Name: Phage Therapy Anwendung gegen Pseudomonas aeruginosa Infektion bei Mukoviszidose Zebrafisch Embryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Erfahren Sie die Anwendung von Phagentherapie gegen Pseudomonas aeruginosa bei Mukoviszidose-Zebrafischembryonen. Diese Methode ermöglicht die in vivo Bewertung der Phagenwirksamkeit bei bakteriellen Infektionen.

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Diese Arbeit wurde von der italienischen Cystic Fibrosis Foundation (FFC-22/2017; Associazione "Gli amici della Ritty" Casnigo und FFC-23/2019; Un respiro in pié Onlus La Mano tesa Onlus).

Erwachsene Zebrafische (Danio rerio) aus dem AB-Stamm (European Zebrafish Resource Center EZRC) werden gemäß internationalen (EU-Richtlinie 2010/63/EU) und nationalen Richtlinien (italienisches Dekret vom4. März 2014, Nr. 26) über den Schutz von Tieren, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, gepflegt. Die Standardbedingungen werden in der Fischanlage mit einem 14 h Licht/10 h-Dunkelzyklus und einer Tankwassertemperatur bei 28° C festgelegt.
1. Vorbereitung von Lösungen und Werkzeugen
<ol><li>Vorbereitung einer 50-fachen Bestandslösung und 1x Arbeitslösungen für E3-Embryomedium für den Anbau von Zebrafischembryonen (siehe Tabelle 1).</li>
	<li>Pigmentierungsblockungslösung herstellen, um die Embryopigmentierung ab 24 Stunden nach der Befruchtung zu blockieren (24 hpf) (siehe Tabelle 1).</li>
	<li>Bereiten Sie 25x Lager und 1x arbeitende Tricane Anästhesielösung vor, wie in Tabelle 1beschrieben. HINWEIS: Um das wiederholte Einfrieren und Auftauen der Lösung zu vermeiden, die die Stammlösung beschädigen könnte, machen Sie Aliquots von 2 ml 25x Tricain eund bei -20 °C.</li>
	<li>Bereiten Sie Spuren für die Embryo-Mikroinjektion vor, indem Sie 1 g Agarose in 100 ml destilliertemH2O in einem mikrowavablen Kolben oder einer Flasche auflösen. Mikrowelle für 1-3 min, bis die Agarose vollständig aufgelöst ist.</li>
	<li>Positionieren Sie Zebrafisch-Mikrospritzformen (siehe Materialtabelle)auf den Kopf gestellt in einer Petrischale (90 mm x 15 mm) und bedecken Sie die gesamte Oberfläche, indem Sie das flüssige Agarosegel mit einer Breite von ca. 10 mm gießen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Form, sobald die Agarose verfestigt ist. Füllen Sie die Petrischale mit 1x E3 Embryo Medium. Diese kann bei 4 °C ca. eine Woche gelagert werden. Vor gebrauchen durch das frische E3-Medium, das Tricain enthält, ersetzen. HINWEIS: Ältere Schimmelpilze können Pilze oder bakterielle Verunreinigungen entwickeln.</li>
	<li>Verwenden Sie feuerpolierte 10 cm Borosilikatkapillaren, um Nadeln für die Mikroinjektion vorzubereiten und sie durch Anziehen der Griffe am Mikropipette-Zieher zu befestigen. Stellen Sie den Abzieher mit den folgenden Einstellungen ein: Hitze 500, Geschwindigkeit 100, Zeit 150, Ziehen 150.</li>
</ol>2. P. aeruginosa (PAO1) Inokulumzubereitung
<ol><li>Impfen 1 Kolonie von GFP+P. aeruginosa Stamm PAO119 in 5 ml LB Brühe (siehe Tabelle 1) und wachsen über Nacht bei 37 °C mit Schütteln (200 U/min).</li>
	<li>Verdünnen Sie die oben genannte Nachtkultur auf OD600 = 0,1 in 10 ml LB-Brühe und wachsen Sie mit Schütteln (200 Rpm) auf OD600 = 0,5 bei 37 °C an.</li>
	<li>Zentrifuge 2 ml der Kultur für 2 min bei 4 °C bei 16.100 x g und das Zellpellet auf OD600 = 1, was etwa 1 x 109 cfu/ml entspricht, in 1 ml der physiologischen Lösung (siehe Tabelle 1).</li>
	<li>Die Zellsuspension in physiologischer Lösung auf ca. 5 x 107cfu/ml verdünnen und bei 4 °C lagern.</li>
</ol>3. Phage Stockvorbereitung
