Name: Vor-Ort-Probenahme und Extraktion von Hirntumoren für die Metabolomik- und Lipidomik-Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Lernen Sie die Vor-Ort-Probenahme von Hirntumoren mittels SPME für Metabolomik- und Lipidomik-Analysen. Diese Methode ermöglicht schnelle intraoperative Diagnostik und Biomarker-Identifizierung bei Gliomen und Meningiomen.

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Die Studie wurde durch das Stipendium Harmonia 2015/18/M/ST4/00059 vom National Science Centre unterstützt. Die Autoren möchten MilliporeSigma, ein Unternehmen der Merck KGaA, Darmstadt, für die Bereitstellung der in dieser Arbeit verwendeten SPME-Geräte würdigen. Das Life-Science-Geschäft von Merck firmiert als MilliporeSigma in den USA und Kanada. Außerdem möchten die Autoren Thermo Fisher Scientific für den Zugang zum Q-Exactive Focus Orbitrap-Massenspektrometer danken.
Beiträge der Autoren: JB: Optimierung der Probenvorbereitung und LC-MS-Parameter, Durchführung von SPME-LC-MS-Experimenten, Datenanalyse, statistische Analyse und Dateninterpretation und Manuskriptvorbereitung im Zusammenhang mit Lipidomik-Teil; PZG: Koordination und Durchführung der meisten Stichproben im Krankenhaus, Optimierung der Parameter für die Probenahme und Probenvorbereitung, Durchführung von SPME-LC-MS-Experimenten, Datenanalyse, statistische Analyse und Dateninterpretation, Manuskriptvorbereitung im Zusammenhang mit Metabolomik Teil; MG – Unterstützung bei der Optimierung der Probenvorbereitung, LC-MS-Methode und Datenanalyse im Zusammenhang mit Lipidomik-Teil; KG: Ko-Performance von SPME-Probenundproben und Optimierung der Probenahme und Probenvorbereitung, SPME-LC-MS-Analyse im Zusammenhang mit Metabolomik-Teil; KC: Durchführung mehrerer SPME-Proben im Krankenhaus, Unterstützung bei der Optimierung der Probenahme, Probenvorbereitung und Datenanalyse im Zusammenhang mit metabolomics Teil; KJ: Durchführung mehrerer SPME-Proben im Krankenhaus, Unterstützung bei der Lipidomik-Analyse; DP: Durchführung chirurgischer Eingriffe, Rekrutierung der Patienten; JF: Durchführung chirurgischer Eingriffe, Rekrutierung der Patienten; MH: Durchführung chirurgischer Eingriffe, Koordination des klinischen Teils der Forschung; BB: Konzept, Koordinationsüberwachung des Projekts und Manuskriptvorbereitung, Durchführung mehrerer Stichproben

