Name: Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Lernen Sie die digitale Bildanalyse zur quantitativen Bewertung von Lungenmetastasen nach Schwanzveneninjektion von Tumorzellen. Diese Methode ermöglicht präzise und reproduzierbare Ergebnisse in der Krebsforschung.

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Repräsentative Daten wurden durch das National Cancer Institute (K22CA218549 bis S.T.S) finanziert. Zusätzlich zu ihrer Unterstützung bei der Entwicklung der umfassenden Analysemethode, über die hier berichtet wird, danken wir dem Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (Direktorin - Krista La Perle, DVM, PhD) für Histologie und Immunhistochemie und dem Pathology Imaging Core für die Entwicklung und Analyse von Algorithmen.

Die Tierverwendung folgte den Vorschriften der University Laboratory Animal Resources (ULAR) im Rahmen des vom OSU Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigten Protokolls 2007A0120-R4 (PI: Dr. Gina Sizemore).
1. Schwanzveneninjektion von Brustkrebszellen
<ol><li>Vorbereitung von Zellen und Spritze zur Injektion<ol>
<li>Platten Sie eine geeignete Anzahl von Zellen basierend auf der Anzahl der Mäuse und der zu verwendenden Zellkonzentration. HINWEIS: Die Anzahl der injizierten Zellen und die Zeit bis zur Entwicklung von Metastasen hängen von der verwendeten Zelllinie ab und müssen optimiert werden. In dieser Demonstration werden 1 x 106 MDA-MB-231-Zellen intravenös in NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) -Mäuse injiziert, und makroskopische Lungenläsionen werden spätestens 24 Tage nach der Injektion beobachtet. Für die murine Brusttumorzelllinie MVT111 werden 3 x 106 Zellen in immunkompetente FVB/N-Mäuse injiziert, wobei zahlreiche Lungenmetastasen bis 14 Tage beobachtet wurden22,23.</li>
		<li>Medien absaugen und Zellplatten mit 1x PBS spülen. Trypsinisieren Sie Zellen in minimalem Volumen, fügen Sie ein geeignetes Medienvolumen hinzu und zählen Sie Zellen mit einem Hämatozytometer oder einer anderen bevorzugten Methode. Trypanblau (0,4%) oder andere lebende / tote Zellfarbstoffe können verwendet werden, um lebensfähige Zellzahlen zu bestimmen.</li>
		<li>Pelletzellen durch Spinnen bei 180 x g für 5 min.</li>
		<li>Resuspendieren Sie eine angemessene Anzahl von Zellen in sterile 1x PBS, so dass ein Volumen von 100 μL pro Maus injiziert wird. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis, um die Lebensfähigkeit zu erhalten.</li>
		<li>Vor der Injektion die Zellen gründlich mit einer 200 μL oder 1 ml Pipette resuspendieren, um eine Verklumpung zu vermeiden. 100 μL in einer 28 G Insulinspritze aufziehen (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Beseitigen Sie Luftblasen, indem Sie die Spritze vertikal halten, auf die Spritze klopfen und den Kolben langsam einstellen. Die Injektion von Luftblasen in die Vene verursacht wahrscheinlich eine Luft- / Gasembolie, die tödlich sein kann.</li>
	</ol></li>
	<li>Seitliche Schwanzveneninjektion HINWEIS: Für experimentelle Brustkrebs-Metastasen-Assays werden Injektionen an > 6 Wochen alten weiblichen Mäusen durchgeführt.<ol>
<li>Halten Sie die Maus am Schwanz und schieben Sie das Tier in ein geschlitztes Röhrchen/Rückhaltesystem einer geeigneten Größe (siehe Materialtabelle für die verwendete Rückhalteeinrichtung).</li>
		<li>Setzen Sie den Steckerteil der Rückhaltevorrichtung ein und positionieren Sie die Maus auf der Seite, so dass ihre seitliche Schwanzvene gut sichtbar ist. Die Maus hat eine ventrale Arterie in Linie mit den Genitalien, eine dorsale Vene und zwei laterale Kaudalvenen.</li>
		<li>Reinigen Sie die Oberfläche des Schwanzes der Maus mit einem aseptischen Tuch. Fassen Sie den Schwanz zwischen Zeigefinger und Daumen mit nicht dominanter Hand und üben Sie leichte Spannung aus.</li>
		<li>Beginnend am distalen Teil des Schwanzes, führen Sie die Nadel parallel zur Vene mit dem Fasenende ein.</li>
		<li>Wenn erlaubt, rekapitulieren Sie die Nadel vorsichtig und biegen Sie sie in einen Winkel von 20-30 °. Ein Einhand-Annäherungs- oder Nadelrückgewinnungsgerät wird dringend empfohlen. HINWEIS: Es ist nicht notwendig zu aspirieren, da dies zum Kollaps der Vene führen kann. Ein kleiner Blutschnaps kann jedoch beim ersten Platzieren gesehen werden. Die Nadel wird bei richtiger Platzierung sanft in die Vene vordringen.</li>
		<li>Geben Sie langsam das gesamte Volumen in die Vene ab. Es sollte keinen Widerstand geben, wenn der Kolben gedrückt wird.</li>
		<li>Wenn ein Widerstand zu spüren ist, entfernen Sie sofort die Spritzennadel. Falls erforderlich, führen Sie die Nadel erneut ein (idealerweise nicht mehr als 3 Versuche), die sich in Richtung des proximalen Endes des Schwanzes oder der gegenüberliegenden lateralen Vene bewegt.</li>
