Ein hochdurchsatzgesteuertes, stereotaktisches Neuronavigations- und fokussiertes Ultraschallsystem für die Öffnung der Blut-Hirn-Barriere bei Nagetieren

Hochgradige Gliome wie das diffuse intrinsische Ponsgliom sind hochinvasive Tumoren mit einer hohen Mortalität. Trotz jahrelanger intensiver Forschung ist die Blut-Hirn-Schranke ein wichtiger Aspekt, da die Chemotherapie nicht in der Lage ist, das Gehirn effektiv zu erreichen. Glücklicherweise ist fokussierter Ultraschall in der Lage, die Blut-Hirn-Schranke vorübergehend und lokal zu öffnen, um wirksame Behandlungen zu ermöglichen.

Wir haben ein kleines und kostengünstiges neuronavigiertes fokussiertes Ultraschallsystem zur Störung der Blut-Hirn-Schranke entwickelt. Dieses System besteht aus kommerziell erhältlichen Komponenten und ermöglicht mit einem hohen Automatisierungsgrad präklinische Studien zur Arzneimittelbewertung. Präzisionsmedizin ist definiert als das richtige Medikament in der richtigen Dosis für den richtigen Patienten zur richtigen Zeit.

Um dies zu erreichen, müssen viele vorselektierte Medikamente gescreent werden. Unser kompaktes fokussiertes Ultraschallsystem mit hohem Durchsatz zur Störung der Blut-Hirn-Schranke ermöglicht uns genau das. Das Verfahren wird von Rianne Haumann und Elvin t Hart, zwei Doktoranden aus meiner Forschungsgruppe, vorgeführt.

Der Workflow für den bildgesteuerten stereotaktischen Neuronavigations-fokussierten Ultraschall umfasst die interventionelle Bildgebung und die akustische Kopplung für die Sonoporation an der Ultraschallplattform. Anschließend kann eine Nachuntersuchung der Bildgebung durchgeführt werden. Wählen Sie einen geeigneten Wandler basierend auf den Anforderungen des geplanten Experiments.

Legen Sie es in einen 3D-gedruckten Kegel, der mit entgastem Wasser gefüllt und unten mit einer akustisch transparenten Mylar-Membran verschlossen ist. Verbinden Sie den Wandler mit einem Funktionsgenerator und einer Endstufe. Montieren Sie den Wandler auf einem motorisierten Lineartisch für die automatische vertikale Positionierung und schließen Sie ihn an den Leistungsverstärker an.

Verwenden Sie eine abnehmbare stereotaktische Plattform, die eine temperaturgeregelte Heizung, Biss- und Ohrstangen, Anästhesie und multimodale Passermarken umfasst. Befestigen Sie die Plattform am 2D-Lineartisch. Bevor das FUS-System verwendet werden kann, kalibrieren Sie es und bestimmen Sie den Fokuspunkt des Schallkopfs.

Der Fokuspunkt entspricht der vertikalen Position des Tieres auf der stereotaktischen Plattform. Gewöhnen Sie das Tier mindestens eine Woche nach der Ankunft an die Einrichtung und wiegen Sie es regelmäßig. Am Tag des Experiments verabreichen Sie Buprenorphin über eine subkutane Injektion 30 Minuten vor der FUS-Behandlung.

Tragen Sie nach dem Betäuben der Maus Augensalbe auf, um trockene Augen zu vermeiden. Entfernen Sie bei Bedarf die Haare auf dem Kopf des Tieres mit einem Rasiermesser und einer Enthaarungscreme. Waschen Sie die Haut mit Wasser, um Rückstände zu entfernen.

Für Experimente mit BLI-Tumormodellen injizieren Sie 150 Mikroliter D-Luciferin intraperitoneal mit einer 29-Gauge-Insulinspritze. Für die Verabreichung von Mikrobläschen zur BHS-Öffnung führen Sie einen 26- bis 30-Gauge-Schwanzvenenkatheter ein und spülen Sie die Vene mit einer kleinen Menge Heparinlösung aus. Sichern Sie den Katheter mit Gewebeband, um ein Ablösen zu verhindern.