<ol><li>1 Kolonie von P. aeruginosa Stamm PAO1 in 5 ml LB Brühe impfen und über Nacht bei 37 °C mit Schütteln inkubieren. Die Nachtkultur auf OD600 = 0,01 in 500 ml LB-Brühe verdünnen und bei 37 °C mit Schütteln auf OD600 = 0,05 wachsen, was etwa 2,5 x 107 cfu/ml entspricht.</li>
	<li>Zur verdünnten Kultur von P. aeruginosa, fügen Sie etwa 1,25 x 107 Phagen, um die Vielzahl der Infektion (M.O.I.) von 10-3zu erhalten. Bei 37 °C mit Schütteln bebrüten, bis der OD600 auf etwa 0,1-0,3 sinkt (je nach verwendetem Phagen in etwa 3 bis 5 h). HINWEIS: Für dieses Experiment wurden vier Phagen ausgewählt, die den PAO1-Stamm infizieren: Zwei Podoviridae, GenBank-Beitrittsnummern vB_PaeP_PYO2, MF490236 und vB_PaeP_DEV, MF490238, sowie zwei Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241 und vB_PaeM_E217, MF490240. Führen Sie die folgenden Schritte für jeden Phagen einzeln aus.</li>
	<li>Das Lysat mit 1 mg/ml DNase und RNase 30 min bei 37 °C inkubieren. Zentrifuge bei 5.000 x g für 30 min bei 4 °C und vorsichtig den Überstand (SN) wiederherstellen. Filtern Sie den SN mit einem Filter mit einem Porendurchmesser von 0,8 m.</li>
	<li>Zum SN 58 g/L Von NaCl und 105 g/L PEG6000 hinzufügen. Unter Rühren bei RT 20 min auflösen und dann über Nacht bei 4 °C aufbewahren. Zentrifuge bei 20.000 x g für 30 min bei 4 °C bei Phagenniederschlag. Entfernen Sie den SN und lösen Sie das Phagenpellet vorsichtig in 15 ml TN-Puffer auf (siehe Tabelle 1).</li>
	<li>Reinigen Sie die Phagen mit CsCl Dichtegradienten, wie in den schritten unten beschrieben.<ol>
<li>In einem Polyallomer Ultrazentrifugenrohre für SW41 Rotor, bereiten Sie einen CsCl Schrittdichtegradientdurchfall durch Schichtung 2 ml der vier CsCl-Lösungen in Tabelle 1beschrieben .  Fügen Sie 3,5 ml Phagenaufhängung in jedem der 4 Rohre hinzu. HINWEIS: CsCl ist giftig, nehmen Sie geeignete Sicherheitsverfahren an, um es zu behandeln und zu entsorgen.</li>
		<li>Führen Sie die Rohre in den Rotor ein und stellen Sie sicher, dass die Rohre ausgeglichen sind (der Gewichtsunterschied zwischen den beiden gegenüberliegenden Rohren muss ≤ 0,01 g betragen).</li>
		<li>Zentrifuge für 2 h bei 4 °C und 100, 000 x g (25.000 U/min für SW41 Rotor). Nach der Zentrifugation, entfernen Sie langsam die Rohre und vorsichtig immobilisieren Sie sie auf einem Träger. Zeichnen Sie mit einer Spritze mit 19 G Nadel das weiß/opaleszierende Band auf, das sich normalerweise zwischen dem dichte bereich d=1.5 und dem d=1.4 Dichtebereich befindet.</li>
		<li>Übertragen Sie die Suspensionen von der Spritze in neue Polyallomerrohre für den SW60-Rotor und verwenden Sie die d=1.4-Lösung, um die Rohre präzise auszugleichen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Federung bei 4 °C und 150.0000 x g (38.000 U/min für den SW60-Rotor) für mindestens 16 h.</li>
		<li>Sammeln Sie das sichtbare Band wie oben (siehe Schritt 3.3.3) und übertragen Sie es in Dialyseröhren mit 6.000 Da Cut-off. Dialyse das erhaltene sichtbare Band 2x für 20 min gegen 500 ml Wasser und über Nacht gegen 500 ml TN Puffer. Mit einem 0,22 m Porenfilter filtern und bei 4 °C lagern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Phage-Cocktail-Zubereitung
<ol><li>Machen Sie eine Mischung aus vier Phagen, die den Stamm PAO1 infizieren, zuvor isoliert und charakterisiert8. Vor dem Mischen, schätzen Sie den Titer jedes Phagenbestands durch Plaque-Assay20.</li>
	<li>Montieren Sie den Phagencocktail mit einem Gesamttiter von 5 × 108 pfu/ml, indem Sie gleich vier Phagenpräparate an derselben pfu/mL unmittelbar vor jedem Experiment mischen, um genaue Phagen-Titer zu gewährleisten.</li>
</ol>5. Sammlung und Herstellung von Zebrafischembryonen zur cftr morpholinos Mikroinjektion
HINWEIS: Sammeln Sie 1-2 Zellembryonen von wildlebenden Zebrafischen für cftr morpholinos (cftr-MOs) Mikroinjektion.