		<li>Ein kleines Blutvolumen wird wahrscheinlich nach der Injektion verdrängt. Mit steriler Gaze sanften Druck ausüben und mit aseptischem Tuch abwischen.</li>
		<li>Entsorgen Sie die Spritze umgehend in einem geeigneten Behälter für scharfe Gegenstände.</li>
		<li>Bringen Sie die Maus in einen sauberen, belüfteten Käfig zurück und überwachen Sie sie auf Anzeichen von Stress.</li>
		<li>Überwachen Sie Mäuse 2-3x / wöchentlich auf Anzeichen von Metastasenbildung (Atemnot, gebeugte Haltung, Gewichtsverlust) und allgemeiner Belastung. Die Zeit bis zur Entwicklung der Metastasierung hängt von der Zelllinie und dem Mausstamm ab.</li>
		<li>Wenn Sie ein In-vivo-Live-Tier-Bildgebungsgerät verwenden, bilden Sie Mäuse unmittelbar nach der Schwanzveneninjektion ab, um die erfolgreiche Injektion von Zellen zu bestätigen und Zeitdaten "Null" zu erhalten (spezifische Details zur In-vivo-Biolumineszenzbildgebung sind hierin nicht enthalten, werden aber von Yang et al.24 beschrieben).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Lungengewebefixierung und Analyse der metastasierenden Lungentumorbelastung
<ol><li>Lungengewebeaufblähung zur Aufrechterhaltung des Strukturformats der Lunge für die Histopathologie<ol>
<li>Nachdem genehmigte Euthanasieverfahren (z.B. Kohlendioxid bei 30 - 70% Verschiebung des Kammervolumens/min) befolgt wurden, befestigen Sie den Mauskadaver mit Stiften an einer Seziertafel. Sprühen oder tragen Sie 70% Ethanol auf, um das Fell der Maus während der Dissektion aus dem Weg zu halten. HINWEIS: Kohlendioxiderstickung kann Lungenblutungen als erwartete Hintergrundläsion verursachen, insbesondere bei langsameren Flussraten.</li>
		<li>Öffnen Sie den Thorax mit einem Mittellinienschnitt, strecken Sie den Schnitt kranial / kaudal durch das Peritoneum und schneiden Sie das Zwerchfell weg, indem Sie den Xyphoidfortsatz greifen.</li>
		<li>Verwenden Sie eine separate Schere, um die Klingen nicht abzustumpfen, schneiden Sie die Rippen entlang jeder Seite des Brustbeins ab und entfernen Sie vorsichtig den Brustkorb, damit sich die Lunge ausdehnen kann.</li>
		<li>Isolieren Sie die Luftröhre, indem Sie submandibuläre Speicheldrüsen und infrahyoidale Muskulatur entfernen. Das Platzieren von Stiften auf beiden Seiten der Luftröhre kann unerwünschte Bewegungen während des Einführens der Nadel verhindern.</li>
		<li>Füllen Sie eine 26 G Spritze mit 2-3 ml 10% neutralem gepuffertem Formalin und geben Sie sie in die Luftröhre.</li>
		<li>Injizieren Sie langsam Formalin und achten Sie darauf, dass sich die Lunge ausdehnt (erfordert normalerweise ~ 1,5 ml Formalin).</li>
		<li>Sobald Formalin aus der Lunge austritt (übermäßiges Aufblasen vermeiden), drücken Sie die Luftröhre mit einer Pinzette ab, entfernen Sie die Spritzennadel und lösen Sie den gesamten Atemweg. Legen Sie Lunge, Herz usw. direkt in Formalin, da ein zusätzliches Trimmen des Gewebes nach der Fixierung erfolgen kann.</li>
		<li>Komplette Verarbeitung, Einbettung, Schnitt des Gewebes und Hämatoxylin- und Eosin (H & E) -Färbung mit Standardmethoden.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse der metastasierenden Lungentumorbelastung<ol>
<li>Scannen Sie H&E-gefärbte Lungenschnitte auf einem hochauflösenden Diascanner mit 40-facher Vergrößerung (Abbildung 3).</li>
		<li>Importieren Sie Bilder in bildanalytische Software (z.B. Visiopharm Image Analysis) zur Quantifizierung von Lungenmetastasen. HINWEIS: Wir empfehlen neuen Benutzern, entweder eine Vor-Ort- oder Online-Schulung zur Verwendung der Bildanalysesoftware zu erhalten. Zahlreiche Webinare sind auch über die kommerzielle Webseite verfügbar.</li>
		<li>Wählen Sie die Visiopharm 10118 H&E Lung Metastasis App aus der App-Bibliothek der Software aus. HINWEIS: Der Zweck dieser App ist es, Lungenmetastasen auf H & E-gefärbten Objektträgern zu kennzeichnen und zu quantifizieren. Im Rahmen der 10118 H&E Lung Metastasis App segmentiert der erste Bildverarbeitungsschritt das Lungengewebe mit der Tissue Detection App. Der zweite Bildverarbeitungsschritt nutzt die Metastasis Detect App, die die Metastasen im Lungengewebe identifiziert. Metastasen werden über die Form identifiziert, zusammen mit Regionen, die entweder zu unförmig, zu rot oder zu spärlich sind, um als Metastasen identifiziert zu werden.</li>
		<li>Passen Sie die Parameter, die Form und Kargheit definieren, an repräsentative Bilder an. Segmentierte Bereiche von Tumormetastasen und normalem Lungengewebe können mit unterschiedlichen Farbmarkierungen für jeden Gewebetyp dargestellt werden. HINWEIS: Für den Fall, dass die App Metastasen nicht genau vom normalen Lungengewebe trennen kann, muss möglicherweise eine benutzerdefinierte App mit dem Visiopharm Decision Forest-Programm geschrieben werden, wie es für die Experimente getan wurde (siehe Abbildung 2 und Abbildung 3). Details zum Schreiben eines benutzerdefinierten Algorithmus folgen unten. Fahren Sie andernfalls mit Schritt 2.2.9 fort.</li>
