Name: Dissektion, Immunhistochemie und Montage von Larven und adulten Drosophila-Gehirnen zur Visualisierung des Sehlappens (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Lernen Sie die Präparation von Drosophila-Gehirnen durch Dissektion, Immunhistochemie und Montage zur Visualisierung des Sehlappens. Drei Montagestrategien ermöglichen optimale Bildgebung spezifischer Strukturen.

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Wir danken Claude Desplan dafür, dass er uns ein Aliquot des Bsh-Antikörpers zur Verfügung gestellt hat. Die monoklonalen Antikörper DE-Cadherin, Dackel, Eyes Absent, Seven-up und Bruchpilot wurden von der Developmental Studies Hybridoma Bank gewonnen, die vom NICHD der NIH gegründet und an der University of Iowa, Department of Biology, Iowa City, IA 52242, aufbewahrt wird. Diese Arbeit wurde durch einen NSERC Discovery Grant unterstützt, der an T.E. U.A. wird durch ein NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship unterstützt. P.V. wird durch ein Ontario Graduate Scholarship unterstützt.

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<li>Ting, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+dendritic+morphology+in+columns+and+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analyzing dendritic morphology in columns and layers.</a> Journal of Visualized Experiments. , e55410(2017).</li>
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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode, um Larven und adulte Drosophila-Gehirne immungefärbt und in verschiedenen Orientierungen zu montieren. Während Methoden zur Färbung von Larven- und adulten Gehirnen bereits beschrieben wurden 22,23,24,27,28, haben Montagestrategien zur optimalen Visualisierung spezifischer Sehlappenstrukturen weniger Aufmerksamkeit erhalten28.<sup class...