Die hier vorgestellte Studie wurde vom Bioethik-Komitee des Collegium Medicum in Bydgoszcz an der Nicolaus-Kopernikus-Universität in Torua genehmigt (KB 628/2015). Denken Sie daran, immer einen Labormantel und andere erforderliche persönliche Sicherheitsausrüstung zu tragen, wie (aber nicht beschränkt auf) Sicherheitshandschuhe und Brille. Berühren Sie nicht die Extraktionsphase der Staus-Mikroextraktions-Sonden (SPME).
1. Vorbereitung der SPME-Geräte
<ol><li>Verwenden Sie Sonden (Fasern) mit Mixed-Mode- und C18-Beschichtungen für Metabolomik bzw. Lipidomik. Sammeln Sie zwei Sätze von Proben, eine für Metabolomik und eine für Lipidomik.</li>
	<li>Stellen Sie die Beschichtung der Sonde auf eine optimale Länge ein, indem Sie die SPME-Sonde beschneiden. In der aktuellen Studie betrug die gewählte Beschichtungslänge 7 mm. Wählen Sie die Länge der Faser entsprechend der Größe des untersuchten Tumors aus, um sicherzustellen, dass das gesamte Sorbens in den Tumor eingetaucht werden kann (Abbildung 1).</li>
	<li>Konditionieren Sie die Beschichtungen der Sonden, indem Sie sie in Methanol einweichen: Wasser 50:50 v/v Mischung für einen Mindestzeitraum von 1 h vor dem Extraktionsverfahren. Transport von Fasern zum Entnahmeort (z. B. Krankenhaus) in einer Durchstechflasche mit der Konditionierungslösung.</li>
</ol>2. Mustererhebungsverfahren
<ol><li>Waschen oder entsetzen Sie den Tumor vor der SPME-Extraktion in keiner Weise.</li>
	<li>Beginnen Sie die Probenahme so schnell wie möglich nach der Tumorentfernung (2 min in der vorgestellten Studie). HINWEIS: Passen Sie die Zeit in Abhängigkeit von der Vor-Ort-Einrichtung für eine bestimmte Einrichtung an (Entfernung der Arbeitsstelle des Forschers vom Operationstisch) und halten Sie sie für die gesamte Studie konstant. Die Minimierung der verstrichenen Zeit zwischen der Tumorentfernung und dem Beginn der Extraktion ist entscheidend für die Erfassung instabiler Metaboliten, die sich verschlechtern, nachdem die Durchblutung vom untersuchten Gewebe abgeschnitten wurde.</li>
	<li>Durchführen der Probenahme bei Raumtemperatur. Alternativ können Sie die Probe bei der Extraktion auf Eis legen. In beiden Fällen gelten die gleichen Bedingungen für den gesamten Satz von Proben.</li>
	<li>Nehmen Sie die Sonde aus der Durchstechflasche.</li>
	<li>Waschen Sie Fasern mit Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC/MS) Grade Wasser für 5 s durch Eintauchen in LC/ MS-Grade-Wasser. Lassen Sie das Sorbengungsboot nicht vor dem Einsetzen der Faser trocknen, um eine gute Reproduzierbarkeit der Daten zu gewährleisten.</li>
	<li>Setzen Sie die Fasern so weit wie möglich in das Hirntumorgewebe ein, um sicherzustellen, dass sich die gesamte Extraktionsphase im Inneren des Tumors befindet. HINWEIS: Es wird empfohlen, Extraktionen in Replizieren durchzuführen, um die Heterogenität des Tumors zu bestimmen (Abbildung 2). Es werden drei Replikationen pro Probe empfohlen.</li>
	<li>Lassen Sie die Sonde 30 min im Gewebe (gemessen mit einem Timer).</li>
	<li>Verwenden Sie leere Steuerelemente, um Fehlerquellen im Zusammenhang mit dem Vorhandensein von Artefakten zu beseitigen, die aus anderen Quellen als dem untersuchten Tumor stammen. Um leere Steuerelemente zu erhalten, unterwerfen Sie Fasern dem gleichen analytischen Workflow, wie oben beschrieben, jedoch ohne den Probenahmeschritt (Einfügung in das Gewebe oder eine andere Probe/Matrix). Im Datenverarbeitungsschritt kompilieren Sie die aus diesen Fasern extrahierten Analyten in eine "Ausschlussliste", um Signale auszuschließen, die von Verunreinigungen aus Lösungsmitteln oder der Faserherstellung stammen. Es wird empfohlen, mindestens 3 Wiederholungen von Leerzeichen zu verwenden. HINWEIS: Um das Kontaminationsrisiko zu überprüfen, ist es notwendig, Proben von Handschuhen, Tischen, Geräten oder anderen Oberflächen durchzuführen, die ein Kontaminationsrisiko darstellen können. In solchen Fällen sind faservorbereitungs-, Extraktionszeitpunktunde und Desorptionsprotokolle die gleichen wie bei den Proben.</li>
	<li>Während der Extraktion die Fläschchen, die für die Lagerung der Sonden nach der Extraktion verwendet werden, kennzeichnen.</li>
	<li>Nach 30 min entfernen Sie Fasern aus dem Hirntumor.</li>
	<li>Waschen Sie Fasern mit Wasser für 3 s, indem Sie sie in LC/MS-Grade-Wasser eintauchen, um Rückstände von Blut oder Zellablagerungen von der Sonde zu entfernen, so dass der endgültige Extrakt nur kleine Moleküle enthält. Ein längerer Waschschritt wird nicht empfohlen, da er zum Verlust polarer Verbindungen führen kann.</li>
	<li>Immobilisieren Sie die Fasern in der vorgeschlitzten Septa der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) Durchbohrung der Septa von unten mit dem nicht beschichteten Ende der Faser.</li>
	<li>Legen Sie die Fasern immobilisiert in die Kappe in separaten HPLC-Fläschchen und legen Sie sie in den ausgewählten Transportbehälter.</li>
	<li>Führen Sie die Schritte 2.11-2.13 für Fasern aus, die für leere Steuerelemente bestimmt sind.</li>
</ol>3. Transport und Lagerung
HINWEIS: Für den Transport von Proben ins Labor stehen mehrere Optionen zur Verfügung. Es wird empfohlen, eine flüssige Stickstoff-Dewar- oder Polystyrol-Box, die mit Trockeneis gefüllt ist, für den Transport zu verwenden; Alternativ können Eispackungen für den sofortigen und schnellen Transport verwendet werden.
<ol><li>Legen Sie die Fläschchen mit Fasern in den Transportbehälter.</li>
	<li>Bei der Ankunft im Labor fläschbar mit SPME-Fasern sofort in einen Gefrierschrank von -80 °C oder -30 °C geben. Fasern nicht länger als 3 Jahre bei -30 °C oder 5 Jahren bei -80 °C lagern.</li>
</ol>4. Probenvorbereitung für die Metabolomik-Analyse
HINWEIS: Dieser Schritt sollte nur ausgeführt werden, wenn alle Proben für ein Experiment gesammelt wurden.
<ol><li>Vor der instrumentellen Analyse desorptionlösungsmittelgemisch vorbereiten: Acetonitril:wasser 80:20 v/v.</li>
	<li>Nehmen Sie die Fläschchen mit den Gemischten Fasern aus dem Gefrierschrank heraus. Verwenden Sie diese für die Metabolomik-Analyse.</li>
	<li>Etikettenfläschchen, die zur Desorption verwendet werden.</li>
	<li>Pipette 300 l der Desorptionslösung (in Schritt 4.1) in Glaseinsätze in 2 ml Durchstechflaschen.</li>
	<li>Desorption von jeder Faser in einem separaten Einsatz platziert durchführen, indem Sie die Beschichtung vollständig in das Desorptionslösungsmittel eintauchen und sie dann 120 min bei 1.200 Rpm mit Wirbel aufrichten.</li>
	<li>Nach 120 min (sobald die Desorption abgeschlossen ist) Kappen mit Sonden entfernen.</li>
	<li>Bereiten Sie die QC-Probe vor, indem Sie 10 L-Aliquots jeder Probe aus dem Probensatz mischen. Die Größe des Stichprobensatzes hängt vom experimentellen Entwurf ab. Es ist wichtig, alle Proben als eine Charge zu analysieren.</li>
	<li>Schließen Sie die Fläschchen mit neuen Kappen.</li>
	<li>Legen Sie die Durchstechflaschen in den Autosampler (4 °C) des hochauflösenden Massenspektrometers (LC-HRMS) der Flüssigkeitschromatographie und bewegen Sie sich zu Schritt 5. HINWEIS: Randomize Injektionen Reihenfolge der Proben einschließlich Kontrollrohlinge. Injizieren Sie QC-Proben nach jeder 8-10 Probe, um die Stabilität des Geräts zu überwachen.</li>
</ol>5. Metabolomik-Analyse mit umgekehrter Phasenflüssigkeitschromatographie und hochauflösendem Massenspektrometer (RPLC-HRMS-Analyse)
<ol><li>Richten Sie die Parameter der LC-HRMS-Analyse und des positiven Ionisationsmodus ein. ANMERKUNG: Die parameter, die in der aktuellen Studie im positiven Modus verwendet wurden, waren wie folgt: Scanbereich: m/z 80-1000; Resolution 70 000; Erwerb mit AGC (1.000.000 Ionen); Injektionszeit in C-Trap: auto; Sprühspannung: 1,5 kV; S-Linse HF-Pegel: 55%; S-Linsenspannung: 25 V; Abschäumerspannung: 15 V; Kapillartemperatur: 300 °C; Mantelgas: 40 n.M.; aux gas: 15 u.; Gasheizungstemperatur: 300 °C. Diese chromatographische Methode wurde von Vuckovic et al.7adaptiert. Injektionsvolumen: 10 l.</li>
	<li>Richten Sie die Parameter der LC-HRMS-Analyse und des negativen Ionisationsmodus ein. ANMERKUNG: Die in der aktuellen Studie verwendeten Parameter im negativen Modus: Scanbereich: m/z 80-1000; Resolution 70 000; Erwerb mit AGC (1.000.000 Ionen); Injektionszeit in C-Trap: auto; Sprühspannung: 2,5 kV; S-Linse HF-Pegel: 55%; S-Linsenspannung: -25 V; Abschäumerspannung: -15 V; Kapillartemperatur: 256 °C Mantelgas: 48 a.u; aux gas: 11 u.; Gasheizungstemperatur: 413 °C. Diese chromatographische Methode wurde von Vuckovic et al.7übernommen. Injektionsvolumen: 10 l.</li>
	<li>Kalibrieren Sie das Gerät gemäß den Empfehlungen des Herstellers. HINWEIS: In der aktuellen Studie wurde das Gerät alle 48 h mit externer Kalibrierung kalibriert, was zu einer Massengenauigkeit von <2 ppm führte.</li>
	<li>Starten Sie die Analyse, indem Sie in der Software, die das Gerät bedient, auf die Schaltfläche Start klicken.</li>
	<li>Wenn die Analyse abgeschlossen ist, ersetzen Sie die RPLC-Spalte durch die HILIC-Spalte, ändern Sie die mobilen Phasen, und fahren Sie mit Schritt 6 fort.</li>
</ol>6. Metabolomik-Analyse mittels hydrophiler Wechselwirkungsflüssigkeitschromatographie und hochauflösendem Massenspektrometer (HILIC-HRMS-Analyse)
<ol><li>Richten Sie die Parameter der LC-HRMS-Analyse und des positiven Ionisationsmodus ein. ANMERKUNG: Die parameter, die in der aktuellen Studie im positiven Modus verwendet wurden, waren wie folgt: Scanbereich: m/z 80-1000; Resolution 70 000; Erwerb mit AGC (1.000.000 Ionen); Injektionszeit in C-Trap: auto; Sprühspannung: 1,5 kV; S-Linse HF-Pegel: 55%; S-Linsenspannung: 25 V; Abschäumerspannung: 15 V; Mantelgas: 60 n.M.; aux gas: 40 u.; Gasheizungstemperatur: 425 °C; Kapillartemperatur: 325 °C. Die chromatographische Methode wurde von Vuckovic et al.7adaptiert. Injektionsvolumen: 10 l.</li>
	<li>Richten Sie die Parameter der LC-HRMS-Analyse und des negativen Ionisationsmodus ein. ANMERKUNG: Die in der aktuellen Studie im negativen Modus verwendeten Parameter waren wie folgt: Scanbereich: m/z 80-1000; Resolution 70 000; Erwerb mit AGC (1.000.000 Ionen); Injektionszeit in C-Trap: auto; Sprühspannung: 1,3 kV; S-Linse HF-Pegel: 55%.; S-Linsenspannung: -25 V; Abschäumerspannung: -15 V; Kapillartemperatur: 263 °C; Mantelgas: 60 n.M.; aux gas: 30 u.v.; Gasheizungstemperatur: 425 °C. Die chromatographische Methode wurde von Vuckovic et al.7adaptiert. Injektionsvolumen: 10 l.</li>
	<li>Kalibrieren Sie das Gerät gemäß den Empfehlungen des Herstellers. HINWEIS: In der aktuellen Studie wurde das Gerät alle 48 h mit externer Kalibrierung kalibriert, was zu einer Massengenauigkeit von <2 ppm führte.</li>
	<li>Starten Sie die Analyse, indem Sie in der Software, die das Gerät bedient, auf die Schaltfläche Start klicken.</li>
</ol>7. Probenvorbereitung für die Lipidomik-Analyse
HINWEIS: Dieser Schritt sollte erst ausgeführt werden, wenn alle Proben für das Experiment gesammelt wurden.
<ol><li>Vor Beginn der Analyse desorptionslösungsmittelgemisch: Isopropanol:Methanol 50:50 v/v.</li>
	<li>Nehmen Sie die Fläschchen mit den C18-Fasern heraus, die für die Lipidomik-Analyse bestimmt sind, aus dem Gefrierschrank.</li>
	<li>Etikettenfläschchen, die zur Desorption verwendet werden.</li>
	<li>Pipette 200 l der Desorptionslösung (in Schritt 7.1) zu silanisierten Glaseinsätzen, die in 2 ml Fläschchen platziert werden. HINWEIS: Nicht-silanisierte Einsätze können auch verwendet werden, aber ihre Verwendung kann zu einer schlechten Reproduzierbarkeit von Verbindungen mit hohem logP führen, da solche Verbindungen nicht spezifisch an Glaswänden befestigt werden können.</li>
	<li>Desorption von jeder Faser in einem separaten Einsatz durchführen, indem Sie die Beschichtung vollständig in das Desorptionslösungsmittel eintauchen und sie dann 60 min bei 1.200 Umdrehungen pro Minute mit Wirbel aufrichten.</li>
	<li>Nach 60 min, wenn die Desorption abgeschlossen ist, entfernen Sie Kappen mit Sonden.</li>
	<li>Bereiten Sie die QC-Probe vor, indem Sie 10 L-Aliquots jeder Probe aus dem Probensatz mischen. Die Größe des Stichprobensatzes hängt vom experimentellen Entwurf ab. Es ist wichtig, alle Proben als eine Charge zu analysieren.</li>
	<li>Schließen Sie die Fläschchen mit neuen Kappen.</li>
	<li>Legen Sie die Durchstechflaschen in den Autosampler (4 °C) des hochauflösenden Massenspektrometers (LC-HRMS) der Flüssigchromatographie und bewegen Sie sich zu Schritt 8.</li>
</ol>8. Lipidomik-Analyse mittels umgekehrter Phasenflüssigkeitschromatographie und hochauflösender Massenspektrometrie (RPLC-HRMS-Analyse)
<ol><li>Richten Sie die Parameter der LC-HRMS-Analyse und des positiven Ionisationsmodus ein. ANMERKUNG: Die in der aktuellen Studie verwendeten Parameter im positiven Ionenmodus waren wie folgt: Scanbereich: m/z 100-1000; Erwerb mit AGC (1.000.000 Ionen); Injektionszeit in C-Trap: auto; Sprühspannung: 3,5 kV, S-Linse HF-Pegel: 55%; S-Linsenspannung: 25 V; Abschäumerspannung: 15 V; Kapillartemperatur 275 °C; Mantelgas: 30 n.M.; aux gas: 10 u.; Ersatzgas: 2 a.u.; Sondenheizungstemperatur 300 °C. LC-Parameter wurden verwendet: Phase A: Methanol:Wasser, 40:60 mit 10 mM Ammoniumacetat und 1 mM Essigsäure; Phase B: Isopropanol:Methanol, 90:10 mit 10mM Ammoniumacetat und 1 mM Essigsäure.; der Gradient: 0 min – 20% B; 1,0 min – 20% B; 1,5 min – 50% B; 7,5 min – 70% B; 13,0 Min. – 95% B; 17,0 Min. – 95% B; 17,1 Min. – 95,5 % B; 23.0 min – STOP; C18-Säule, 3,5 mm, 2,1 mm x 75 mm; Durchfluss: 0,2 ml/min; Ofentemperatur: 55 °C; Injektionsvolumen: 10 l.</li>