<ol><li>Zwei Tage vor dem bakteriellen Mikroinjektionsexperiment, richten Sie Brutpaare ein und sammeln Embryonen, wie zuvor beschrieben21. Erwachsene Zebrafische (Danio rerio) der AB-Sorte wurden vom European Zebrafish Resource Center, EZRC, gekauft.</li>
	<li>Am Tag danach die Embryonen unmittelbar nach der Befruchtung mit einer Plastikpipette oder mit einem Feinnetzsieb sammeln. Legen Sie die gesammelten Embryonen in eine Petrischale, die E3-Embryomedium enthält, und entfernen Sie vorsichtig den Schmutz mit einer Plastikpipette, um eine Kontamination zu vermeiden, die die Embryoentwicklung beeinträchtigen könnte.</li>
	<li>Bereiten Sie 5 l Morpholino-Injektionslösung vor, indem Sie die beiden Morpholino-Stammlösungen (1 mM) in sterilem Wasser auf eine Endkonzentration von 0,25 pmol/embryo ATG-MO + 0,25 pmol/embryo splice-MO verdünnen. Um die Embryo-Injektion nachzuverfolgen, fügen Sie dem Morpholino-Injektionslösungsmix 0,5 l Phenolrot hinzu.</li>
	<li>Laden Sie eine Mikroinjektionsnadel mit ca. 5 l der Morpholino-Mischlösung mit einer 20-L-Mikropipette mit feiner Gel-Ladespitze. Befesten Sie die Nadel am Mikromanipulator, der mit einem Ständer verbunden ist, und positionieren Sie sie unter einem Stereomikroskop. HINWEIS: Es ist nicht notwendig, dass die Lösung die Spitze der Nadel erreicht, da der Druck der Mikroinjektorpumpe sie drückt.</li>
	<li>Clip aus der Spitze der Nadel durch Schneiden der Nadelspitze mit feiner steriler Pinzette. Messen Sie den Durchmesser des Tropfens mit einem Skalenbalken im Okular des Mikroskops. Alternativ können Sie einen Tropfen Mineralöl auf einen Mikrometerschlitten werfen und das Mikroinjektionsvolumen einstellen, indem Sie die Lösung in den Öltropfen injizieren, um die Tröpfchengröße zu bewerten. Verwenden Sie einen Tropfen mit einem Durchmesser von 156 m, um ein Volumen von 2 nL zu injizieren.</li>
	<li>Stellen Sie den Mikroinjektor ein, indem Sie den Kompensationsdruck auf 15 hPa, die Einspritzzeit auf 0,5 s und den Injektionsdruck zwischen 300 und 600 hPa einstellen, um je nach verwendeter Nadel das richtige Injektionsvolumen zu erhalten.</li>
	<li>Mit einer Kunststoffpipette ordnen Sie die Embryonen von Schritt 5.2 auf ein Glas in einer Petrischale mit 96 mm Durchmesser an. HINWEIS: Zu viel E3-Medium verhindert das richtige Eindringen der Mikroinjektionsnadel in die Chorion der Embryonen.</li>
	<li>Durchdringen Sie die Chorion und dann das Eigelb mit der Nadel, um 2 nL in den Embryo zu injizieren, wie zuvor beschrieben22.</li>
	<li>Injizierende Embryonen in eine Petrischale mit E3-Medium geben und bei 28 °C in einen Inkubator geben, damit sie sich bis zum Tag danach entwickeln können.</li>
</ol>6. Mikroinjektion von Zebrafischembryonen mit Bakterien und Phagencocktail
HINWEIS: Um eine systemische Infektion durchzuführen, muss der Embryo eine Durchblutung haben, die in der Regel nach 26 hpf beginnt.