Das visuelle System von Drosophila, bestehend aus dem Facettenauge und dem darunter liegenden Sehlappen, ist ein hervorragendes Modell für die Untersuchung der Entwicklung und Funktion neuronaler Schaltkreise. In den letzten Jahren hat sich insbesondere der Sehlappen zu einem leistungsfähigen System entwickelt, in dem neurologische Entwicklungsprozesse wie Neurogenese und Schaltkreisverdrahtunguntersucht werden können 1,2,3,4,5,6,7,8. Es besteht aus vier Neuropilen: der Lamina, der Medulla, der Lobula und der Läppchenplatte (die beiden letzteren bilden den Lobula-Komplex)1,2,3,4,5,6. Photorezeptoren aus dem Auge zielen auf Neuronen der Lamina und Medulla ab, die visuelle Eingaben verarbeiten und an die Neuropilen des Lubula-Komplexesweiterleiten 1,2,3,4,5,6. Projektionsneuronen im Lobulakomplex senden anschließend visuelle Informationen an die Verarbeitungszentren höherer Ordnung im Zentralhirn 1,5,9. Die komplexe Organisation des Sehlappens, die durch die Notwendigkeit notwendig wird, die Retinotopie aufrechtzuerhalten und verschiedene Arten von visuellen Reizen zu verarbeiten, macht es zu einem attraktiven System, um zu untersuchen, wie ausgeklügelte neuronale Schaltkreise aufgebaut sind. Bemerkenswert ist, dass die Medulla sowohl in ihrer Organisation als auch in ihrer Entwicklung auffallende Ähnlichkeiten mit der Neuroretina aufweist, die seit langem ein Modell für die Entwicklung neuronaler Schaltkreise bei Wirbeltieren ist 3,8.
Die Entwicklung des Sehlappens beginnt während der Embryogenese mit der Spezifizierung von ~35 ektodermalen Zellen, die die optische Plakode 2,4,5,6,7,8 bilden. Nach dem Schlüpfen der Larven wird die optische Plakode in zwei verschiedene Primordien unterteilt: 1) das äußere Proliferationszentrum (OPC), das die Neuronen der Lamina und der äußeren Medulla erzeugt, und 2) das innere Proliferationszentrum (IPC), das Neuronen der inneren Medulla und des Läppchenkomplexeserzeugt 4,5,6,10 . In der späten Larve des zweiten Stadiums beginnen sich die Neuroepithelzellen des OPC und IPC in Neuroblasten zu verwandeln, die anschließend über intermediäre Ganglien-Mutterzellen Neuronen erzeugen 4,5,11,12. Neuroblasten des Sehlappens sind durch räumlich und zeitlich eingeschränkte Transkriptionsfaktoren strukturiert, die zusammenwirken, um neuronale Diversität in ihren Nachkommen zu erzeugen 11,12,13,14. In der Puppe werden die Schaltkreise des Sehlappens Neuropils durch die Koordination mehrerer Prozesse zusammengesetzt, darunter der programmierte Zelltod11,15, die neuronale Migration12,16, das axonale/dendritische Targeting10,17, die Synapsenbildung18,19 und die Neuropil-Rotationen10,17.
Hier beschreiben wir die Methodik, mit der Larven und adulte Gehirne präpariert, immungefärbt und für die Bildgebung des Sehlappens montiert werden. Angesichts seiner komplexen dreidimensionalen Organisation erfordert die Analyse des Sehlappens ein Verständnis dafür, wie seine adulten Neuropilen und Larvenvorläufer relativ zueinander und zum Zentralhirn positioniert sind. Daher legen wir besonderen Wert darauf, wie sich die Ausrichtung der Montage auf die räumliche Organisation der Optikuslappenstrukturen bezieht. Wir beschreiben drei Montagestrategien für Larvenhirne (anterior, posterior und lateral) und drei für adulte Gehirne (anterior, posterior und horizontal), die jeweils einen optimalen Winkel für die Abbildung einer spezifischen Vorläuferpopulation des Sehlappens oder Neuropils bieten.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>Bioshop</td><td>PBS405</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyd</td><td>Bioshop</td><td>FOR201</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (Ziege) sekundär</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td>verwenden bei 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 (Maus) sekundär</td><td>Invitrogen</td><td>A-31570</td><td>verwenden bei 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (Meerschweinchen) sekundär</td><td>Invitrogen</td><td>A-21450</td><td>verwenden bei 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (Ratte) sekundär</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td>Anwendung bei 1:500</td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td></td></tr><tr><td>Präparierzange - #5</td><td>Dumont</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Präparierzange - #55</td><td>Dumont</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschale</td><td>Corning</td><td>722085</td><td></td></tr><tr><td>Trockentücher</td><td>Kimbery Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Ziege anti-Bgal primärer Antikörper</td><td>Biogenesis</td><td></td><td>Verwendung bei 1:1000</td></tr><tr><td>Meerschweinchen anti-Bsh Primärantikörper</td><td>Geschenk von Claude Desplan</td><td></td><td>Verwendung bei 1:500</td></tr><tr><td>Meerschweinchen anti-Vsx1 primärer Antikörper</td><td>Erclik et al. 2008</td><td></td><td>Verwendung bei 1:1000</td></tr><tr><td>Laborfilm</td><td>Parafilm</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.600</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>VWR</td><td>CA4823-180</td><td></td></tr><tr><td>Maus anti-dac primärer Antikörper</td><td>Entwicklungsstudien Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>mabdac2-3</td><td>Verwendung bei 1:20</td></tr><tr><td>Maus anti-eya primärer Antikörper</td><td>DSHB</td><td>eya10H6</td><td>Verwendung bei 1:20</td></tr> Maus <tr><td>anti-nc82 primärer Antikörper</td><td>DSHB</td><td>nc82</td><td>Verwendung bei 1:50</td></tr> Maus <tr><td> Anti-SVP-Primärantikörper</td><td>DSHB</td><td>Seven-up 2D3</td><td>Verwendung bei 1:100</td></tr><tr><td>Polymer Clay</td><td>Jede Art von Tonerde kann verwendet</td><td></td><td></td>werden</tr><tr><td>Kaninchen Anti-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A-11122</td><td>Verwendung bei 1:1000</td></tr><tr><td>Ratte Anti-DE-Cadherin Primärantikörper</td><td>DSHB</td><td>DCAD2</td><td>Verwendung bei 1:20</td></tr><tr><td>Slowfade Einbettmedium</td><td>Invitrogen</td><td>S36967</td><td>Vectashield Eindeckmedium ( Kat# H-1000) kann auch verwendet werden</td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Bioshop</td><td>TRX506</td><td></td></tr></tbody></table>

dissektion, immunhistochemie und montage von larven und adulten drosophila-gehirnen zur visualisierung des sehlappens

