Messung für drei bis fünf Minuten. Und jede Entladung für die Tochter Aequorin würde in den Messwert einbezogen werden, um das gemessene Kalzium zu quantifizieren und als zusätzliche Kontrolle für funktionelles Aequorin. Die von der obigen Methode bereitgestellten Messwerte sind in relativen Lichteinheiten angegeben.Für die Berechnung der zytosolischen Calciumionenkonzentration wird eine zuvor beschriebene Konzentrationsgleichung von Rental und Knight aus dem Jahr 2004 verwendet, die im Protokoll beschrieben wird. Die aus dem Luminometer gewonnenen RLUs werden der Gleichung zur Berechnung der Calciumionenkonzentration hinzugefügt. Die erhaltenen zytosolischen Calciumionenwerte werden dann grafisch gegen eine Wildtypkontrolle zur Identifizierung vermeintlicher Wasserstoffperoxid-Mutationen zur Kalziumreaktion dargestellt.Dies ist ein repräsentatives Ergebnis des gezeigten Protokolls. Wir haben eine M1-Linie mit 12 einzelnen Sämlingen gezeigt, die auf die Erhöhung der Calciumionenkonzentration gemessen wurden. Die grüne Linie im Diagramm zeigt Wildtyp-Aequorin an, das zusammen mit Mutanten gemessen wurde.Rot ist der Durchschnitt aller 12 Sämlinge, und schwarze Linie ist einzelne M2 Sämlinge für die Calciumionenhöhe gemessen. Saatgut, das eine stark reduzierte Reaktion auf die Wasserstoffperoxidanwendung zeigt, wird dann gerettet. Gerettete Mutanten werden dann in der nächsten Generation bestätigt, gefolgt von kartierung, um kausale Gene zu identifizieren.Vorsicht ist geboten, wenn EMS als Mutagen verwendet wird, da es ein karzinogenes ist. Die Schutzausrüstung sollte jederzeit getragen werden, und jede Verschüttung sollte mit guten Laborpraktiken behandelt werden. Darüber hinaus sollten bei einer Stammbaum-basierten Samensammlung einzelne Pflanzen mit größter Sorgfalt geerntet werden, damit es zu keinem Zeitpunkt eine Vermischung von Samen gibt.Dies wird einem helfen, zurückzugehen und die Mutterpflanze zu verfolgen, die die homozygote mutierte Pflanze ist. Da diese Methode keine Verzerrungen oder vorausgegangene Annahmen in die Screening-Methode einführt, kann sie für eine oder mehrere Bedingungen verwendet werden, um einen Phänotyp von Interesse zu identifizieren. Darüber hinaus konnten mehrere unabhängige Gene mit demselben Protokoll identifiziert werden.Das Protokoll ist einfach zu bedienen, da mit der kleinen Dosierung eine große Anzahl von Pflanzen mutagenisiert werden kann. Diese große Anzahl von mutierten Pflanzen kann für mehrere Populationen und für mehrere Bedingungen verwendet werden und mehrere Gene zu identifizieren. Durch diese Methode kann ein partieller Funktionsverlust, eine veränderte Funktion, ein vollständiger Funktionsverlust oder auch eine konstitutive Genfunktion identifiziert werden.Die Zuordnung sollte angesichts der Weiterentwicklung der Mapping-Technologien in den aktuellen Szenarien eine einfache Aufgabe sein. Ein de novo-basiertes Kartierungssystem, ein SNP-basiertes rassisches Plotten und viele andere können verwendet werden, um das kausale Gen zu identifizieren, das den Phänotyp von Interesse verursacht. Angesichts der Anwendbarkeit dieser Methode kann sie nicht nur auf den Arabidopsis-Modellpflanzen verwendet werden, sondern auch auf anderen Modellpflanzen, sofern ein Phänotyp der Interessenanzeige festgestellt werden kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video stellt die Konzepte hinter der Kalziumbildgebung vor und enthält ein Beispielprotokoll für die Zeitrafferbildgebung von Würmern, die in geformten Agarose-Vertiefungen enthalten sind.

Calcium Imaging: Eine Methode zur Visualisierung der neuronalen Aktivität in lebenden C. elegans

Mit seinem kleinen transparenten Körper, gut dokumentierte Neuroanatomie und einer Vielzahl von zugänglicher genetischen Techniken und...

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

Die hier beschriebene Fluoreszenz-basierten Calciummobilisierungsassay ist ein Medium-Durchsatz Rückwärts pharmakologischen Screening-System für die Identifizierung von funktionell aktivierenden Liganden (n) der Orphan-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs).