		<li>Öffnen Sie das Decision Forest-Programm, das funktioniert, indem sie mehrere Klassen [z. B. Lungengewebe (nicht neoplastisch), Metastasen, rote Blutkörperchen, Epithel und / oder Leerraum] auf einem gewünschten Bild trainieren. In Abbildung 2 sind Tumormetastasen blau, normales Gewebe grün und bronchiolares Epithel gelb. Auch rote Blutkörperchen sind in rot und Lufträume in rosa.</li>
		<li>Befolgen Sie die aufgeforderte Reihe von Ja- oder Nein-Fragen, um jede Klasse für ein Bild entsprechend zu trainieren. Die Genauigkeit des Algorithmus bestimmt die Anzahl der Ja/Nein-Fragen. Für die Analyse wurde der benutzerdefinierte Algorithmus/die App mit einer Genauigkeit von 50 (Bereich 0-100) geschrieben.</li>
		<li>Passen Sie Features für jede Klasse an, indem Sie Filter zum Schärfen, Verwischen, Sortieren nach Form usw. anwenden, um die Genauigkeit des Algorithmus / der App zu verbessern. Visiopharm zeigt jede Klasse durch eine oder mehrere Linsen an, die als Features bezeichnet werden. Features ändern, wie die Klasse das Bild sieht, um bestimmte Farben oder Intensitäten hervorzuheben. HINWEIS: Für den benutzerdefinierten Algorithmus werden Metastasen mit einer Größe von 8500 μm2 und mehr als Metastasen markiert und gemessen. Dies erklärt Größenvarianzen und Metastasen, die zu klein sind, um sie zu erkennen. Kleine unförmige Bereiche und kleine metastatische Bereiche unter 8500 μm2 wurden in die normale Gewebequantifizierung einbezogen.</li>
		<li>Speichern Sie die geänderten Einstellungen entweder in der App oder im benutzerdefinierten Algorithmus und wenden Sie dann den Algorithmus / die App auf einen ganzen Satz oder eine Reihe von H & E-gefärbten Geweben an.</li>
		<li>Exportieren Sie schließlich alle Ausgabevariablen, einschließlich der in Tabelle 1 aufgeführten Variablen. Die Fläche in Mikrometern zum Quadrat (μm2) kann für jeden Gewebetyp quantifiziert werden, und die Prozentsätze werden aus der gesamten Nettogewebefläche der Probe (d. H. Gesamtgewebe minus Luftraum) abgeleitet.</li>
		<li>Wenn Sie einen benutzerdefinierten Algorithmus erstellen, überprüfen Sie die Gewebemarkierungen in Absprache mit einem vom American College of Veterinary Pathologists zertifizierten Veterinärpathologen, um genaue Messungen sicherzustellen und zwischen Gewebetypen zu unterscheiden.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Bone+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+orthotopic+mouse+models+of+patient-derived+breast+cancer+brain+metastases+by+a+modified+intracarotid+injection+method%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method.</a> Scientific Reports. 9 (1), 622(2019).</li>
<li>Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+strategies+for+treating+brain+metastases+from+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer.</a> Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).</li>
<li>Brown, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Stereology+Applications+for+the+Pathologist%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Practical Stereology Applications for the Pathologist.</a> Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).</li>
<li>Aeffner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Microscopy%2C+Image+Analysis%2C+and+Virtual+Slide+Repository%5BTitle%5D)+AND+%22Institute+for+Laboratory+Animal+Research+Journal%22%5BJournal%5D)">Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Da die Forscher weiterhin die intravenöse Injektion von Tumorzellen als experimentelles Modell für die Metastasierung verwenden, fehlen Standardpraktiken zur Analyse der resultierenden metastasierenden Tumorbelastung. In einigen Fällen können signifikante Unterschiede in der metastasierenden Tumorbelastung bei Manipulation bestimmter Zelllinien und/oder Verwendung chemischer Verbindungen makroskopisch beobachtet werden. In anderen Fällen können jedoch subtile Unterschiede in der metastatischen Aussaat und im Wachstum ohn...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61270/pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein">Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells</a>. The author list was updated.
The author list was updated from:
Katie A. Thies1,&#160;Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University
to:
Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61270/pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein">Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells</a>. The author list was updated.

Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Obwohl es sich um einen hochkomplexen und ineffizienten Prozess1 handelt, trägt die Metastasierung wesentlich zur Morbidität und Mortalität von Krebspatienten bei2. Tatsächlich werden die meisten krebsbedingten Todesfälle auf die metastasierende Ausbreitung der Krankheit zurückgeführt3,4. Damit Tumorzellen erfolgreich metastasieren können, müssen sie sich von der primären Stelle lösen, durch angrenzendes Stroma eindringen, in den Blutkreislauf oder die Lymphgefäße intravasieren, zum Kapillarbett einer sekundären Stelle wandern, in das Sekundärgewebe extravasieren und sich vermehren oder wachsen, um metastasierende Läsionen zu bilden5. Die Verwendung von Mausmodellen war entscheidend für das Verständnis der molekularen Mechanismen, die für metastatische Aussaat und Wachstum verantwortlich sind6,7. Dabei konzentrieren wir uns auf die Metastasierung von Brustkrebs, für die häufig sowohl gentechnisch veränderte Mausmodelle als auch Transplantationsmethoden eingesetzt werden – jede mit ihren eigenen Vorteilen und Einschränkungen.
Gentechnisch veränderte Brusttumormodelle nutzen brustdrüsenspezifische Promotoren, einschließlich MMTV-LTR (Mouse Mammary Tumor Virus Long Terminal Repeat) und WAP (Whey Acidic Protein), um die Expression von Transgenen im Brustepithel zu steuern8. Onkogene einschließlich Polyom mittleres T-Antigen (PyMT), ErbB2 / Neu, c-Myc, Wnt-1 und Affenvirus 40 (SV40) wurden auf diese Weise exprimiert9,10, 11, 12, 13, und während diese genetischen Modelle für die Untersuchung der Primärtumorinitiation und -progression nützlich sind, metastasieren nur wenige leicht in entfernte Organe. Darüber hinaus sind diese genetischen Mausmodelle oft zeit- und kostenintensiver als spontane oder experimentelle Metastasierungsmodelle. Angesichts der Beschränkung der meisten gentechnisch veränderten Brusttumormodelle auf die Untersuchung von Metastasen sind Transplantationstechniken zu attraktiven Methoden geworden, um diesen komplexen Prozess zu untersuchen. Dazu gehören orthotope, Schwanzvenen-, intrakardiale und intrakranielle Injektion geeigneter Zelllinien.
Obwohl mehrere Brustkrebszelllinien nach orthotopischer Injektion in das Brustfettpolster leicht metastasieren14,15, kann die Konsistenz und Reproduzierbarkeit der metastasierenden Tumorbelastung eine Herausforderung darstellen, und die Dauer solcher Studien kann in der Größenordnung von mehreren Monaten liegen. Insbesondere zur Beurteilung der Lungenmetastasierung ist die intravenöse Injektion in die Schwanzvene oft eine reproduzierbarere und zeiteffektivere Methode, wobei die metastatische Ausbreitung typischerweise innerhalb weniger Wochen auftritt. Da das intravenöse Injektionsmodell jedoch die ersten Schritte der metastatischen Kaskade umgeht, ist bei der Interpretation der Ergebnisse dieser Studien Vorsicht geboten. In dieser Demonstration zeigen wir die Schwanzveneninjektion von Brusttumorzellen zusammen mit einer genauen und umfassenden Analysemethode.
Obwohl die Forschungsgemeinschaft erhebliche Fortschritte beim Verständnis des komplexen Prozesses der Brustkrebsmetastasierung gemacht hat, wird geschätzt, dass derzeit über 150.000 Frauen an metastasierendem Brustkrebs leiden16. Von den Patienten mit Brustkrebs im Stadium IV haben >36% der Patientinnen Lungenmetastasen17; Das ortsspezifische Muster und die Inzidenz von Metastasen können jedoch je nach molekularem Subtyp variieren18,19,20,21. Patientinnen mit Brustkrebs-assoziierten Lungenmetastasen haben ein medianes Überleben von nur 21 Monaten, was die Notwendigkeit unterstreicht, wirksame Behandlungen und neuartige Biomarker für diese Krankheit zu identifizieren17. Die Verwendung experimenteller Metastasierungsmodelle, einschließlich der intravenösen Injektion von Tumorzellen, wird unser Wissen über diese wichtige klinische Herausforderung weiter voranbringen. In Kombination mit der digitalen Bildgebungspathologie und der in diesem Protokoll beschriebenen Methode der metastasierenden Lungentumorlastanalyse sind Schwanzveneninjektionen ein wertvolles Werkzeug für die Brustkrebsmetastasenforschung.

