Name: Bildgebung und Analyse des Neurofilamenttransports in verbraucheten Maus-Tibialnerv (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Lernen Sie die Fluoreszenz-Photoaktivierungsmethode zur Analyse des Neurofilamenttransports in myelinisierten Axonen von transgenen Mäusen. Diese Technik ermöglicht präzise Messungen von Richtung und Geschwindigkeit des Transports.

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Die Autoren danken Paula Monsma für die Unterweisung und Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie und tibialen Nervensektion und Dr. Atsuko Uchida, Chloe Duger und Sana Chahande für die Unterstützung bei der Maushaltung. Diese Arbeit wurde teilweise durch die kollaborativen National Science Foundation Grants IOS1656784 an A.B. unterstützt. und IOS1656765 an P.J., und National Institutes of Health Grants R01 NS038526, P30 NS104177 und S10 OD010383 an A.B. N.P.B. wurde durch ein Stipendium des Postdoctoral Scholars Program der Ohio State University unterstützt.

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Bei der Analyse von Puls-Escape- und Puls-Spread-Experimenten ist Vorsicht geboten, da ein erhebliches Potenzial für die Einschleppung von Fehlern während der Nachbearbeitung, vor allem während der Flachfeldkorrektur, Bildausrichtung und Bleichkorrektur, besteht. Die Flachfeldkorrektur ist notwendig, um die Ungleichmäßigkeit in der Beleuchtung zu korrigieren, was zu einem Rückgang der Intensität über das Sichtfeld von der Mitte zur Peripherie führt. Das Ausmaß der Ungleichmäßigkeit ist wellenlängenabhängig und sollte dah...