Charakterisierung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren durch eine Fluoreszenz-basierte Calciummobilisierungsassay

Hier präsentieren wir eine neuartige Ca 2+ -Imaging Ansatz unter Verwendung eines Biolumineszenz Reporter. Dieser Ansatz verwendet einen fusionierten Konstrukts GFP-Aequorin, das Ca 2+ bindet und emittiert Licht, wodurch die Notwendigkeit für Lichtanregung. Deutlich Dieses Verfahren ermöglicht lange kontinuierliche Bildgebung, Zugang zu tiefen Hirnstrukturen und hoher zeitlicher Auflösung.

In Vivo Functional Brain Imaging Ansatz, der auf Bioluminescent Calciumindikator GFP-Aequorin

Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz von genetisch codierte Ca2 + Reporter Datensatzänderungen in neuronale Aktivität im Verhalten Caenorhabditis Elegans Würmer.

Ratiometrischen Kalzium Imaging einzelner Neuronen im Verhalten Caenorhabditis Elegans

Wir beschreiben Ansätze für die Manipulation von Genen im evolutionären Modellsystem Astyanax Mexicanus. Drei verschiedene Techniken beschrieben: Tol2-vermittelte Transgenese, gezielte Manipulation des Genoms mit CRISPR/Cas9 und Zuschlag des Ausdrucks mit Morpholinos. Diese Tools sollten die direkte Untersuchung von Genen zugrunde liegen die Unterschiede zwischen Oberfläche und höhlenbewohnenden Formen erleichtern.

Manipulation der Genfunktion in mexikanischen Cavefish

Wir präsentieren ein zweiteiliges Protokoll, das fluoreszierende Calcium-Bildgebung mit In-situ-Hybridisierung kombiniert, so dass der Experimentator Muster der Calciumaktivität mit Genexpressionsprofilen auf einzelzelligem Niveau korrelieren kann.

Fluoreszierende Calcium-Bildgebung und anschließende In-Situ-Hybridisierung zur neuronalen Vorläufercharakterisierung bei Xenopus laevis

Wir beschreiben hier die Einrichtung und Anwendung einer Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (unten als αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 bezeichnet) Maus-Reporterlinie zur Beurteilung der kardialen Reprogrammierung. Neonatale kardiale Fibroblasten (NCFs), die aus dem Mausstamm isoliert wurden, werden in induzierte Kardiomyozyten (iCMs) umgewandelt, was eine bequeme und effiziente Bewertung der Reprogrammierungseffizienz und der funktionellen Reifung von iCMs über den...

In-vitro-Beurteilung der kardialen Reprogrammierung durch Messung des kardialspezifischen Calciumflusses mit einem GCaMP3-Reporter

Das vorliegende Protokoll beschreibt die rein optische Kontrolle und Beobachtung der ausgelösten zellulären Aktivität in iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten (iPSC-CMs) für Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening und Toxizitätstests. Multiparametrische Quantifizierung phänotypischer Muster in Zeit und Raum werden gezeigt. Langzeitwirkungen von Medikamenten über Stunden oder sequentielle Messungen über Tage werden nachgewiesen.

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In dieser Arbeit wird ein intrazellulärer Hochdurchsatz-Calciumfluoreszenz-Assay für 384-Well-Platten beschrieben, um kleine Molekülbibliotheken auf rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) zu screenen. Das Ziel, der Kinin-Rezeptor aus der Rinderpestzecke Rhipicephalus microplus, wird in CHO-K1-Zellen exprimiert. Dieser Assay identifiziert Agonisten und Antagonisten unter Verwendung der gleichen Zellen in einem "Dual-Addition"-Assay.

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Netzhautprothesen haben die Fähigkeit, visuelle Wahrnehmungen zu erzeugen. Um die Entwicklung neuer Prothesen voranzutreiben, werden Ex-vivo-Methoden benötigt, um Geräte vor der Implantation zu testen. Dieser Artikel bietet ein umfassendes Protokoll zur Untersuchung der Kalziumaktivität in der retinalen Ganglienzellschicht bei elektrischer Stimulation.

Kalzium-Bildgebung bei elektrisch stimulierten, flach montierten Netzhäuten

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Forward Genetic Screen Mit transgenem CalciumReporter Aequorin, um neuartige Ziele bei der Calciumsignalisierung zu identifizieren (Video) | JoVE Journal

Forward Genetic Screen Mit transgenem CalciumReporter Aequorin, um neuartige Ziele bei der Calciumsignalisierung zu identifizieren

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