<table><tbody><tr><td>Alkohol-Vorbereitungskissen</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td><stark>zur Reinigung des Schwanzes vor der Injektion</stark></td></tr><tr><td>Dissektionsschere</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-5</td><td><stark>zum Aufpumpen von Lungengewebe</stark></td></tr><tr><td>DMEM mit L-Glutamin, 4,5 g/l Glukose und Natriumpyruvat</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10013CV</td><td>Basis für Zellkulturmedien für die Zelllinien MDA-MB-231 und MVT1</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphat-Buffered Salt Solution 1x</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21030CV</td><td>zur Resuspendierung von Tumorzellen für die Injektion</td></tr><tr><td>Ethanol (70 %ige Lösung)</td><td>OSU</td><td></td><td>zur Minimierung des Mausfells während der Dissektion; Vorsicht - brennbarer</td></tr><tr><td>Evan's Blue Farbstoff</td><td>Millipore Sigma</td><td>E2129</td><td>Verwendung in einem Verhältnis von 1 % in sterilem PBS für die Praxis mit der Schwanzvenen-Injektionsmethode; Vorsicht walten lassen - gefährliches Reagenz</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Millipore Sigma</td><td>F4135</td><td>Zusatzstoff für Zellkulturmedien; wird zu 10 % in DMEM-Pinzetten verwendet</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>10-270</td><td>zur Dissektion und Inflation von Lungengewebe</td></tr><tr><td>FVB/NJ Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>001800</td><td>syngener Mausstamm für MVT1-Zellen</td></tr><tr><td>Hämazytometer (Bright-Line)</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z359629</td><td>zur Verwendung in Zellkulturen zur Gewinnung von Zellzahlen</td></tr><tr><td>Insulinspritze (28 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-1B</td><td>für Schwanzveneninjektionen (BD 329424)</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 Zellen</td><td>ATCC</td><td></td><td>humane Brustkrebszelllinie</td></tr><tr><td>MVT1-Zellen Brusttumorzellen</td><td></td><td></td><td>von Mäusen</td></tr><tr><td>Nadeln (26 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-15</td><td>zum Aufblasen von Lungenneutrales</td></tr><tr><td>gepuffertes Formalin (10%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>245685</td><td>als Gewebefixiermittel und zum Aufblasen von Lungengewebe verwendet; Vorsicht - gefährliches Reagenz</td></tr><tr><td>NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) Mäuse</td><td>Das Jackson Laboratory</td><td>005557</td><td>geführt von OSUCCC Target Validation Shared Resource</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin 100x</td><td>ThermoFisher</td><td>15140163</td><td>Zellkulturmedien Additiv</td></tr><tr><td>sterile Gaze</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9379092</td><td>zum Ausüben von Druck auf den Schwanz der Maus, wenn Blutungen auftreten</td></tr><tr><td>Spritze (5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-458</td><td>zum Aufblasen von Lungengewebe von Mäusen</td></tr><tr><td>Schwanzvenen-Halterung</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>TV-150 STD</td><td>zur Fixierung von Mäusen für Schwanzveneninjektionen</td></tr><tr><td>Trypanblau (0,4 %)</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>in Zellkulturen zur Beurteilung der Lebensfähigkeit verwendet</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,25 %</td><td>ThermoFisher</td><td>25200-114</td><td>wird in Zellkulturen verwendet, um Tumorzellen von der Platte zu lösen</td></tr></tbody></table>