<ol><li>Nach 26 hpf (für Zebrafisch-Entwicklungsstadien beziehen sich auf Kimmel21) dechoronatische Embryonen mit Pronaselösung, die durch Auflösen von Pronasepulver in E3-Medium in einer Konzentration von 2 mg/ml hergestellt werden. Die Embryonen werden vorsichtig pipette, um die Chorion zu brechen. Entsorgen Sie das Pronase/E3-Medium und spülen Sie das Gericht mehrmals mit frischem E3 ab, um alle Pronase zu entfernen.</li>
	<li>Anästhetisieren Zebrafisch-Embryonen in E3-Medium, das Tricain ca. 5 min vor injektionn enthält.</li>
	<li>Pipette die anästhesierten Embryonen in die Spur in Schritt 1 vorbereitet. Verwenden Sie eine feine Gel-Ladespitze, um die Embryonen in der seitlichen Position zu säumen.</li>
	<li>Laden Sie eine Mikroinjektionsnadel mit ca. 5 l des P. aeruginosa Präparats, wie in Teil 5 beschrieben.</li>
	<li>Setzen Sie die Nadel dorsal an den Ausgangspunkt des Kanals von Cuvier, wo sie beginnt, sich über den Dottersack auszubreiten. Injizieren Sie ein Volumen von 1-3 nL und stellen Sie sicher, dass sich das Volumen direkt innerhalb des Kanals ausdehnt und in den Kreislauf gelangt.</li>
	<li>Etwa nach jedem 50 injizierten Embryo injizieren Sie einen Tropfen der Bakterien in ein 1,5 ml Zentrifugenrohr mit 100 l sterilem PBS, um zu überprüfen, ob das Injektionsvolumen gleich bleibt. Das Inokulum auf LB-Agar (siehe Tabelle 1) über Nacht bei 37 °C verbuchen, um die KBE zu bewerten.</li>
	<li>Die mikroinjizierten Embryonen in zwei saubere Petrischalen mit frischem E3-Medium + PTU übertragen und bei 28 °C inkubieren.</li>
	<li>An zwei ausgewählten Zeitpunkten: 30 min oder 3 h nach der bakteriellen Injektion, nehmen Sie eine der Petri-Schalen mit bakteriellen Embryonen aus dem Brutkasten heraus und richten Sie sie in der Spur aus, wie in 6.3 für die Phagencocktail-Injektion beschrieben.</li>
	<li>Eine Mikroinjektionsnadel mit ca. 5 l des Phagencocktails (in Schritt 4) mit einer feinen Gelladespitze aufladen und am Mikroinjektor fixieren (siehe Schritt 5).</li>
	<li>Injizieren Sie den Phagencocktail in den Kanal von Cuvier der Embryonen, die zuvor mit Bakterien injiziert wurden.</li>
	<li>Die mikroinjizierten Embryonen in zwei saubere Petrischalen mit frischem E3-Medium + PTU übertragen und bei 28 °C inkubieren.</li>
</ol>7. Bewertung der bakteriellen Belastung von Embryonen, die mit PAO1 und Phagen injiziert werden
<ol><li>Bei 8 PSi, Pipette 15 beästheten Embryonen von der Petrischale zu einem 1,5 ml Zentrifugenrohr.</li>
	<li>Ersetzen Sie die Anästhesielösung durch 300 L von 1% Triton X-100 in PBS (PBSTritonX) und homogenisieren Sie die Embryonen, indem Sie sie mindestens 15x durch eine Insulinspritze mit einer sterilen 27-G-Nadel übergeben.</li>
	<li>Vorbereiten Sie serielle Verdünnungen von Homogenaten in sterilen PBS, indem Sie 100 l des verdünnten Homogenats in 900 l steriles PBS übertragen.</li>
	<li>Zur Auswahl für den natürlich amperbfesten PAO1-Stamm, Platte 100 l der Verdünnungen auf LB-Agar mit Ampicillin (100 g/ml) zugesetzt und bei 37 °C über Nacht inkubieren.</li>
	<li>Am Tag danach zählen Sie die Anzahl der Kolonien, multiplizieren Sie mit dem Verdünnungsfaktor, um die Gesamtzahl der KBE zu bestimmen, und dividieren Sie durch die Anzahl der Embryonen, die homogenisiert wurden, um die durchschnittliche Anzahl von KBE/infizierten Embryonen zu erhalten.</li>
</ol>8. Bewertung der Letalität von Embryonen, die mit PAO1 und Phagen injiziert werden
<ol><li>Um die Tödlichkeit der PAO1-Infektion zu bewerten, bewerten Sie die injizierten Embryonen mit 20 PSi unter einem Stereomikroskop und zählen Sie für die toten Embryonen (weiß/nicht transparent).</li>
	<li>Berechnen Sie die halbmaximale tödliche Konzentration 50 (LD50) Dosis von PAO1, die den Tod von 50% der injizierten Embryonen bei 20 hpf bestimmt.</li>
</ol>9. Embryo-Vorbereitung für Stereomikroskop-Zeitraffer-Bildgebung der GFP+ PAO1-Infektion