	<li>Richten Sie die Parameter der LC-HRMS-Analyse und des negativen Ionisationsmodus ein. HINWEIS: Die in der aktuellen Studie verwendeten Parameter waren wie folgt: HRMS-Parameter für den negativen Ionenmodus: Scanbereich: m/z 100-1000; Erwerb mit AGC (1.000.000 Ionen); Injektionszeit in C-Trap: auto; Sprühspannung: 3,5 kV, S-Linse HF-Pegel: 55%; S-Linsenspannung: -25 V; Abschäumerspannung: -15 V; Kapillartemperatur 275 °C; Mantelgas: 30 n.U.; aux gas: 10 u.; Ersatzgas: 2 u; Sondenheizungstemperatur 300 °C. Chromatographische Methode: wie in 8.1.</li>
	<li>Kalibrieren Sie das Gerät gemäß den Empfehlungen des Herstellers. HINWEIS: In der aktuellen Studie wurde das Gerät alle 48 h mit externer Kalibrierung kalibriert, was zu einer Massengenauigkeit von <2 ppm führte.</li>
	<li>Starten Sie die Analyse, indem Sie in der Software, die Ihr Instrument bedient, auf die Schaltfläche Start klicken.</li>
	<li>Wenn die Analyse abgeschlossen ist, ersetzen Sie die RPLC-Spalte durch die HILIC-Spalte, ändern Sie die mobilen Phasen, und fahren Sie mit Schritt 9 fort.</li>
</ol>9. Lipidomik-Analyse mittels hydrophiler Wechselwirkungsflüssigkeitschromatographie und hochauflösendem Massenspektrometer (HILIC-HRMS-Analyse)
<ol><li>Richten Sie die Parameter der LC-HRMS-Analyse und des positiven Ionisationsmodus ein. ANMERKUNG: Die in der aktuellen Studie verwendeten Parameter im positiven Ionenmodus waren wie folgt: Scanbereich: m/z 100-1000; Erwerb mit AGC (1.000.000 Ionen); Sprühspannung: 1,5 kV; S-Linse HF-Pegel: 55%; S-Linsenspannung: 25 V; Abschäumerspannung: 15 V; Kapillartemperatur 325 °C; Mantelgas: 60 n.M.; aux gas: 30 u.v.; Ersatzgas: 2 a.u.; Sondenheiztemperatur 320 °C. VERWENDETE LC-Parameter waren: Phase A: 5 mM Ammoniumacetat in Wasser; Phase B: Acetonitril; die Steigung: 0 – 2min – 4% B; 15,0 – 20 % B; 15.1 – 4% B, 21.0 min – STOP; 3 100 mm x 2,1 mm Säule; Durchfluss: 0,4 ml/min; Ofentemperatur: 40 °C; Injektionsvolumen: 10 l.</li>
	<li>Richten Sie die Parameter der LC-HRMS-Analyse und des negativen Ionisationsmodus ein. ANMERKUNG: Die in der aktuellen Studie verwendeten Parameter im negativen Ionenmodus waren wie folgt: Scanbereich: m/z 80-1000; Erwerb mit AGC (1.000.000 Ionen); Sprühspannung: 1,5 kV, S-Linse HF-Pegel: 55%; S-Linsenspannung: -25 V; Abschäumerspannung: -15 V; Kapillartemperatur 320 °C; Mantelgas: 50 n.M.; aux gas: 21 u.; Ersatzgas: 3 a.u.; Sondenheizungstemperatur 320 °C. Die chromatographische Methode war die gleiche wie in 9.1 beschrieben.</li>
	<li>Kalibrieren Sie das Gerät gemäß den Empfehlungen des Herstellers. HINWEIS: In der aktuellen Studie wurde das Gerät alle 48 h mit externer Kalibrierung kalibriert, was zu einer Massengenauigkeit von <2 ppm führte.</li>
	<li>Starten Sie die Analyse, indem Sie in der Software, die das Gerät bedient, auf die Schaltfläche Start klicken.</li>
</ol>10. Datenverarbeitung und statistische Analyse
<ol><li>Verarbeiten Sie Daten mithilfe einer Software, die mit dem Format der Rohdatendateien kompatibel ist.</li>
	<li>Führen Sie statistische Analysen mit den verarbeiteten Daten durch. HINWEIS: Die Art des Tests hängt von der wissenschaftlichen Hypothese und dem Design der Studie ab. In der aktuellen Studie wurden Principal Component Analysis, Partial-Least Square-Discriminant Analysis und One-Way ANOVA verwendet.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Ungezielte Metabolomik und Lipidomik werden häufig in Studien verwendet, die sich auf die Identifizierung von Tumorbiomarkern konzentrieren. In den meisten Fällen suchen die Forscher jedoch nach Verbindungen, die zum Screening der Krankheit verwendet werden können. Folglich sind die bevorzugten biologischen Proben Blut oder Urin aufgrund ihres relativ einfachen Zugangs. Die Analyse des Tumorgewebes wird hauptsächlich durchgeführt, um die Mechanismen hinter der Krankheit zu verstehen, verschiedene Tumortypen zu charakterisieren usw. Die Vor-Ort-Analyse von Tumorbiomarkern wird nur selten durchgeführt, da solche Anwendungen eine umfangreiche Probenvorbereitung erfordern. Alternativ verdienen Strategien, die auf der Echtzeitanalyse von Gewebeprofilen ohne Vorauswahl spezifischer Biomarker basieren, die Aufmerksamkeit der medizinischen Gemeinschaft3,4. Die hier vorgestellte Lösung bietet eine weitere Perspektive auf die Gewebeverarbeitung vor Ort, indem sie die Art von Informationen enthüllt, die mit solchen Methoden gewonnen werden können.
Die Kombination aus Probenahme, Probenvorbereitung und Extraktion macht SPME zu einem sehr nützlichen Werkzeug für die Vor-Ort-Analyse. Darüber hinaus ermöglicht der fehlende Gewebeverbrauch während der Probenahme die weitere Verwendung derselben Proben für Biomarkeranalysen und Routinetests (Genotypisierung, histologische Analyse), wodurch den Ergebnissen der Standardtests neue Informationen hinzugefügt werden. Das Probenahmegerät hat ein sehr einfaches Design, seine Bedienung ist sehr einfach, und es ist kein spezielles Training erforderlich, um die Extraktion selbst durchzuführen. Das Erreichen zuverlässiger Ergebnisse erfordert jedoch viel mehr als nur die ordnungsgemäße Handhabung von Geräten. Um das Experiment richtig durchführen zu können, muss man den Extraktionsprozess, die Art der Probe verstehen und sich möglicher Fehler bewusst sein, die die Daten beeinflussen können.
Es ist wichtig, die Heterogenität des Krebsgewebes zu berücksichtigen10; beprobte Tumoren können Teile enthalten, die einer Nekrose, Verkalkung und Hypoxie unterzogen werden, und jeder dieser Prozesse wird im metabolom und lipidom erreicht enthont, wodurch die Ergebnisse beeinflusst werden. Daher wird empfohlen, die räumliche Auflösungsprobenahme durch Einsetzen mehrerer Fasern in verschiedenen Teilen des Krebsgewebes durchzuführen, oder alternativ, dass eine längere Beschichtung verwendet wird, um den gesamten Tumor zu durchdringen, um gemittelte Informationen über den Tumor zu erhalten. Wenn die Probenahmemethode für die räumliche Auflösung durchgeführt wird, können Fasern alle in ein Desorptionslösungsmittel desorbieren werden; dies würde nicht nur die Erzielung von Gesamtinformationen über den Tumor ermöglichen, sondern auch die Empfindlichkeit der Analyse erhöhen. Alternativ würde die Desorption einzelner Fasern in separate Fläschchen es den Untersuchungen ermöglichen, die innere Vielfalt des Hirntumors, der aus dem aus Krebszellen gebauten Kern besteht, und der äußeren Zone, die die Grenze von gesundem Gewebe ist, herauszufinden. Tiefere Teile des Tumors sind in der Regel mehr durch die Prozesse im Zusammenhang mit Krebs11geschädigt. Die Ermittler müssen jedoch bedenken, dass diese Option die Methodsensitivität und die Gesamtzahl der nachweisbaren Verbindungen gefährdet. Bei den aktuellen Arbeiten wurde eine 7-mm-Beschichtung verwendet; diese Länge wurde als optimal für verschiedene Größen von Tumoren in der Studie enthalten. Die Beschichtungen drangen in die Tumore ein und lieferten somit eine nicht spezielle Auflösung, aber gemittelte Daten in der gesamten Probe. Unabhängig vom gewählten Protokoll ist es wichtig, dass während der gesamten Studie dasselbe Protokoll befolgt wird, einschließlich der Anzahl der Fasern, die für die individuelle Probenahme verwendet werden, der Länge der Beschichtung, der Extraktionszeit und allen anderen Faktoren, die in dieser Arbeit abgegrenzt sind.
Es ist wichtig, die Qualität der Analyse zu kontrollieren. Das gepoolte QC (siehe Schritte 4.7 und 7.7 im Protokoll) sollte für die Überwachung der Gerätestabilität während des Ablaufs der gesamten Probencharge vorbereitet und verwendet werden. Die Leerensteuerungen (siehe Schritt 2.8) können später verwendet werden, um eine "Ausschlussliste" zu erstellen, um Signale von Verunreinigungen aus Lösungsmitteln oder der Faserherstellung zu beseitigen. In besonderen Fällen, z. B. bei der Gefahr einer Kontamination, ist es erforderlich, Proben von Handschuhen, Tischen, Geräten oder anderen Oberflächen durchzuführen, die ein Kontaminationsrisiko darstellen können. In solchen Fällen sind faservorbereitungs-, Extraktionszeit- und Desorptionsprotokolle die gleichen wie bei den Proben.
Metabolomische und lipidomische Analysen konzentrieren sich ausschließlich auf kleine Moleküle (weniger als 1.500 Da), die in einem Organismus oder bestimmten Komponenten des Organismus auftreten, wie bestimmte Organe, Gewebe, Flüssigkeiten, Zellen usw. Metabolomicundik und Lipidomik bieten eine Momentaufnahme der biochemischen Veränderungen im Körper, und im Falle von Krebs, sie integrieren Informationen über das Genom, Histologie, und Malignität des Tumors. Diese Omics-Wissenschaften schaffen eine Verbindung zwischen Physiologie und Phänotyp, da Metaboliten in der biochemischen Leiter höher sind als Proteine oder Gene12. Durch das Verständnis des Metaboloms und Lipidoms von Krebstumoren kommen wir der Entdeckung des Phänotyps unter allen -omics-Wissenschaften näher, da diese Studienzweige ein tieferes Wissen über dynamische Veränderungen von Molekülen als Reaktion lebender Organismen auf verschiedene Reize bieten. Wie in dieser Arbeit dargestellt, entsprechen die in einer Probenahme gewonnenen Daten der Histologie des Krebses, seinem Grad der Malignität, und es spiegelt Veränderungen wider, die auf Genomebene auftreten. Bei Gliomen, der Art des Krebses, der in dieser Studie von Interesse ist, sind die im Genom verborgenen Informationen besonders wichtig, da eine personalisierte Behandlung auf der Grundlage der Ergebnisse genetischer Tests entwickelt wird. Besondere Mutationen sind prognostische Marker der Ergebnisse der Chemo- oder Strahlentherapie. Wie hier gezeigt, ist die Auswahl von Biomarkern, die eine bestimmte Mutation widerspiegeln, mit der vorgeschlagenen Strategie möglich. Mutationsmarker, sowie zusätzliche Deskriptorentypen, wie diejenigen, die den Grad der Malignität des Tumors angeben, können auch verwendet werden, um routinemäßige diagnostische Methoden zu unterstützen.
Die ex vivo chemische Biopsie unter Verwendung von Festphasen-Mikroextraktionsfasern ist der erste Schritt bei der Anwendung des Verfahrens auf die intraoperative Diagnostik. Die Methode kann leicht für In-vivo-Proben entnommen werden, bis die Genehmigung durch geeignete Ethik-Gremien erteilt wird. In solchen Fällen muss die Sterilisation von SPME-Geräten gemäß den akzeptierten Sterilisationsverfahren des Krankenhauses durchgeführt werden, in dem die Probenahme durchgeführt werden soll, d. h. Autoklavierung oder Ethylenoxidsterilisation. Die vorkonditionierten und sterilisierten Fasern müssen in versiegelten Verpackungen aufbewahrt werden, die mit einem Sterilisationsablaufdatum gekennzeichnet sind. Es ist wichtig zu beachten, dass Fasern nicht mit der Verwendung von Tensiden gereinigt werden sollten. Ein solches Verfahren kann zu unspezifischen Veränderungen der Sorptionszusammensetzung führen und somit die Extraktion von Analyten beeinträchtigen. In den hier beschriebenen Studien wurde eine Extraktionsphase von 30 min verwendet, aber andere Berichte bestätigen, dass kürzere Zeiten in in vivo-Studien zufriedenstellende Ergebnisse liefern können13. Huq et al. zeigten, dass die Analytgleichgewichtszeit im Gewebe als komplexe Matrix schneller erreicht wird als in einfachen Matrizen14. Die Reproduzierbarkeit der erzielten Ergebnisse kann jedoch unter kürzeren Extraktionszeiträumen beeinträchtigt werden, da mehr Analyten unter Vorgleichgewichtsbedingungen extrahiert werden; daher muss eine genaue Zeitregelung implementiert werden.
Beide im Rahmen dieser Arbeit genutzten Omics-Wissenschaften haben ein ausgezeichnetes Potenzial als Biomarker-Entdeckungswerkzeuge. Sobald Biomarker ausgewählt oder ein chemometrisches Modell erstellt ist, kann die medizinische Diagnostik auf der Grundlage der Bestimmung von Zielmetaboliten über Methoden, die für Vor-Ort-Untersuchungen geeignet sind, wie der in dieser Arbeit beschriebene SPME-Ansatz, im Rahmen der Routinediagnostik entwickelt und implementiert werden.
Das in diesem Manuskript vorgeschlagene Protokoll beschreibt, wie ungezielte metatonomische und lipidomische Analysen von Krebsgewebe unter Verwendung der Solid-Phasen-Mikroextraktion zum Screening potenzieller Biomarker durchgeführt werden können. Es wurde entwickelt, um die Extraktion repräsentativer Verbindungen, die Differenzierung von Tumoren und die Identifizierung diskriminierender Verbindungen zu ermöglichen, die einen bestimmten Krebs charakterisieren, d. h. potenzielle Biomarker. Die in diesem Artikel beschriebenen ungezielten Analysen mit SPME stellen einen Ausgangspunkt für die Entwicklung einer schnellen intraoperativen Diagnostik dar, bei der ein ausgewähltes Wirkstoffpanel ohne die Notwendigkeit eines Screenings aller in der Probe vorhandenen Verbindungen bestimmt werden kann. Im Interesse schneller diagnostischer Ergebnisse könnten SPME-Sonden, die für die Vor-Ort-Extraktion verwendet werden, direkt an analytische Instrumente gekoppelt werden, die sich in der Krankenhauseinrichtung befinden. Einfache Extraktionen, die mit minimaler Probenvorbereitung und anschließender chromatographiefreier Analyse durchgeführt werden, würden die Gesamtzeit von Stunden auf wenige Minuten erheblich verkürzen, wie bereits für die Arzneimittelüberwachung beschrieben15.