pathologische analyse der lungenmetastasierung nach lateraler schwanzveneninjektion von tumorzellen

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasen, die Hauptursache für Morbidität und Mortalität bei den meisten Krebspatienten, können bei Mäusen präklinisch zu modellieren sein. Es stehen nur wenige spontane Metastasenmodelle zur Verfügung. Somit ist das experimentelle Metastasenmodell mit Tail-Vein-Injektion geeigneter Zelllinien eine tragende Säule der Metastasenforschung. Wenn Krebszellen in die laterale Schwanzvene injiziert werden, ist die Lunge ihr bevorzugter Ort der Kolonisation. Eine mögliche Einschränkung dieser Technik ist die genaue Quantifizierung der metastasierenden Lungentumorbelastung. Während einige Forscher Makrometastasen einer vordefinierten Größe zählen und / oder Mikrometastasen nach dem Schneiden des Gewebes einschließen, bestimmen andere den Bereich der metastatischen Läsionen relativ zum normalen Gewebebereich. Beide Quantifizierungsmethoden können äußerst schwierig sein, wenn die metastatische Belastung hoch ist. Hierin demonstrieren wir ein intravenöses Injektionsmodell der Lungenmetastasierung, gefolgt von einer fortschrittlichen Methode zur Quantifizierung der metastasierenden Tumorbelastung unter Verwendung von Bildanalysesoftware. Dieser Prozess ermöglicht die Untersuchung mehrerer Endpunktparameter, einschließlich der durchschnittlichen Metastasengröße, der Gesamtzahl der Metastasen und des gesamten Metastasenbereichs, um eine umfassende Analyse zu ermöglichen. Darüber hinaus wurde diese Methode von einem Veterinärpathologen überprüft, der vom American College of Veterinary Pathologists (SEK) zertifiziert wurde, um die Genauigkeit zu gewährleisten.