Der axonale Transport von Neurofilamenten wurde erstmals in den 1970er Jahren durch radioisotopische Pulsbeschriftung1demonstriert. Dieser Ansatz hat eine Fülle von Informationen über Neurofilament-Transport in vivoergeben, aber es hat relativ geringe räumliche und zeitliche Auflösung, in der Regel in der Größenordnung von Millimetern und Tagen bestenfalls2. Darüber hinaus ist die radioisotopen pulsierende Kennzeichnung ein indirekter Ansatz, der die Injektion und das Opfer mehrerer Tiere erfordert, um einen einzigen Zeitverlauf zu erzeugen. Mit der Entdeckung fluoreszierender Proteine und Fortschritten in der Fluoreszenzmikroskopie in den 1990er Jahren wurde es später möglich, neurofilamenten Transport direkt in kultivierten Neuronen auf einer Zeitskala von Sekunden oder Minuten und mit Submikrometer räumlicher Auflösung abzubilden, was einen viel größeren Einblick in den Mechanismus der Bewegung3ermöglichte. Diese Studien haben gezeigt, dass Neurofilamentpolymere in Axonen sich sowohl in anterograde als auch in retrograde Richtungen entlang von Mikrotubulispuren, angetrieben von mikrotubule motorischen Proteinen, schnell und intermittierend bewegen. Neurofilamente sind jedoch beugungsbegrenzte Strukturen mit einem Durchmesser von nur 10 nm, die in der Regel nur um zig Nanometer von ihren Nachbarn entfernt sind; Daher können die Polymere nur in kultivierten Neuronen verfolgt werden, die dünn verteilte Neurofilamente enthalten, so dass die beweglichen Polymere von ihren Nachbarn gelöst werden können4. Daher ist es derzeit nicht möglich, einzelne Neurofilamente in Axonen zu verfolgen, die reichlich Neurofilamentpolymere enthalten, wie z. B. myelinierte Axone.
Um den axonalen Transport von Neurofilamenten in neurofilamentreichen Axonen mittels Fluoreszenzmikroskopie zu analysieren, verwenden wir eine fluoreszenz-Photoaktivierungs-Puls-Escape-Methode, die wir entwickelt haben, um das langfristige Pausungsverhalten von Neurofilamenten in kultivierten Nervenzellen4,5zu untersuchen. Neurofilamente, die mit einem photoaktivierbaren fluoreszierenden Neurofilament-Fusionsprotein markiert sind, werden in einem kurzen Segment von Axon aktiviert, und dann wird die Abflugrate dieser Filamente aus der aktivierten Region durch Messung des Fluoreszenzzerfalls im Laufe der Zeit quantifiziert. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es sich um eine Populations-Level-Analyse des Neurofilamenttransports handelt, die auf einer Zeitskala von Minuten oder Stunden angewendet werden kann, ohne die Bewegung einzelner Neurofilamentpolymere verfolgen zu müssen. Zum Beispiel haben wir diese Methode verwendet, um die Kinetik des Neurofilamenttransports in myelinierenden Kulturen zu analysieren6.
Kürzlich beschrieben wir die Entwicklung einer hThy1-paGFP-NFM transgenen Maus, die niedrige Konzentrationen eines paGFP-markierten Neurofilament-Proteins M (paGFP-NFM) in Neuronen unter der Kontrolle des menschlichen neuronspezifischen Thy1-Promotors7ausdrückt. Diese Maus ermöglicht die Analyse des Neurofilamenttransports in situ mittels Fluoreszenzmikroskopie. In diesem Artikel beschreiben wir die experimentellen Ansätze zur Analyse des Neurofilamenttransports in myelinierten Axonen von tibiaellen Nerven von diesen Mäusen mit zwei Ansätzen. Der erste dieser Ansätze ist die oben beschriebene Puls-Escape-Methode. Diese Methode kann Informationen über das Pausungsverhalten der Neurofilamente generieren, ist aber blind für die Richtung, in der die Filamente den aktivierten Bereich abfahren, und erlaubt daher keine Messung der Nettorichtung und Transportgeschwindigkeit8. Der zweite dieser Ansätze ist eine neue Puls-Spread-Methode, bei der wir nicht nur den Verlust der Fluoreszenz aus der aktivierten Region analysieren, sondern auch die vorübergehende Zunahme der Fluoreszenz in zwei flankierenden Fenstern, durch die sich die fluoreszierenden Filamente bewegen, während sie den aktivierten Bereich sowohl anterograde als auch retrograde Richtungen ablassen. In beiden Ansätzen können Parameter des Neurofilamenttransports wie Durchschnittsgeschwindigkeit, Nettorichtungund Pausierungsverhalten durch mathematische Analyse und Modellierung der Fluoreszenzveränderungen in den Messfenstern ermittelt werden. Abbildung 3 zeigt diese beiden Ansätze.
Dieses Protokoll demonstriert die Zerlegung und Vorbereitung des Nervs, Aktivierung und Bildgebung der paGFP Fluoreszenz, und Quantifizierung des Neurofilament-Transports aus den erfassten Bildern mit dem FIJI-Verteilungspaket von ImageJ9. Wir verwenden den Tibianerv, weil er lang ist (mehrere cm) und nicht verzweigt; Grundsätzlich ist jedoch jeder Nervenausdruck paGFP-NFM für die Verwendung mit dieser Technik geeignet, wenn es seziert und entmantelt werden kann, ohne die Axone zu beschädigen.