Magnetresonanztomographie (MRT) und Computertomographie (CT) sind die wichtigsten Methoden für die Echtzeitanalyse von Hirnläsionen. Die Differenzierung von Hirntumoren basiert in der Regel auf histopathologischer Therapie mit zusätzlichen Färbungen und fortschrittlichen immunhistochemischen Techniken. Laut der aktualisierten Anleitung zu zentralen nervenaufgeponierten Hirntumoren, die 2016 von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) herausgegeben wurden, sind genetische Tests entscheidend für die Differenzierung und Klassifizierung dieser Tumoren1. Die Differenzierung und Klassifizierung von Tumoren ermöglicht es Ärzten, die effektivste Behandlung für eine bestimmte Art von Tumor zu wählen und so die Lebenserwartung des Patienten zu erhöhen. Leider, trotz der Verfügbarkeit solcher fortschrittlichen Methoden, um Ärzte bei der Auswahl einer optimalen Therapie für ihre Patienten zu unterstützen, ist die Lebenserwartung der Patienten mit Glioblastom diagnostiziert (IV Grad Gliom) ist nur etwa 15-16 Monate2. Selbst mit der Raffinesse und der erhöhten Genauigkeit der besagten bildgebenden und histologischen Methoden als diagnostische Werkzeuge besteht nach wie vor ein großer Bedarf an neuen Techniken, die Ärzten bei Entscheidungen über den Behandlungsverlauf ergänzende Informationen zur Verfügung stellen können. In den letzten Jahren wurden mehrere neue Ansätze auf der Grundlage der Massenspektrometrie für die intraoperative Analyse von Krebsvorgeschlagen 3,4. Das Potenzial der Solid Phase Microextraction (SPME), der hier vorgestellten Methode, als schnelles Analyseinstrument vor Ort, wurde bereits in einer Vielzahl von Studien nachgewiesen5. Das aktuelle Manuskript zeigt eine der klinischen Anwendungen der Methode, ungezielte Metabolomik und Lipidomik menschlicher Hirntumoren. Ungezielte Untersuchungen stellen einen wichtigen Ausgangspunkt für die Entdeckung potenzieller Biomarker dar. Einmal etabliert, können solche Biomarker dann als diagnostische Referenzen verwendet werden, um zwischen Tumoren mit der gleichen Technologie zu unterscheiden, die an die Vor-Ort-Instrumentierung gekoppelt ist.
SPME ist eine gleichgewichtsbasierte Probenvorbereitungstechnik, die kleine Moleküle aus Probenmatrizen mit der Verwendung kleiner Mengen Extraktionsphase extrahiert. In der traditionellsten Konfiguration des Geräts (Sonde) von SPME wird eine Faser mit einer geeigneten Extraktionsphase beschichtet und auf einer festen Stütze, d.h. einem Metalldraht5,6,immobilisiert. Biokompatible Beschichtungen und Vorrichtungen (Sonden) ermöglichen die direkte Extraktion aus komplexen biologischen Matrizen ohne Probenvorbehandlung, z.B. Homogenisierung und Filtration. Durch den Extraktionsprozess werden die Analyten im Verhältnis zu ihren Anfangskonzentrationen zwischen Extraktionsphase und Probenmatrix aufgeteilt. Wenn die Extraktion lange genug durchgeführt wird, dann wird das Gleichgewicht erreicht. Während die Extraktion im Gleichgewicht die höchstmögliche Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit bietet, ist auch die Vorgleichgewichtsextraktion möglich und in einigen Fällen sogar vorzuziehen, d. h. in vivo Probenahmen, bei denen Zeitbeschränkungen im Zusammenhang mit der Probenahme vor Ort (z. B. Betriebs- oder Notfallräume) schnelle Extraktionen erfordern. Das Extraktionszeitprofil eines gegebenen Analyten wird in der Regel durch die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Analyten, die zu beprobende Matrix, die Art des verwendeten Sorbens und mehrere andere Extraktionsbedingungen beeinflusst. Die Fülle von Faktoren, die ihre Extraktionskinetik bestimmen, macht es praktisch unmöglich, eine Gleichgewichtsextraktion aller Verbindungen zu gewährleisten, wenn ungezielte Analysen wie Metabolomik oder Lipidomik durchgeführt werden. Aus den oben genannten Gründen wurde die Extraktionszeit des aktuellen Protokolls willkürlich festgelegt, um einerseits eine zufriedenstellende Empfindlichkeit und Abdeckung von Metaboliten und andererseits die Praktikabilität für den Einsatz vor Ort zu gewährleisten.
Es sollte betont werden, dass die sehr geringe Größe der Sonden, die für die Extraktion von Proben aus Geweben verwendet werden, nur minimale Gewebeschäden verursacht, während das Probenahmeverfahren selbst kein Gewebe, sondern sehr kleine Mengen kleiner Moleküle aus dem probengebundenen Bereich verbraucht; Daher kann dieselbe Probe für Routinetests, d. h. histologische oder genetische, weiter verwendet werden, was die Erzielung wesentlicher und ergänzender Informationen aus derselben Probe ermöglicht. Solche ergänzenden, umfassenden Daten würden ein besseres Verständnis der Tumorbiologie ermöglichen und hoffentlich die Entdeckung neuer Behandlungsziele erleichtern. Die Nutzung dieser Methode erhöht die Möglichkeit der intraoperativen Diagnostik vor Ort bei der Bestimmung von Zielbiomarkern weiter.
Im Folgenden stellen wir Protokolle zur Probenahme von Hirntumoren vor Ort für Metabolomik- und Lipidomikanalysen und Datenverarbeitung vor.

