Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Derzeit gibt es keinen Goldstandard für die Analyse der durch Schwanzveneninjektion induzierten metastasierenden Lungentumorlasten. Wir nutzten die digitale Bildanalyse, um Lungenmetastasen auf hocheffiziente Weise genau und reproduzierbar zu quantifizieren. Diese Methode ist zeit- und kosteneffizient.

Und in Verbindung mit der digitalen Bildanalyse ermöglicht es eine hochgenaue und umfassende Analyse der resultierenden Lungenmetastasierungstumorlast. Um menschliche Brustkrebszellen für die Injektion vorzubereiten, wird zunächst eine geeignete Anzahl von Zellen in ein geeignetes Zellkulturmedium gegeben, basierend auf der Anzahl der Mäuse und der zu verwendenden Zellkonzentration. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreichen, waschen Sie die Platten mit PBS und lösen Sie die Zellen in einem minimalen Volumen Trypsin gemäß den Standardprotokollen ab.

Wenn sich die Zellen abgelöst haben, suspendieren Sie die Zellen zur Zählung wieder in frischem Kulturmedium und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Dann suspendieren Sie die Zellen in der entsprechenden Konzentration in 100 Mikrolitern PBS pro Maus auf Eis. Suspendieren Sie die Zellen kurz vor der Injektion gründlich wieder auf Eis, um ein Verklumpen zu vermeiden, und geben Sie 100 Mikroliter der Zellen in eine 28-Gauge-Insulinspritze.

Halten Sie die Spritze senkrecht und klopfen Sie auf den Schaft, während Sie den Kolben langsam einstellen, um Blasen zu entfernen. Falls zulässig, verschließen Sie die Nadel vorsichtig wieder und biegen Sie die Nadelspitze in einem Winkel von 20 bis 30 Grad. Fesseln Sie eine mehr als sechs Wochen alte weibliche Maus in eine Plastik-Maushalterung und positionieren Sie die Maus so auf die Seite, dass ihre seitliche Schwanzvene leicht zu sehen ist.

Lokalisieren Sie die Arteria ventralis in einer Linie mit den Genitalien, einer Vena dorsal und zwei Vena caudle lateralis und reinigen Sie die Schwanzoberfläche mit einem aseptischen Tuch. Fassen Sie den Schwanz zwischen dem Zeigefinger und dem Daumen der nicht dominanten Hand, üben Sie eine leichte Spannung aus und führen Sie die Nadel beginnend am distalen Teil des Schwanzes mit der schrägen Seite nach oben, parallel zur Vene, ein. Geben Sie langsam das gesamte Zellvolumen in die Vene ab.

Nach der Injektion wird wahrscheinlich ein kleines Blutvolumen verdrängt. Üben Sie mit einer sterilen Gaze sanften Druck auf die Injektionsstelle aus. Entsorgen Sie dann die Spritze in einem geeigneten Behälter für scharfe Gegenstände und setzen Sie die Maus in einen sauberen, belüfteten Käfig mit Überwachung.

Führen Sie innerhalb von nicht mehr als einer Stunde nach der Schwanzveneninjektion eine In-vivo-Bildgebung an lebenden Tieren durch, um eine erfolgreiche Zellinjektion zu bestätigen und Zeit-Null-Daten zu erhalten. Um das strukturelle Format der Lunge für die Histopathologie beizubehalten, befestigen Sie die Maus an einem Präparierbrett und befeuchten Sie das Fell mit 70%igem Ethanol. Öffnen Sie den Thorax mit einem Mittellinienschnitt, verlängern Sie den Schnitt kranial und kaudal durch das Peritoneum und fassen Sie den Xiphoid-Prozess, um die Entfernung des Zwerchfells zu ermöglichen.

Schneiden Sie mit einer zweiten Schere die Rippen entlang jeder Seite des Brustbeins ab und entfernen Sie vorsichtig den Brustkorb, um Platz für die Ausdehnung der Lunge zu lassen. Um die Luftröhre zu isolieren, entfernen Sie die submandibulären Speicheldrüsen und die infrahyoidale Muskulatur und platzieren Sie Stifte auf beiden Seiten der Luftröhre, um unerwünschte Bewegungen während des Einführens der Nadel zu verhindern. Laden Sie eine Drei-Milliliter-Spritze, die mit einer 26-Gauge-Nadel ausgestattet ist, mit zwei bis drei Millilitern 10 % neutral gepuffertem Formelin und führen Sie die Nadel in die Luftröhre ein.