<table><tbody><tr><td>14 x 22 Rechteck Dichtung 0,1mm</td><td>Bioptechs</td><td>1907-1422-100</td><td>Innendichtung</td></tr><tr><td>2-Deoxy-D-Glukose</td><td>Sigma</td><td>D6134</td><td></td></tr><tr><td>30mm Runde Dichtung mit Löchern</td><td>Bioptechs</td><td>1907-08-750</td><td>Außendichtung</td></tr><tr><td>35 x 10mm Schale</td><td>Thermo Fisher</td><td>153066</td><td>Sezierschalen</td></tr><tr><td>40mm runde Deckgläser</td><td>Bioptechs</td><td>40-1313-0319</td><td></td></tr><tr><td>60mL Spritze - Luer-Lock-Spitze</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Andor Revolution WD Spinning-Disk Konfokalsystem</td><td>Andor</td><td></td><td>ausgestattet mit Perfect Focus und FRAPPA</td></tr><tr><td>Systemen Calciumchlorid</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Fisher</td><td>12-541-B</td><td>für Fluoreszein-Objektträger</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoselösung</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Präpariernadeln</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-70</td><td></td></tr><tr><td>Präparierzange</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Pinzette mit feiner Spitze</td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Zeiss</td><td>47 50 03</td><td></td></tr><tr><td>Sezierpfanne mit Wachs</td><td>Ginsberg Scientific</td><td>568859</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-09</td><td>Initiale Dissektionsschere</td></tr><tr><td>FCS2 Perfusionskammer</td><td>Bioptechs</td><td>060319-2-03</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-Natrium</td><td>Fluka</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>Inline-Lösungsheizung</td><td>Warner Instruments</td><td>SH27-B</td><td></td></tr><tr><td>Laminektomie-Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td>Erstdissektionszange</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Mikroaquädukt-Objektträger</td><td>Bioptechs</td><td>130119-5</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisher</td><td>12-544-3</td><td>für Fluoreszein-Objektträger</td></tr><tr><td>Mikroskoptischeinsatz</td><td>Angewandte wissenschaftliche Instrumente</td><td>I-3017</td><td></td></tr><tr><td>Objektiv-Heizsystem</td><td>Okolab</td><td></td><td>Oko Touch mit Objektivkragen</td></tr><tr><td>Objektivöl - Typ A</td><td>Nikon</td><td>abgekündigt</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo VC 100x 1.40 NA Objektiv</td><td>Nikon</td><td>MRD01901</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Fisher</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Jodacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2512</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Sage Instruments</td><td>Modell 355</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchadapter - weiblich</td><td>Kleinteile Inc.</td><td></td><td></td>1005109</tr><tr><td>Schlauchadapter - männlich</td><td>Kleinteile Inc.</td><td></td><td></td>1005012</tr><tr><td>Tygon Schlauch</td><td>Bioptechs</td><td></td><td>1/16" ID, 1/32" Wandstärke</td></tr><tr><td>Vannas Federschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td>Feinschere</td></tr></tbody></table>

bildgebung und analyse des neurofilamenttransports in verbraucheten maus-tibialnerv

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament-Proteinpolymere bewegen sich entlang von Axonen in der langsamen Komponente des axonalen Transports bei Durchschnittsgeschwindigkeiten von 0,35-3,5 mm/Tag. Bis vor kurzem war die Untersuchung dieser Bewegung vor Ort nur mit radioisotopischer Pulsbeschriftung möglich, die eine Analyse des axonalen Transports in ganzen Nerven mit einer zeitlichen Auflösung von Tagen und einer räumlichen Auflösung von Millimetern ermöglicht. Um den Neurofilamenttransport vor Ort mit höherer zeitlicher und räumlicher Auflösung zu untersuchen, haben wir eine hThy1-paGFP-NFM transgene Maus entwickelt, die Neurofilamentprotein M mit photoaktivierbarem GFP in Neuronen ausdrückt. Hier beschreiben wir Fluoreszenz-Photoaktivierung Puls-Escape und Puls-Spread-Methoden zur Analyse des Neurofilamenttransports in einzelnen myelinierten Axonen von tibiaellen Nerven von diesen Mäusen ex vivo. Isolierte Nervensegmente werden auf der Mikroskopstufe durch Perfusion mit sauerstoffhaltiger Saline erhalten und durch drehende Plattenkonfokaleszenzmikroskopie abgebildet. Violettes Licht wird verwendet, um die Fluoreszenz in einem kurzen axonalen Fenster zu aktivieren. Die Fluoreszenz in den aktivierten und flankierenden Regionen wird im Laufe der Zeit analysiert, was die Untersuchung des Neurofilamenttransports mit zeitlicher und räumlicher Auflösung in der Größenordnung von Minuten bzw. Mikrometern ermöglicht. Mathematische Modellierung kann verwendet werden, um kinetische Parameter des Neurofilamenttransports einschließlich der Geschwindigkeit, der Richtungsverzerrung und des Pausungsverhaltens aus den resultierenden Daten zu extrahieren. Die Puls-Escape- und Puls-Spread-Methoden können auch angepasst werden, um den Neurofilamenttransport in anderen Nerven zu visualisieren. Mit der Entwicklung zusätzlicher transgener Mäuse könnten diese Methoden auch verwendet werden, um den axonalen Transport anderer zytoskelettaler und zytosolischer Proteine in Axonen abzubilden und zu analysieren.