<table><tbody><tr><td></td><td>Essigsäure Honeywell</td><td>49199</td><td>Additiv für die mobile Phase,</td></tr><tr><td>Acetonitril</td> in LCMS-Qualität <td>Honeywell</td><td>34967</td><td>HPLC-Lösungsmittel, Ammoniumacetat in LCMS-Qualität</td></tr><tr><td></td><td>Honeywell</td><td>14267</td><td>Additiv für mobile Phasen,</td></tr><tr><td>Labormischer in LCMS-Qualität MultiTube Vortexer</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BV1010*</td><td>Vortex</td></tr><tr><td>Mischerkappen</td><td>Agilent</td><td>5183-2076</td><td>Blaues Siebgewebe tp, vorgeschlitzte PTFE/Si-Septen</td></tr><tr><td>Compound Discoverer 2.1</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Software für die</td></tr><tr><td>Datenverarbeitung Discovery HS F5 Supelguar Kartusche 2 cm & x 2,1 mm, 3 & mu; m</td><td>Supelco</td><td>567571-U</td><td>Vorsäule</td></tr><tr><td>Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 &mu; m</td><td>Merck</td><td>567502-U</td><td>HPLC-Säule</td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Honeywell</td><td>56302</td><td>Additiv für die mobile Phase,</td></tr><tr><td>Glasfläschcheneinsätze in LCMS-Qualität 250 ul, deaktiviert</td><td>Agilent</td><td>5181-8872</td><td></td></tr><tr><td>Glasfläschcheneinsätze 350 ul</td><td>Agilent</td><td>5188-5321</td><td></td></tr><tr><td>Glasfläschchen 1,5 ml</td><td>Agilent</td><td>5183-2030</td><td></td></tr><tr><td>Glasfläschchen, 2 mL (braun, deactivated)</td><td>Agilent</td><td>5183-2072</td><td></td></tr><tr><td>Glasfläschchen, 2mL</td><td>Agilent</td><td>5182-0715</td><td></td></tr><tr><td>HILIC Luna 3 &mu; m, 200A, 100 x 2,0 mm</td><td>Shim-Pol</td><td>PHX-00D-4449-B0</td><td>HPLC-Säule</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Honeywell</td><td>34965</td><td>HPLC-Lösungsmittel, LCMS-Qualität</td></tr><tr><td>LipidSearch 4.1</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Software für die Datenverarbeitung</td></tr><tr><td>Metaboanalyst</td><td>Xia Lab @ McGill</td><td></td><td>Online-Software für die statistische Analyse (Chong, J., Wishart, D.S. und Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Aktuelle Protokolle in der Bioinformatik 68, e86 )</td></tr><tr><td>methanol</td><td>Honeywell</td><td>34966</td><td>HPLC-Lösungsmittel, LCMS-Qualität</td></tr><tr><td>Pierce LTQ Velos ESI Kalibrierlösung für positive Ionen</td><td>Thermo Scientific</td><td>88323</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Kalibrierlösung für negative Ionen</td><td>Thermo Scientific</td><td>88324</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Focus Hybrid Quadrupol-Orbitrap MS</td><td>Thermo Scientific</td><td>726049</td><td>Massenspektrometer</td></tr><tr><td>SecurityGuard Kartusche für HILIC, 4 mm &fach 2,0 mm</td><td>Phenomenex</td><td>KJ0-4282</td><td>Vorsäule</td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-cHILIC 3&micro; m,100&Aring; 100 x 2,1 mm</td><td>Merck</td><td>1506570001</td><td>HPLC-Säule</td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2,1 mm</td><td>Supelco</td><td>1504360001</td><td>Vorsäule</td></tr><tr><td>SPME LC Fasersonden, C18</td><td>Supelco</td><td>Sonderanfertigung</td><td>: 57281-U; die im Experiment verwendeten Sonden waren nicht mit der Nadel montiert und auf die im Protokoll beschriebene Länge vorgeschnitten</td></tr><tr><td>SPME LC Fasersonden, gemischter Modus</td><td>Supelco</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td></tr><tr><td>UltiMate 3000 HPLC-Systeme</td><td>Thermo Scientific</td><td>5200.0345</td><td>HPLC-System</td></tr><tr><td>Wasser</td><td>Merck</td><td>1153331000</td><td>HPLC-Lösungsmittel, LCMS-Qualität</td></tr><tr><td>XSelect CSH C18 3,5&mu; m 2,1x75mm</td><td>Wasser</td><td>186005644</td><td>HPLC Säule</td></tr><tr><td>XSelect CSH C18 VanGuard Kartusche, 3,5 & Mikro; m, 3,9x5 mm</td><td>Wasser</td><td>186007813</td><td>Säulenkartusche</td></tr></tbody></table>