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

Der Drosophila-Optikuslappen , bestehend aus vier Neuropilen: der Lamina, der Medulla, der Lobula und der Lobula-Platte, ist ein hervorragendes Modellsystem für die Erforschung der Entwicklungsmechanismen, die die neuronale Vielfalt erzeugen und die Assemblierung von Schaltkreisen steuern. Angesichts seiner komplexen dreidimensionalen Organisation erfordert die Analyse des Sehlappens ein Verständnis dafür, wie seine adulten Neuropilen und Larvenvorläufer relativ zueinander und zum Zentralhirn positioniert sind. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Dissektion, Immunfärbung und Montage von Larven- und adulten Gehirnen für die Bildgebung des Sehlappens. Besonderer Wert wird auf den Zusammenhang zwischen der Montageorientierung und der räumlichen Organisation des Sehlappens gelegt. Wir beschreiben drei Montagestrategien in der Larve (anterior, posterior und lateral) und drei in der adulten Larve (anterior, posterior und horizontal), die jeweils einen idealen Abbildungswinkel für eine ausgeprägte Optikallappenstruktur bieten.

Konfokale Bilder von Larven und adulten Sehlappen, die in den im Protokoll beschriebenen Orientierungen montiert sind, sind in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt.
Abbildung 1 zeigt schematische und repräsentative konfokale Schnitte von Larvenhirnen, die in anteriorer, hinterer und lateraler Ausrichtung positioniert sind. In der anterioren Montageorientierung erscheinen das OPC-Epithel (DE-Cadherin), ...

Dieses Protokoll beschreibt drei Schritte zur Vorbereitung von Larven und adulten Drosophila-Sehlappen für die Bildgebung: 1) Dissektion des Gehirns, 2) Immunhistochemie und 3) Montage. Der Schwerpunkt liegt auf Schritt 3, da unterschiedliche Montageausrichtungen erforderlich sind, um spezifische Optikkeulenstrukturen sichtbar zu machen.

Dissektion, Immunhistochemie und Montage von Larven und adulten Drosophila-Gehirnen zur Visualisierung des Sehlappens

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...

Wir beschreiben ein Protokoll zur Präparierung, Immunfärbung und Montage von larvalen und adulten Drosophila-Gehirnen mit besonderem Schwerpunkt auf den Sehlappen. Angesichts der komplexen dreidimensionalen Organisation des Sehlappens wird erwartet, dass das hier beschriebene Protokoll den Forschern ein besseres Verständnis der Beziehung zwischen der Montageorientierung und den visualisierten Strukturen des Sehlappens ermöglicht. Dieses Protokoll beschreibt drei Befestigungsstrategien sowohl für larvale als auch für adulte Sehlappen, von denen jede einen optimalen Winkel bietet, um eine bestimmte Sehlappenstruktur während der Bildgebung sichtbar zu machen.Bevor Sie mit der Dissektion beginnen, füllen Sie alle Vertiefungen einer Drei-Well-Platte mit 400 Mikrolitern PBS pro Well und wählen Sie mit einer Pinzette vorsichtig 15 wandernde Larven des dritten Stadiums aus, die auf der Innenseite eines Drosophila-Fläschchens oder einer Flasche kriechen. Legen Sie alle Larven in die erste Vertiefung der Drei-Vertiefung-Platte und setzen Sie eine Larve in die mittlere Vertiefung der Platte um. Halten Sie den Körper der Larve mit der nicht dominanten Hand am Boden der Vertiefung fest und grei

dissection-immunohistochemistry-mounting-larval-adult-drosophila

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Migration von Gliazellen in den Entwicklungsländern Drosophila Auge mit Live-mikroskopische Analyse mit GFP markierten Gliazellen gepaart untersuchen.

Live-Imaging von Gliazellen Migration in der Drosophila Eye Imaginalscheibe

Dissektion und Immunhistochemie von Larven, Puppen und Erwachsenenbildung<em&gt; Drosophila</em&gt; Netzhäute

Dieses Video beschreibt eine Methode, um intakte Gehirne von erwachsenen Fliegen unter eine Brückenrutsche zu montieren und zeigt das Protokoll, das an immungefärbten Gehirnen für die Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt wurde.