Injizieren Sie langsam das Formelin, während Sie darauf achten, dass sich die Lunge ausdehnt. Sobald das Formelin aus der Lunge auszutreten beginnt, verwenden Sie eine Pinzette, um die Luftröhre abzuklemmen und die Nadel zu entfernen. Nehmen Sie dann das gesamte Atmungsgerät ab und legen Sie die Organe direkt in einen Behälter mit frischem Formelin.

Für die Analyse der metastasierten Lungentumorlast scannen Sie H&E-gefärbte Lungengewebeschnitte auf einem hochauflösenden Objektträgerscanner mit einer 40-fachen Vergrößerung und importieren Sie die Bilder in ein geeignetes Bildanalysesoftwareprogramm. Passen Sie die Parameter an, die die Form und Sparsamkeit definieren, um sie optimal an die Bilder anzupassen. Um die segmentierten Bereiche von Tumormetastasen und normalem Lungengewebe mit unterschiedlichen farbigen Beschriftungen für jeden Gewebetyp anzuzeigen, öffnen Sie das Decision Forest-Programm, und befolgen Sie die eingeforderte Reihe von Ja- oder Nein-Fragen, um jede Klasse entsprechend für ein Bild zu trainieren.

Um die Funktionen für jede Klasse anzupassen, wenden Sie Filter zum Schärfen, Weichzeichnen oder Sortieren nach Form an, um die Genauigkeit des Algorithmus zu verbessern. In dieser Analyse erscheinen die Tumormetastasen in blau. Das normale Gewebe ist grün und das bronchioläre Epithel ist gelb.

Rote Blutkörperchen sind in Rot zu sehen, und Lufträume erscheinen in Rosa. Wenn alle Funktionen eingestellt wurden, speichern Sie die geänderten Einstellungen und wenden Sie den Algorithmus auf den gesamten Satz oder die Serie von H&E-gefärbten Geweben an. Exportieren Sie dann alle Ausgabevariablen, um die Fläche in Mikrometerquadrat für jeden Gewebetyp zu quantifizieren und die Berechnung der Prozentsätze aus der gesamten Nettogewebefläche der Probe zu ermöglichen.

Das Vorhandensein eines Biolumineszenzsignals im Thoraxraum weniger als zwei Stunden nach der Schwanzveneninjektion von Luciferase-markierten humanen epithelialen Brustkrebszellen kann als Bestätigung einer genauen Injektion angesehen werden. In diesem Experiment stiegen die Photonenzahlen im Thoraxbereich im Laufe der Zeit an und ein starkes Biolumineszenzsignal war auch am Tag 24 nach der Injektion noch vorhanden. Zum Zeitpunkt der Autopsie wurden bei diesen Mäusen viele makroskopische Lungenläsionen beobachtet.

Mit Hilfe von Bildanalysesoftware und einem benutzerdefinierten Algorithmus, wie gezeigt, kann das gesamte Lungengewebe nach verschiedenen Gewebemerkmalen segmentiert werden. Durch diese Segmentierung des Lungengewebes kann die Software verschiedene Parameter quantifizieren. Hier werden Rohdaten aus einer Analyse von Lungengewebe von Mäusen gezeigt, denen humane epitheliale Brustkrebszellen injiziert wurden, gefolgt von einer Behandlung mit einem Medikament, das die Metastasierung blockieren soll.

Wie diese Bilder zeigen, könnte ein Unterschied in der metastasierten Tumorlast zwischen diesen Behandlungsgruppen leicht übersehen worden sein, da die Gesamtzahl der Lungenknoten nicht unterschiedlich ist. Eine umfassende Analyse aller Parameter zeigte jedoch einen signifikanten Unterschied in der prozentualen Netto-Lungenmetastasenfläche, was die Notwendigkeit eines gründlichen Ansatzes für die Analyse der metastasierten Lungentumorlast unterstreicht. Eine ordnungsgemäße Zellresuspension ohne Luftblasen ist entscheidend für die Vorbeugung von Lungenembolien, und eine erfolgreiche Lungeninflation trägt dazu bei, die Integrität der Gewebestruktur für eine genaue Bildanalyse zu erhalten. Die Immunfärbung des Lungengewebes kann durchgeführt werden, um das Vorhandensein von Zellen oder Proteinen von Interesse in den Lungenläsionen oder der Lungenmikroumgebung zu bestimmen.