vor-ort-probenahme und extraktion von hirntumoren für die metabolomik- und lipidomik-analyse

On-Site Sampling and Extraction of Brain Tumors for Metabolomics and Lipidomics Analysis

Trotz der Vielzahl von Werkzeugen, die für die Krebsdiagnose und -klassifizierung zur Verfügung stehen, sind Methoden, die eine schnelle und einfache Charakterisierung von Tumoren ermöglichen, immer noch in Not. In den letzten Jahren ist die Massenspektrometrie zu einer Methode der Wahl für die ungezielte Profilierung diskriminierender Verbindungen als potenzielle Biomarker einer Krankheit geworden. Biofluide werden aufgrund ihrer Zugänglichkeit und einfacheren Probenverarbeitung im Allgemeinen als bevorzugte Matrizen betrachtet, während die direkte Gewebeprofilierung selektivere Informationen über einen bestimmten Krebs liefert. Die Aufbereitung von Geweben für die Analyse mit herkömmlichen Methoden ist viel komplexer und zeitaufwändiger und daher nicht für eine schnelle Vor-Ort-Analyse geeignet. Die aktuelle Arbeit stellt ein Protokoll vor, das die Probenvorbereitung und Extraktion kleiner Moleküle direkt nach der Tumorresektion vor Ort kombiniert. Die Probenahmevorrichtung, die die Größe einer Akupunkturnadel hat, kann direkt in das Gewebe eingeführt und dann zur instrumentellen Analyse in das nahe gelegene Labor transportiert werden. Die Ergebnisse von Metabolomik- und Lipidomikanalysen zeigen die Fähigkeit des Ansatzes zur Etablierung von Phänotypen von Tumoren im Zusammenhang mit dem histologischen Ursprung des Tumors, der Malignität und genetischen Mutationen sowie bei der Auswahl diskriminierender Verbindungen oder potenzieller Biomarker. Der zerstörungsfreie Charakter der Technik ermöglicht die Nacherfüllung routinemäßig verwendeter Tests, z. B. histologische Tests, an denselben Proben, die für die SPME-Analyse verwendet werden, und ermöglicht so die Erzielung umfassenderer Informationen zur Unterstützung personalisierter Diagnostika.