Abbildung 3 zeigt repräsentative Bilder von Puls-Escape- und Puls-Spread-Experimenten. Wir haben mehrere Studien veröffentlicht, die Daten beschreiben, die mit der Puls-Escape-Methode und unseren Methoden zur Analyse dieserDaten5,6,7,8,17. Im Folgenden zeigen wir, wie die Puls-Spread-Daten Informationen über die Richtung und Gesch...

Wir beschreiben Fluoreszenz-Photoaktivierungsmethoden zur Analyse des axonalen Transports von Neurofilamenten in einzelnen myelinierten Axonen peripherer Nerven von transgenen Mäusen, die ein photoaktivierbares Neurofilamentprotein exprimieren.

Bildgebung und Analyse des Neurofilamenttransports in verbraucheten Maus-Tibialnerv

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Dieses Protokoll ermöglicht eine direkte Abbildung der Neurofilamentpopulation in myelinierten Axonen von jugendlichen oder erwachsenen Mäusen mittels Fluoreszenzmikroskopie, wodurch es möglich ist, die Richtungs- und Geschwindigkeit des Neurofilamenttransports in isolierten Nervensegmenten zu messen. Diese Methode hängt von der Verfügbarkeit von Mäusen ab, die eine photoaktivierbare fluoreszierende Fusion des Proteins von Interesse ausdrücken, kann aber für den Einsatz in jedem leicht sezierten Nerv angepasst werden. Zunächst sauerstoffhaltige Saline in eine 60-Milliliter-Spritze gießen und sicherstellen, dass nur noch wenig Luft in der Spritze vorhanden ist.Schließen Sie die Spritze an den Schlauch an, und legen Sie das Abflussrohr in einen Abfallkolben. Legen Sie die Äußere Dichtung in das Perfusionskammergehäuse, um sicherzustellen, dass die Ein- und Auslasspfosten mit den Löchern in der Dichtung ausgerichtet sind, legen Sie dann die Innendichtung auf eine Kreisförmige Abdeckung der Zahl 1,5 und glätten Sie sorgfältig alle Falten in der Dichtung, um eine enge Abdichtung zu gewährleisten. Legen Sie den Deckel und die Dichtung auf ein Papiertuch oder ein Aufgabentuch mit der Dichtung nach oben.Verwenden Sie eine große Sezierschere, um einen dorsalen Schnitt in der Haut in der Nähe der Mitte der Wirbelsäule zu machen und weiterhin um den ventralen Aspekt des Tieres zu schneiden. Ziehen Sie die Haut langsam vom Muskel weg und schneiden Sie die Faszien. Als nächstes verwenden Sie Mikrodissektionschere, um einen Schnitt in den Oberschenkelmuskeln auf halbem Weg zwischen Schwanz und Knie zu machen, um den Ischiasnerv freizulegen.Stellen Sie sicher, dass der Nerv, der durch den Muskel sichtbar ist, nicht geschnitten ist. Verlängern Sie den Schnitt dorsal und ventral, um den Muskel zu entfernen, dann entfernen Sie die Muskeln der Wade, halten Sie die Schnitte flach und kurz, um schädliche Nerven zu vermeiden. Entfernen Sie die Muskeln weiter, bis der Tibianerv vollständig von dem Punkt aus ausgesetzt ist, an dem er vom Ischiasnerv bis zur Ferse zweigt.Greifen Sie den Tibianerv am proximalen Ende der Wirbelsäule mit einer Zange und schneiden Sie ihn mit einer Mikrodissektionsschere, um sicherzustellen, dass nicht zu viel Spannung auf den Nerv angewendet wird. Heben Sie es vorsichtig vom Muskel weg und schneiden Sie alle Befestigungen, wobei Sie darauf achten, keine Spannung auf den Nerv zu setzen. Schneiden Sie das distale Ende des Tibianervs der Wirbelsäule und übertragen Sie es auf eine kleine Petrischale mit Raumtemperatur mit Sauerstoffgehalt.Ausgehend vom