Wenn die Katheterisierung erfolgreich ist, füllen Sie den Katheter mit der Heparinlösung, um eine Blutgerinnung zu vermeiden. Platzieren Sie das Tier auf der temperaturgeregelten stereotaktischen Plattform, um eine Unterkühlung zu vermeiden. Fixieren Sie den Kopf des Tieres mit einer Beißstange und Ohrstangen und kleben Sie den Schwanz und den Katheter auf die Plattform.

Befestigen Sie das Gehäuse der Maus mit einem Riemen. Platzieren Sie die stereotaktische Plattform mit der montierten Maus in der Bildgebungsmodalität und nehmen Sie Bilder des Tieres auf. Stellen Sie fest, ob das Tier richtig auf der Plattform platziert ist.

Markieren Sie die Position des Tieres mit den multimodalen Passermarken in Kombination mit der Bildverarbeitungspipeline entsprechend dem Fokuspunkt des Schallkopfs. Bestimmen Sie den Zielbereich, indem Sie einen Gehirnumriss über das aufgenommene Röntgenbild legen oder BLI-Bilder verwenden, um das Zentrum des Tumors zu bestimmen. Schützen Sie vor dem Positionieren des Schallkopfes die Nasenlöcher und das Maul des Tieres mit Klebeband, um zu verhindern, dass das Ultraschallgel die Atmung beeinträchtigt.

Tragen Sie Ultraschallgel auf den Kopf der Maus auf, um eine gute Schallleitung zu gewährleisten. Erfassen Sie die Kavitation der Mikroblase mit dem Nadelhydrophon, das in unmittelbarer Nähe des Hinterhauptbeins platziert ist. Führen Sie den Schallkopf anhand der Kalibrierwerte in die richtige Position über dem Tier.

Wenden Sie vorkonfigurierte Einstellungen auf alle angeschlossenen Geräte an, um die gewünschte Gehirnregion anzusprechen. Nachdem der Schallkopf in die richtige Position gebracht wurde, lösen und aktivieren Sie die Mikrobläschen wie vom Hersteller beschrieben. Spülen Sie vor der Mikrobläscheninjektion den Schwanzvenenkatheter mit Kochsalzlösung, um den Zugang zur Schwanzvene zu bestätigen.

Starten Sie die Beschallungsbahn und injizieren Sie gleichzeitig die Mikrobläschen. Gleichzeitig wird das Nadelhydrophon die Kavitation von Mikroblasen in Echtzeit erkennen und verifizieren. Falls gewünscht, verabreichen Sie nach der Sonoporation ein intravaskuläres Kontrastmittel oder Medikament.

Überwachen Sie das Tier bis zu einem festgelegten Zeitpunkt. Der Schalldruck mit einem mechanischen Index von 0,4 in Kombination mit Mikrobläschen bot ein sehr empfindliches und zuverlässiges Mittel zur stabilen Kavitationsdetektion im Vergleich zu keiner Detektion von Subharmonischen, wenn keine Mikrobläschen injiziert wurden, oder der Beobachtung von Trägheitskavitation, wenn ein MI von 0,6 angewendet wurde. Während ein Schalldruck mit einem MI von bis zu 0,6 zu keiner makroskopischen Schädigung führte, wurde histologisch eine mikroskopische Schädigung bei einem MI von 0,6 nachgewiesen.

Eine Druckamplitude mit einem MI von 0,8 führte zu einer makroskopischen Hirnblutung größerer Gefäße und einer großflächigen Gewebelyse mit Extravasation von Erythrozyten. Intravenös wurde Evans-Blau injiziert, um die Öffnung der BHS in der pontinen Region zu validieren. Die Extravasation von konjugiertem Evans-Blau-Albumin wurde bei der Maus, die mit FUS und Mikrobläschen behandelt wurde, auf der Ebene des Pons und des Kleinhirns beobachtet, was eine präzise Ausrichtung auf die interessierende Region zeigt.

Die wichtigsten Schritte dieses Protokolls sind die korrekte Platzierung des Schwanzvenenkatheters, die Positionierung und Zielerfassung des Tieres sowie die Mikroblaseninjektion mit fokussiertem Ultraschall mit Kavitationserkennung. Dieses selbstgebaute fokussierte Ultraschallsystem kann für mehrere Forschungsfragen angepasst und umgestaltet werden, und das bei gleichzeitiger Kosteneffizienz und einem automatisierten Arbeitsablauf, der es für relativ unerfahrene Forscher geeignet macht.