Die Nutzung der Festphasen-Mikroextraktion als Probenvorbereitungsmethode in Kombination mit der Flüssigchromatographie gekoppelt mit hochauflösender Massenspektrometrie und einer fortschrittlichen Datenverarbeitungssoftware ermöglichte es uns, das Metabolom und Lipidom menschlicher Hirntumoren erfolgreich zu charakterisieren. Die Sonde, deren Größe einer Akupunkturnadel entsprach, verursachte minimale Schäden am untersuchten Gewebe und keinen Gewebeverbrauch, so dass die weitere Verwendung von Proben für histologische oder genetische Studien möglich war. Für umgekehrte Phasen- und HILIC-Säulen sowie für beide Ionisationsmodi in Metabolomik- und Lipidomik-Analysen wurde eine zufriedenstellende Trennung der ausgewählten Gruppen erzielt. Die Anwendung beider Trennmethoden nicht nur in der Metabolomik, sondern auch in der Lipidomik-Analyse lieferte wertvolle ergänzende Daten. Die umgekehrte Phasensäule trennt Lipide in Bezug auf ihre Kohlenstoffkettenlänge und das Vorhandensein ungesättigter Bindungen, während die HILIC-Säule für die Profilierung von Lipidgruppen, insbesondere Phospholipiden8,nützlich ist.
Die Reproduzierbarkeit der instrumentellen Analyse wurde aufgrund der engen Clusterbildung von QC-Proben auf dem Hauptkomponentenanalysediagramm als sehr gut befunden(Abbildung 3A, die drei QC-Proben, die alle acht Patientenproben entlang der Sequenzüberlappung injiziert wurden). Darüber hinaus wurden Extraktionsrohlinge, die für die Negativkontrollanalyse verwendet wurden, gefunden, um sich gut von realen Proben zu trennen. Die breite Palette von Analyten, die von den Sonden extrahiert wurden, erleichterte die Entdeckung repräsentativer Arten und ermöglichte so erfolgreich eine Differenzierung zwischen menschlichen Hirntumoren basierend auf ihrer histologischen Herkunft, Bösartigkeit und anderen Faktoren (z. B. genetischen). Abbildung 3B zeigt Lipidomik-Daten für Proben, die von Patienten mit Gliomen und Meningiomen entnommen wurden. Die Differenzierung zwischen diesen Tumoren, die durch unterschiedliche histologische Herkunft und Malignität gekennzeichnet waren, war ein wichtiges Ziel der Studie, da Meningiome im Allgemeinen als gutartige Tumoren betrachtet werden, während Gliome zu den malignsten gehören. Darüber hinaus wurden in Abbildung 4, die Metabolomikdaten darstellt, Gliome basierend auf ihrem Grad der Malignität in hoch und niedrig unterteilt. Diese Untergruppen wurden mit dem molekularen Phänotyp von Meningiomen verglichen. In beiden Fällen wurde eine prominente Trennung von Clustern beobachtet. Heute beruht die Diagnostik des Glioms in erster Linie auf der Bestimmung spezifischer genetischer Mutationen in Tumorproben. Daher wurden die erzielten Ergebnisse mit Genotypisierungsdaten verglichen. Abbildung 5A zeigt die Trennung der Proben mit der nachgewiesenen Co-Deletion 1p19q und Proben, bei denen die Mutation nicht beobachtet wurde.
Die statistische Analyse ermöglicht auch die Auswahl von Verbindungen in den untersuchten Gruppen. Diese Verbindungen können als potenzielle Biomarker in Fällen betrachtet werden, in denen eine entsprechend große Kohorte beprobt wird. Eine eingehendere Analyse, einschließlich einer schlüssigen Bestätigung nachgewiesener Verbindungen durch Fragmentierung und Vergleich der nachgewiesenen Arten mit analytischen Standards, ist jedoch erforderlich, um endgültige Schlussfolgerungen biologischer Natur zu ziehen. Beispiele für solche diskriminanten Metaboliten sind in Abbildung 3C und Abbildung 5Bdargestellt. Die Identitäten dieser Verbindungen, d.h. Sphingomielyn: SM d36:1 und Prolin wurden durch den Vergleich von Fragmentierungsmustern der Metaboliten aus der Probe und authentischen Standards bestätigt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61260/61260fig01.jpg"> Abbildung 1: SPME-Fasern, die für den Extraktionsprozess vorbereitet sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61260/61260fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61260/61260fig02.jpg"> Abbildung 2: Extraktion von Meningiom mit SPME-Sonden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61260/61260fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61260/61260fig03.jpg"> Abbildung 3: PCA- und Boxplots für Gliom und Meningiom. Hauptkomponentenanalysediagramm enthält (A) alle analysierten Proben einschließlich Rohlinge, Extraktion QC, Rohlinge, Meningiome, Gliome; (B) die nur untersuchte Gruppen enthalten (nach Ausschluss von Rohlingen und QCs); (C) Box Whisker Plot für Sphingomielyn: SM d36:1 Unterscheidung sparieren Patient mit Gliom und Meningiom. Lipidomics-Daten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61260/61260fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61260/61260fig04.jpg"> Abbildung 4: PCA für HGG, LGG und Meningiom. Hauptkomponentenanalysediagramm, das die Unterscheidung zwischen (A) hochgradig graduierenden Gliomen (HGG) und Meningiomen (MEN)9 und (B) niedriggradlichen Gliomen (LGG) und Meningiomen zeigt. Metabolomics-Daten aus der Via Medica ref9 mit Genehmigung nachgedruckt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61260/61260fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61260/61260fig05.jpg"> Abbildung 5: PCA- und Boxplots für Gliom mit und ohne Löschung. (A) Hauptkomponentenanalysediagramm zeigte Unterschiede bei Patienten mit und ohne Co-Deletion 1p19q; (B) Box-Whisker-Plots für prolinedifferenzierte Patienten mit und ohne Co-Deletion 1p19q; n-ohne Löschung, y-mit Löschung. Metabolomics-Daten <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61260/61260fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Das Manuskript präsentiert vor Ort Probenahmen menschlicher Hirntumoren mit fester Phasenmikroextraktion, gefolgt von ihrer biochemischen Profilierung zur Entdeckung von Biomarkern.

Vor-Ort-Probenahme und Extraktion von Hirntumoren für die Metabolomik- und Lipidomik-Analyse

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still ...