Montage von adulten Drosophila-Gehirnen: Eine Methode zur Vorbereitung von Objektträgern für die konfokale Bildgebung

Immunfärbung ist eine effektive Technik zur Visualisierung spezifischer Zelltypen und Proteine innerhalb von Geweben. Durch die Verwendung von Ultraschall verringert das hier beschriebene Protokoll die Notwendigkeit, Drosophila melanogaster-Gewebe von Embryonen und Larven im Spätstadium vor der Immunfärbung zu präparieren. Wir bieten eine effiziente Methodik für die Immunfärbung von Formaldehyd-fixierten Whole-Mount-Larven.

Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe<em&gt; In-situ</em

Dieses Protokoll Details eine optimierte Methode verwendet, um Live-Cell-Imaging im Rahmen eines intakten Larven Gehirn durchzuführen. Live-Cell-Imaging Ansätze sind von unschätzbarem Wert für die Erforschung der neuronalen Stamm asymmetrische Zellteilungen sowie andere neurogene und Entwicklungsprozesse konsequent aufzudecken Mechanismen, die bisher übersehen wurden.

Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuroblasten

Die adulten Strukturen von Drosophila stammen von sackartigen Strukturen ab, die imaginale Scheiben genannt werden. Die Analyse dieser Scheiben bietet Einblicke in viele Entwicklungsprozesse, einschließlich der Gewebebestimmung, der Etablierung von Kompartimentgrenzen, der Zellproliferation, der Spezifikation des Zellschicksals und der planaren Zellpolarität. Dieses Protokoll wird verwendet, um imaginale Scheiben für die Licht-/Fluoreszenzmikroskopie vorzubereiten.

Präparation und Immunfärbung von Imaginalscheiben aus Drosophila melanogaster

Der erwachsene Drosophila Gehirn ist ein wertvolles System zur Untersuchung der neuronalen Schaltkreise, höhere Hirnfunktionen und komplexe Erkrankungen. Eine effiziente Methode ganze Hirngewebe von der kleinen Fliegenkopf zu sezieren werden Gehirn basierte Studien erleichtern. Hier beschreiben wir eine einfache, one-step-Dissektion Protokoll von erwachsenen Gehirn mit gut erhaltenen Morphologie.

Eine einfache Ein-Schritt-Dissection-Protokoll für Whole-mount Vorbereitung von Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

Dieses Protokoll beschreibt die Dissektion und Immunostaining von Erwachsenen Drosophila Melanogaster Gewebe des Gehirns. Insbesondere unterstreicht dieses Protokoll die Verwendung von Drosophila Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen als Beispiel neuronale Teilmengen, die genau verwendet werden, um die allgemeinen Grundsätze für viele Aspekte der neuronalen Entwicklung aufzudecken.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Dieses Papier stellt eine Operationsmethode für sezieren Drosophila pupal Netzhaut zusammen mit Protokolle für die Verarbeitung von Gewebe für Immunohistochemistry, westlichen Analyse und RNA-Extraktion.

Dissektion der Drosophila Pupal Netzhaut Immunohistochemistry, westlichen Analyse und RNA-Isolation

Diese Studie stellt ein vereinfachtes Protokoll für die Gewebeaufbereitung vor, das Enthauptung, Fixierung, Kryosektion, Fluoreszenzfärbung, Immunfärbung und Bildgebung umfasst und auf konfokale und Multiphotonen-Bildgebung erweitert werden kann. Die Methode behält eine Wirksamkeit bei, die mit komplexen Dissektionen vergleichbar ist, ohne dass fortgeschrittene motorische Fähigkeiten erforderlich sind. Die quantitative Bildanalyse bietet ein umfangreiches Untersuchungspotenzial.

Direkte Kryosektion von Drosophila-Köpfen zur verbesserten Fluoreszenzfärbung und Immunfärbung des Gehirns

Lernen Sie die Präparation von Drosophila-Gehirnen durch Dissektion, Immunhistochemie und Montage zur Visualisierung des Sehlappens. Drei Montagestrategien ermöglichen optimale Bildgebung spezifischer Strukturen.

Dissektion, Immunhistochemie und Montage von Larven und adulten Drosophila-Gehirnen zur Visualisierung des Sehlappens

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