proximalen Ende des Nervs, greifen Sie vorsichtig die exponierten Axonenenden mit einem Paar sehr feiner Spitzenzange. Mit einem zweiten Zangenpaar die Nervenhülle proximal greifen und langsam zum distalen Ende des Nervs ziehen, um sicherzustellen, dass dabei keine übermäßige Spannung angewendet wird. Greifen Sie das proximale Ende des Nervs und legen Sie es langsam auf einen Deckelrutsch, dann richten Sie es unter sanfter Spannung.Platzieren Sie den Mikroaquedukt-Dia über den Nerv mit dem gerillten Schlitten nach unten und positionieren Sie die Strömungsrichtung parallel zum Nerv. Drehen Sie die Deckelrutsch- und Mikroaquädukt-Baugruppe um und legen Sie sie in das Perfusionskammergehäuse mit der Rutsche gegenüber der Äußerendichtung. Um die Überflusskammer zu sichern, legen Sie sie in das Metallgehäuse und drehen Sie den Verriegelungsring.Drücken Sie den Salinespritzenkolben langsam und füllen Sie die Perfusionskammer. Halten Sie den Ein- und Auslassschlauch, den Auslasskolben und die Spritze während des Aufbaus und der Bildgebung jederzeit über der Kammer selbst erhöht. Übertragen Sie die Profusionsbaugruppe auf eine invertierte Mikroskopstufe und montieren Sie die Salinespritze in die Spritzenpumpe, starten Sie dann den Motor und stellen Sie die Geschwindigkeit für eine Durchflussrate von 0,25 Milliliter pro Minute ein.Schließen Sie die Inline-Lösungsheizung an und stellen Sie sie auf 37 Grad Celsius ein. Schließen Sie die Objektivheizung an und stellen Sie sie auf 37 Grad Celsius ein. Öl auf das Objektiv auftragen und die Profusionskammer in die Bühnenhalterung einsetzen.Tragen Sie Öl auf das Kammerheizkissen auf und befestigen Sie es an der Perfusionskammer, schließen Sie es an und stellen Sie es auf 37 Grad Celsius ein. Verriegeln Sie die Profusionskammer in den Bühnenadapter und bringen Sie das Objektivöl mit dem Deckelschlupf an der Unterseite der Kammer in Kontakt. Verwenden Sie Brightfield-Beleuchtung, um sich auf die Achselschicht auf der unteren Oberfläche des Nervs zu konzentrieren, der der Deckslipoberfläche am nächsten ist.Myelinierte Axone können durch das Vorhandensein eines Myelinmantels identifiziert werden, der unter Brightfield-Lichtbeleuchtung ohne Kontrastverstärkung sichtbar ist. Erfassen Sie ein Brightfield-Referenzbild, das die Richtung des Nervs aufzeichnet, und erfassen Sie dann ein konfokales Bild mit einem 488-Nanometer-Laser und einem Emissionsfilter, der für photoaktivierbares GFP geeignet ist. Stellen Sie die Laserleistung auf etwa das Fünffache der normalen Bildleistung ein und erfassen Sie ein Bild mit einer Belichtungszeit von drei bis vier Minuten, und erfassen Sie dann ein weiteres konfokales Bild, um die Autofluoreszenz vor der Aktivierung nach dem Bleichschritt aufzuzeichnen.Zeichnen Sie eine Linie parallel zu den Axonen mit einer Länge, die der gewünschten Aktivierungsfenstergröße des Brightfield-Bildes entspricht. Zeichnen Sie diese Linie als Leitfaden über das Sichtfeld senkrecht zu den Axonen. Aktivieren Sie die GFP-Fluoreszenz in dieser Region durch Musteranregung mit dem 405-Nanometer-Licht, um sicherzustellen, dass ein Bild kurz vor und unmittelbar nach der Aktivierung aufgenommen wird.Wenn die Aktivierung abgeschlossen ist, starten Sie einen 1-Minuten-Timer. Wenn es losgeht, beginnen Sie mit der Anschaffung einer