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine Extraktion von Hirntumoren in oder neben einem Server unter Verwendung von Festphasen-Mikroextraktionsfasern durchzuführen. Diese Technik ermöglicht die Extraktion kleiner Moleküle direkt aus resezierten Tumoren und bietet die Möglichkeit für eine schnelle intraoperative Diagnostik durch die direkte Kopplung von Extraktionsgeräten an analytische Instrumente. Um die Festphasen-Mikroextraktionsvorrichtung vorzubereiten, trimmen Sie die Codierung jeder Festphasen-Mikroextraktionssonde mit gemischter Modus- oder C18-Beschichtung auf eine angemessene Länge entsprechend der Größe des Tumors.Und die Sonden und eine 50 50 Methanol-Wasserlösung mindestens eine Stunde vor der Probenentnahme einweichen. Dieses Protokoll konzentriert sich auf Hirntumoren, aber die Strategie kann für die Diagnose vieler verschiedener Krebsarten implementiert werden. Die Technologie ist vollständig tragbar, so dass keine zusätzlichen Geräte benötigt werden.Tauchen Sie die Sondenfasern so schnell wie möglich nach der Tumorentfernung fünf Sekunden lang mit LCMS-Wasser ein, bevor Sie die Fasern so weit wie möglich in die Hirntumor-Gewebeprobe einsetzen, um sicherzustellen, dass sich die gesamte Extraktionsphase im Inneren des Tumors befindet. Lassen Sie die Sonden innerhalb des Gewebes für genau 30 Minuten, um Fehlerquellen aufgrund des Vorhandenseins von Artefakten aus anderen Quellen als dem Probentumor zu beseitigen, legen Sie konditionierte Sondenfasern auf den Tisch für den gleichen Zeitraum. Während der Extraktion, Label HPLC Fläschchen für die Sondenlagerung nach der Extraktion verwendet werden.Am Ende der Extraktion tauchen Sie die Fasern drei Sekunden lang in WASSER der LCMS-Klasse ein, um Blut- oder Zellablagerungen zu entfernen, und legen Sie jede Sonde durch den Boden der Septa einer einzelnen HPLC-Durchstechflasche ein, um die Fasern zu immobilisieren. Dann die Fläschchen mit den immobilisierten Fasern kappen und die Fläschchen in einen geeigneten Transportbehälter legen. Bei der Ankunft im Labor legten die Fläschchen sofort für nicht mehr als drei bzw. fünf Jahre in einen Gefrierschrank von minus 30 bzw. minus 80 Grad Celsius.Nachdem alle Proben aus einem einzigen Experiment gesammelt wurden, legen Sie die Fläschchen mit den Gemischten-Modus-Fasern bei Raumtemperatur. und beschriften Sie zwei Milliliter-Fläschchen zur Desorption einen Glaseinsatz in jede Durchstechflasche und fügen Sie 300 Mikroliter frisch zubereitete 80 20 Acetonitril-Wasserlösung zu jedem Einsatz hinzu. Vollständige Kodierung jeder Sonde in einzelne Durchstechflaschen des Desorptionslösungsmittels und rührt die Fläschchen 120 Minuten lang bei 1.200 Umdrehungen pro Minute auf einem Wirbel.Sobald die Desorption abgeschlossen ist, entfernen Sie die Kappen von den Durchstechflaschen und legen Sie 10 Mikroliter Aliquots aus jeder Datei beiseite, die Extrakt aus dem Tumor enthält, um eine Qualitätskontrolle Probe vorzubereiten. Schließen Sie dann die Fläschchen mit neuen Kappen und legen Sie die Fläschchen in den vier Grad Celsius Auto-Sampler eines flüssigen Chromatographie hochauflösenden Massenspektrometers. Um die Proben für die Lipidomic Analysis vorzubereiten, legen Sie die Fläschchen mit den C 18 Fasern bei Raumtemperatur und beschriften Sie zwei Milliliter HPLC-Fläschchen für die Störungsplatz-Silanglaseinsätze in die Durchstechflaschen und fügen Sie 200 Mikroliter frisch zubereitete 50 50 Isopropanol Methanollösung zu jedem Einsatz hinzu.Tauchen Sie jede Sondenbeschichtung vollständig in das Lösungsmittel ein und rühren Sie die Proben 50 Minuten lang bei 1.200 Umdrehungen pro Minute auf einem Wirbel. Am Ende der Zeit, stoppen Sie die Desorption durch Entfernen der Kappen und legen Sie dann beiseite eine 10 Mikroliter Aliquots aus jeder Datei enthält Extrakt aus dem Tumor, um die Qualitätskontrolle Probe vorzubereiten und schließen Sie die Fläschchen mit neuen Kappen. Legen Sie dann die Fläschchen in den vier Grad Celsius Auto-Sampler des flüssigen Chromatographie-Massenspektrometers mit hoher Auflösung.Die Reproduzierbarkeit der Instrumentalanalyse wurde aufgrund der engen Clusterung der Qualitätskontrollproben auf dem Hauptkomponentenanalysediagramm als sehr gut ermittelt. Diese Lipidomik-Daten für Proben von Patienten mit Gliomen und Meningiomen unterstreichen die Fähigkeit der Tumorproben, nach ihrem histologischen Ursprung und ihrer Malignität zu unterscheiden. Wie mit diesen Metabolomik-Daten veranschaulicht, können Gliome weiter geteilt werden, je nach Grad der Malignität und oder nach dem Vorhandensein oder Fehlen von Mutationen von Interesse.Die statistische Analyse ermöglicht auch die Auswahl spezifischer Verbindungen innerhalb der untersuchten Gruppen. Es ist wichtig, die Extraktionszeit sorgfältig zu kontrollieren und reproduzierbare Bedingungen für alle Proben aufrechtzuerhalten. Alternativ können Proben ohne chromatographische Trennung von der Faser direkt zu Ms gelöst werden, was eine gezielte Analyse bestimmter Marker ermöglicht und den gesamten Eingriff auf mehrere Minuten verkürzt.

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Forschung

JoVE Journal

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Medizin

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Festphasen-Mikroextraktionsprobenahme: Eine sondenbasierte Technik zur Probenextraktion aus Transplantatgewebe

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Hier stellen wir ein Protokoll zur Vorbereitung und Kultivierung einer Bluthirnschranke metastasierenden Tumor Mikro-Umgebung und dann quantifizieren seinen Zustand mit konfokaler Bildgebung und künstliche Intelligenz (Machine Learning).

Quantifizierung der metastasierenden Tumor-Mikroumgebung des Gehirns mit einem Organ-On-A-Chip-3D-Modell, maschinellem Lernen und konfokaler Tomographie

Dieser Artikel beschreibt einen Workflow von Techniken, die zum Testen neuartiger Kandidatenmediatoren von Melanommetastasen und deren Wirkmechanismus eingesetzt werden.

Eine robuste Entdeckungsplattform zur Identifizierung neuartiger Mediatoren der Melanommetastasierung

Für die massenspektrometrische Bildgebung (MSI) von Hirnorganoiden wurde eine fortschrittliche Methode entwickelt, die es ermöglicht, die Metabolitenverteilungen innerhalb dieser Modelle abzubilden. Diese Technologie bietet Einblicke in die Stoffwechselwege und Metabolitensignaturen des Gehirns während der frühen Entwicklung und bei Krankheiten und verspricht ein tieferes Verständnis der menschlichen Gehirnfunktion.

Molekulare Bildgebung von Organoiden des menschlichen Gehirns mittels Massenspektrometrie 

In vivo sind interzelluläre Kommunikationen, die vielen Erkrankungen des zentralen Nervensystems zugrunde liegen, wie etwa das Glioblastom (GBM), notorisch schwer zu messen und zu charakterisieren. Hier beschreiben wir Verfahren der zerebralen offenen Mikroperfusion (cOFM), die verwendet werden können, um interstitielle Flüssigkeitskomponenten in einem longitudinalen Tiermodell von GBM zu beproben.

Verwendung von zerebraler Offenfluss-Mikroperfusion zur longitudinalen Sammlung von Zwischenflüssigkeit in einem Tiermodell des Glioblastoms

Hier etablieren wir eine metabolische Profiling-Plattform, die dreidimensionale (3D) Gliom-Sphäroide und bildgebende Normalisierung mittels extrazellulärer Flussanalyse integriert. Dieser Ansatz ermöglicht eine genauere Bewertung der metabolischen Reaktionen von Tumoren auf medikamentöse Behandlungen und gibt Einblicke in mögliche Resistenzmechanismen.

Fortschritte bei der metabolischen Profilerstellung von dreidimensionalen Hirntumor-Sphäroiden für das Wirkstoffscreening

Die stereotaktische intrakranielle Injektionstechnik ermöglicht eine präzise und lokalisierte Einpflanzung von Tumorzellen in den Mauskortex und ist damit ein wirkungsvolles Modell zur Untersuchung der metastatischen Besiedlung des Gehirns.

Modellierung von Gehirnmetastasen: Standardisierte Analyse metastatischer Kolonisierung und histologischer Wachstumsmuster durch stereotaktische intrakortikale Injektion

Dieses Protokoll bereitete erfolgreich ausreichend hochwertiges neovaskuläres Gewebe aus Gliomproben mittels Laser-Capture-Mikrodissektion für eine quantitative proteomische Analyse der Tumorangiogenese vor, überwand die Einschränkungen von Studien, die traditionell hauptsächlich auf angiogene Faktoren fokussiert sind, und lieferte ein großflächiges proteomisches Profil der Gliomangiogenese.

Präparation von neovaskulären Geweben aus humanen Gliomgeweben für quantitative proteomische Analyse der Tumorangiogenese

Lernen Sie die Vor-Ort-Probenahme von Hirntumoren mittels SPME für Metabolomik- und Lipidomik-Analysen. Diese Methode ermöglicht schnelle intraoperative Diagnostik und Biomarker-Identifizierung bei Gliomen und Meningiomen.

Vor-Ort-Probenahme und Extraktion von Hirntumoren für die Metabolomik- und Lipidomik-Analyse

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