Wenn nicht markierte Zellen für die Injektion von Schwanzvenen verwendet werden, kann es schwierig sein, die Lungenkolonisation bis (1) zum Zeitpunkt der Nekropsie zu bestätigen, wenn Makrometastasen beobachtet werden können, oder (2) nach einer histologischen Analyse, wenn mikroskopische Metastasen vorliegen. Bei ausgedehnter metastasierender Lungentumorbelastung haben Mäuse Atembeschwerden. Wie bei jeder Tumorstudie sollten Mäuse während der gesamten Studiendauer sorgfältig überwacht werden. Die Verwendung von markiert...

Die intravenöse Injektion von Krebszellen wird häufig in der Metastasenforschung eingesetzt, aber die metastasierende Tumorbelastung kann schwer zu analysieren sein. Hierin demonstrieren wir ein Schwanzvenen-Injektionsmodell der Metastasierung und beinhalten einen neuartigen Ansatz zur Analyse der resultierenden metastasierenden Lungentumorbelastung.

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Derzeit gibt es keinen Goldstandard für die Analyse der durch Schwanzveneninjektion induzierten metastasierenden Lungentumorlasten. Wir nutzten die digitale Bildanalyse, um Lungenmetastasen auf hocheffiziente Weise genau und reproduzierbar zu quantifizieren. Diese Methode ist zeit- und kosteneffizient.Und in Verbindung mit der digitalen Bildanalyse ermöglicht es eine hochgenaue und umfassende Analyse der resultierenden Lungenmetastasierungstumorlast. Um menschliche Brustkrebszellen für die Injektion vorzubereiten, wird zunächst eine geeignete Anzahl von Zellen in ein geeignetes Zellkulturmedium gegeben, basierend auf der Anzahl der Mäuse und der zu verwendenden Zellkonzentration. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreichen, waschen Sie die Platten mit PBS und lösen Sie die Zellen in einem minimalen Volumen Trypsin gemäß den Standardprotokollen ab.Wenn sich die Zellen abgelöst haben, suspendieren Sie die Zellen zur Zählung wieder in frischem Kulturmedium und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Dann suspendieren Sie die Zellen in der entsprechenden Konzentration in 100 Mikrolitern PBS pro Maus auf Eis. Suspendieren Sie die Zellen kurz vor der Injektion gründlich wieder auf Eis, um ein Verklumpen zu vermeiden, und geben Sie 100 Mikroliter der Zellen in eine 28-Gauge-Insulinspritze.Halten Sie die Spritze senkrecht und klopfen Sie auf den Schaft, während Sie den Kolben langsam einstellen, um Blasen zu entfernen. Falls zulässig, verschließen Sie die Nadel vorsichtig wieder und biegen Sie die Nadelspitze in einem Winkel von 20 bis 30 Grad. Fesseln Sie eine mehr als sechs Wochen alte weibliche Maus in eine Plastik-Maushalterung und positionieren Sie die Maus so auf die Seite, dass ihre seitliche Schwanzvene leicht zu sehen ist.Lokalisieren Sie die Arteria ventralis in einer Linie mit den Genitalien, einer Vena dorsal und zwei Vena caudle lateralis und reinigen Sie die Schwanzoberfläche mit einem aseptischen Tuch. Fassen Sie den Schwanz zwischen dem Zeigefinger und dem Daumen der nicht dominanten Hand, üben Sie eine leichte Spannung aus und führen Sie die Nadel beginnend am distalen Teil des Schwanzes mit der schrägen Seite nach oben, parallel zur Vene, ein. Geben Sie langsam das gesamte Zellvolumen in die Vene ab.Nach der Injektion wird wahrscheinlich ein kleines Blutvolumen verdrängt. Üben Sie mit einer sterilen Gaze sanften Druck auf die Injektionsstelle aus. Entsorgen Sie dann die Spritze in einem geeigneten Behälter für scharfe Gegenstände und setzen Sie die Maus in einen sauberen, belüfteten Käfig mit Überwachung.Führen Sie innerhalb von nicht mehr als einer Stunde nach der Schwanzveneninjektion eine In-vivo-Bildgebung an lebenden Tieren durch, um eine erfolgreiche Zellinjektion zu bestätigen und Zeit-Null-Daten zu erhalten. Um das strukturelle Format der Lunge für die Histopathologie beizubehalten, befestigen Sie die Maus an einem Präparierbrett und befeuchten Sie das Fell mit 70%igem Ethanol. Öffnen Sie den Thorax mit einem Mittellinienschnitt, verlängern Sie den Schnitt kranial und kaudal durch das Peritoneum und fassen Sie den Xiphoid-Prozess, um die Entfernung des Zwerchfells zu ermöglichen.Schneiden Sie mit einer zweiten Schere die Rippen entlang jeder Seite des Brustbeins ab und entfernen Sie vorsichtig den Brustkorb, um Platz für die Ausdehnung der Lunge zu lassen. Um die Luftröhre zu isolieren, entfernen Sie die submandibulären Speicheldrüsen und die infrahyoidale Muskulatur und platzieren Sie Stifte auf beiden Seiten der Luftröhre, um unerwünschte Bewegungen während des Einführens der Nadel zu verhindern. Laden Sie eine Drei-Milliliter-Spritze, die mit einer 26-Gauge-Nadel ausgestattet ist, mit zwei bis drei Millilitern 10 % neutral gepuffertem Formelin und führen Sie die Nadel in die Luftröhre ein.Injizieren Sie langsam das Formelin, während Sie darauf achten, dass sich die Lunge ausdehnt. Sobald das Formelin aus der Lunge auszutreten beginnt, verwenden Sie eine Pinzette, um die Luftröhre abzuklemmen und die Nadel zu entfernen. Nehmen Sie dann das gesamte Atmungsgerät ab und legen Sie die Organe direkt in einen Behälter mit frischem Formelin.Für die Analyse der metastasierten Lungentumorlast scannen Sie H&E-gefärbte Lungengewebeschnitte auf einem hochauflösenden Objektträgerscanner mit einer 40-fachen Vergrößerung und importieren Sie die Bilder in ein geeignetes Bildanalysesoftwareprogramm. Passen Sie die Parameter an, die die Form und Sparsamkeit definieren, um sie optimal an die Bilder anzupassen. Um die segmentierten Bereiche von Tumormetastasen und normalem Lungengewebe mit unterschiedlichen farbigen Beschriftungen für jeden Gewebetyp anzuzeigen, öffnen Sie das Decision Forest-Programm, und befolgen Sie die eingeforderte Reihe von Ja- oder Nein-Fragen, um jede Klasse entsprechend für ein Bild zu trainieren.Um die Funktionen für jede Klasse anzupassen, wenden Sie Filter zum Schärfen, Weichzeichnen oder Sortieren nach Form an, um die Genauigkeit des Algorithmus zu verbessern. In dieser Analyse erscheinen die Tumormetastasen in blau. Das normale Gewebe ist grün und das bronchioläre Epithel ist gelb.Rote Blutkörperchen sind in Rot zu sehen, und Lufträume erscheinen in Rosa. Wenn alle Funktionen eingestellt wurden, speichern Sie die geänderten Einstellungen und wenden Sie den Algorithmus auf den gesamten Satz oder die Serie von H&E-gefärbten Geweben an. Exportieren Sie dann alle Ausgabevariablen, um die Fläche in Mikrometerquadrat für jeden Gewebetyp zu quantifizieren und die Berechnung der Prozentsätze aus der gesamten Nettogewebefläche der Probe zu ermöglichen.Das Vorhandensein eines Biolumineszenzsignals im Thoraxraum weniger als zwei Stunden nach der Schwanzveneninjektion von Luciferase-markierten humanen epithelialen Brustkrebszellen kann als Bestätigung einer genauen Injektion angesehen werden. In diesem Experiment stiegen die Photonenzahlen im Thoraxbereich im Laufe der Zeit an und ein starkes Biolumineszenzsignal war auch am Tag 24 nach der Injektion noch vorhanden. Zum Zeitpunkt der Autopsie wurden bei diesen Mäusen viele makroskopische Lungenläsionen beobachtet.Mit Hilfe von Bildanalysesoftware und einem benutzerdefinierten Algorithmus, wie gezeigt, kann das gesamte Lungengewebe nach verschiedenen Gewebemerkmalen segmentiert werden. Durch diese Segmentierung des Lungengewebes kann die Software verschiedene Parameter quantifizieren. Hier werden Rohdaten aus einer Analyse von Lungengewebe von Mäusen gezeigt, denen humane epitheliale Brustkrebszellen injiziert wurden, gefolgt von einer Behandlung mit einem Medikament, das die Metastasierung blockieren soll.Wie diese Bilder zeigen, könnte ein Unterschied in der metastasierten Tumorlast zwischen diesen Behandlungsgruppen leicht übersehen worden sein, da die Gesamtzahl der Lungenknoten nicht unterschiedlich ist. Eine umfassende Analyse aller Parameter zeigte jedoch einen signifikanten Unterschied in der prozentualen Netto-Lungenmetastasenfläche, was die Notwendigkeit eines gründlichen Ansatzes für die Analyse der metastasierten Lungentumorlast unterstreicht. Eine ordnungsgemäße Zellresuspension ohne Luftblasen ist entscheidend für die Vorbeugung von Lungenembolien, und eine erfolgreiche Lungeninflation trägt dazu bei, die Integrität der Gewebestruktur für eine genaue Bildanalyse zu erhalten. Die Immunfärbung des Lungengewebes kann durchgeführt werden, um das Vorhandensein von Zellen oder Proteinen von Interesse in den Lungenläsionen oder der Lungenmikroumgebung zu bestimmen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieser Artikel beschreibt die Verfahren der experimentellen Metastasierung Assay, mit denen die metastatische Potential von humanen Krebszelllinien zu bestimmen.