Zeitrafferserie. Fügen Sie 250 Milligramm Fluoresceinpulver zu 0,5 Milliliter doppeldestilliertem Wasser hinzu und mischen Sie es, bis keine sichtbaren Partikel vorhanden sind, und drehen Sie die Lösung dann 30 Sekunden lang in einer Tischzentrifuge, um ungelöstes Material zu sedimentieren.Fügen Sie acht Mikroliter Fluorescein-Lösung zu einem Dia hinzu und tragen Sie einen Deckelschliff mit der Nummer 1.5 auf. Die überschüssige Flüssigkeit abwischen, den Deckelrutsch mit Nagellack versiegeln und das Rutschen trocknen lassen. Platzieren Sie den Gleitdeckel seitlich nach unten auf der invertierten Mikroskopstufe und passen Sie den Fokus auf die dünne Fluoreszenzebene an der Oberfläche des Coverslips an.Bewegen Sie die Folie um, um ein Sichtfeld zu finden, das keine Luftblasen oder große Fluoresceinpartikel enthält, und erfassen Sie einen Z-Stack, der sich in 0,2 Mikrometern-Intervallen über sechs Mikrometer erstreckt, sodass das mittlere Bild die ursprüngliche Fokusebene ist. Schließen Sie alle Lichtwegläden einschließlich des Kameraverschlusses und stellen Sie die Laserleistung und die Belichtungszeit auf null Sekunden ein. Erfassen Sie einen Stapel von 100 Bildern mit diesen Einstellungen, die gemittelt werden, um das Dunkelfeldbild zu generieren.Repräsentative Bilder aus Puls-Escape- und Puls-Spread-Experimenten werden hier gezeigt. Bei der Puls-Escape-Methode kann die Fluoreszenzzerfallskinetik in der aktivierten Region Informationen über das langfristige und kurzfristige Pausenverhalten liefern. Die aktivierte Region kann für diese Experimente kurz sein.Für die Puls-Spread-Methode wird eine längere aktivierte Region verwendet, um einen größeren Pool fluoreszierender Neurofilamente bereitzustellen. Dies verlängert die Zeit, über die die Fluoreszenzzunahme in den flankierenden Regionen linear bleibt. Hier kommen 15 Mikrometer Flankenfenster zum Einsatz.Die Gesamtfluoreszenz aus dem Messfenster wurde quantifiziert. Der Zerfall ist biphasisch für die Puls-Escape-Methode mit einem anfänglichen exponentiellen Zerfall, der die Abfahrt von On-Track-Neurofilamenten darstellt, und einem zweiten langsameren exponentiellen Zerfall bei 10 bis 20 Minuten, der die Abfahrt von Off-Track-Filamenten darstellt. Für die Puls-Spread-Strategie sind die Berechnungen der Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung nur von den Steigungen in den flankierenden Fenstern abhängig.Bei den hier verwendeten Fensterlängen erstreckt sich die lineare Phase etwa fünf Minuten. Hier wird ein Zeitraffer eines glykolytisch gehemmten Nervs gezeigt, der eine offensichtliche Reduktion des Transports aus dem aktivierten Bereich zeigt. Tatsächlich sind die distalen und proximalen Neigungen bei Nerven, die mit Inhibitorbehandelt behandelt werden, signifikant niedriger.Es gibt auch einen signifikanten Rückgang der Bevölkerungsgeschwindigkeit zwischen diesen beiden Bedingungen. Denken Sie beim Versuch dieses Protokolls daran, dass es entscheidend ist, die Sektions- und Kammermontageabschnitte voreilig durchzuführen, da die Nervengesundheit nach dem Opfer des Tieres abnimmt. Die neuronale Zellkultur kann die Messung und Analyse der Bewegung einzelner Neurofilamente ermöglichen, die die mit diesem Protokoll gesammelten Populationsskaladaten ergänzen würden.

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