Experimentelle Metastase Assay

Dieses Video beschreibt eine Technik zur Injektion markierter Krebszellen mittels Schwanzveneninjektion in ein Mausmodell. Darüber hinaus überwachen wir die Metastasierung und das Wachstum von Brustkrebs mit Hilfe von Echtzeit-In-vivo-Bildgebung von lebenden Tieren.

Schwanzveneninjektion: Eine Methode zur Verabreichung von Krebszellen für Metastasierungsstudien in einem Mausmodell

In diesem Video werden Melanomzellen im Mausmodell intravenös durch die Schwanzvene injiziert. Die Melanomzellen wandern weiter durch das Kreislaufsystem, passen sich an die entfernte Mikroumgebung an und verursachen Metastasen in Organen wie der Lunge.

Experimentelles Mausmodell für metastasiertes Melanom: Eine Plattform zur Untersuchung des metastasierenden Potenzials von Melanomzellen in der Lunge

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur Quantifizierung der Tumor Zelle Ansammlung in der Lunge in einem Tiermodell der Tumor Metastasen.

Lung Tumor Zelle Rekrutierung Assay

Metastasierung spielt eine tiefgreifende Rolle bei der Virulenz von Krebs und ist schätzungsweise für 90% der Todesfälle verantwortlich.  Wir berichten über ein Protokoll für ein metastasiertes Melanommodell in Mäusen, das nützlich ist, um die Wirksamkeit von Therapeutika gegen dieses klinische Phänomen zu bestimmen.

Die Injektion von syngenen murinen Melanomzellen ihre metastatische Potential in der Lunge zu bestimmen

Es wurde ein chirurgisches Verfahren entwickelt, um Brusttumorzellen über eine Pfortaderinjektion in die Mausleber zu bringen. Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung der späten Stadien der Lebermetastasierung in einem vollständig immunkompetenten Wirt, einschließlich der Extravasation von Tumorzellen, der Aussaat, des Überlebens und des Metastasierungsauswuchses in der Leber.

Ein Portal Veneninjektion Modell zur Untersuchung der Leber Metastasierung von Brustkrebs

Das Ziel dieses Artikels ist es, eine detaillierte Beschreibung des Protokolls für die pulmonalen Metastasen-Assay (PuMA) zur Verfügung zu stellen. Dieses Modell erlaubt Forschern, metastasierendem Osteosarkom (OS) Zellwachstum im Lungengewebe mit Weitfeld-Fluoreszenz oder konfokale Laserscanning-Mikroskop zu studieren.

Praktische Überlegungen an einem Studium von metastasierendem Lungenkrebs Besiedlung in Osteosarkom mit pulmonalen Metastasen-Assay

Einem Tiermodell wird benötigt, um die Rolle der zirkulierende Tumorzellen (CTC) bei der Förderung der Lunge Kolonisation in Krebsmetastasen zu entschlüsseln. Hier wir etabliert und erfolgreich durchgeführt eine in Vivo assay, speziell Test das Erfordernis der Polymeren Fibronektin (PolyFN) Montage auf CTCs zur Besiedlung der Lunge.

Die Einrichtung eines Lunge Kolonisation Assays für zirkulierenden Tumor Zelle Visualisierung im Lungengewebe

Der beschriebene Ansatz kombiniert experimentelle Schwanzvenenmetastasierungs-Assays mit in vivo Live-Tier-Imaging, um neben der Quantifizierung der Metastasenzahl und -größe in der Lunge auch die Echtzeit-Überwachung der Bildung und des Wachstums von Brustkrebsmetastasen zu ermöglichen.

Kombinierte Verwendung von Tail Vein Metastasis Assays und Real-Time In Vivo Imaging zur Quantifizierung der metastasierenden Kolonisation und Belastung von Brustkrebs in der Lunge

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Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von entzündlichen Brustkrebszellen in die Schwanzvene

Das Manuskript beschreibt eine Methodik für die Etablierung sowie das longitudinale Wachstumsmonitoring von spontanen Lungenmetastasen von orthotopisch injizierten Brusttumoren, die in allen Stadien der Metastasierungskaskade interveniert werden kann.

Im lebenden Organismus Bildgebung zur Messung der spontanen Lungenmetastasierung von orthotopisch injizierten Brusttumorzellen

Lernen Sie die digitale Bildanalyse zur quantitativen Bewertung von Lungenmetastasen nach Schwanzveneninjektion von Tumorzellen. Diese Methode ermöglicht präzise und reproduzierbare Ergebnisse in der Krebsforschung.

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

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