<ol><li>Präatolieren Sie die Form für die Live-Embryo-Bildgebung, indem Sie 1,5% niedrigschmelzende Agarose in 100 ml E3-Lösung auflösen.</li>
	<li>Fügen Sie 1% Tricaine (siehe Tabelle 1) hinzu, um die Embryonen zu beästhesieren.</li>
	<li>Bei 4 PSi einen Embryo mit einer Kunststoffpipette in eine Glasbodenschale übertragen und die warme Agaroselösung mit niedrigem Schmelzpunkt hinzufügen.</li>
	<li>Positionieren Sie die Glasbodenschale unter einem Stereomikroskop und positionieren Sie den Embryo mit einer Spitze in der gewünschten Ausrichtung. Verwenden Sie eine Kunststoffpipette, um vorsichtig einen Tropfen Agarose auf den Embryo hinzuzufügen.</li>
	<li>Lassen Sie die Agarose 5-10 min abkühlen und füllen Sie die Glasbodenschale vorsichtig mit E3, das die Anästhesielösung enthält, um den Embryo feucht zu halten.</li>
	<li>Legen Sie die Glasbodenschale mit dem Embryo unter das fluoreszierende Stereomikroskop mit einem Fluoreszenzfilter (Kanal 488 nm) für GFP+ Bakterien. Entfernen Sie die Petrischale erst nach weiteren Anschaffungen mit den gleichen Parametern bei 9, 14 und 18 PSi.</li>
</ol>10. Expressionsanalysen von proinflammatorischen Zytokinen
<ol><li>Bei 20 PS i die Embryonen mit Tricain 1x Lösung ansiebeund von der Petrischale in ein 1,5 ml Zentrifugenrohr übertragen.</li>
	<li>Entfernen Sie unter einer Dunstabzugshaube die Anästhesielösung und ersetzen Sie sie durch 200 L Guanidiumhydrochlorid-Reagenz.</li>
	<li>Homogenisieren Sie Embryonen, indem Sie sie zunächst wiederholt durch eine 200-L-Pipette und dann mindestens 15x mit einer Insulinspritze mit einer sterilen 27 G Nadel pipetieren.</li>
	<li>Extrahieren Sie die gesamte RNA aus homogenisierten Zebrafischembryonen unter Verwendung eines handelsüblichen Guanidiumhydrochlorid-Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Behandeln Sie 1 g jeder RNA-Probe mit 2 l/l DNase I (RNase-frei) nach den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Verwenden Sie 1 g DNase I-behandelte RNA für die Reverse-Transkriptionsreaktion (RT) mit handelsüblichem Kit (siehe Tabelle der Materialien), in einem Gesamtvolumen von 20 l gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Führen Sie die RT qPCR-Reaktion in einem Gesamtvolumen von 10 l mit 1x SYBR Green Mastermix unter Verwendung von 1,5 l einer 1:6-Verdünnung der RT-Reaktion durch. Verwenden Sie für die Normalisierung die Primer für die Haushaltungsgene rpl8 und für pro-inflammatorische Zytokine, verwenden Sie Primer für TNF-α und IL-1" (siehe Tabelle 2). qPCR-Protokoll war: Zyklus 1 Schritt 1: 95 °C, 2 min, einmal wiederholen; Zyklus 2: Schritt 1 95 °C, 10 s, Schritt 2 55 °C, 30 s, 40x wiederholen; Zyklus 3: Schritt 1 72 °C, 15 Min.</li>
</ol>

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<li>Cafora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+therapy+against+Pseudomonas+aeruginosa+infections+in+a+cystic+fibrosis+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model.</a> Science Reports. 9, 1527(2019).</li>
<li>Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+methods+in+the+study+of+the+phage-antiphage+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction.</a> Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).</li>
<li>Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+as+a+Model+Organism+to+Study+Development+of+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System.</a> Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

In diesem Manuskript beschrieben wir das Protokoll zur Durchführung einer P. aeruginosa (PAO1) Infektion bei Zebrafischembryonen und wie man eine Phagentherapie mit einem Cocktail von Phagen anwenden kann, der zuvor als in der Lage identifiziert wurde, PAO1 zu infizieren, um es zu lösen. Die Verwendung von Bakteriophagen als Alternative zu Antibiotikabehandlungen ist seit einigen Jahren von wachsendem Interesse. Dies ist hauptsächlich auf die Verbreitung multiresistenter (MDR) bakterieller Infektionen zurückzufü...

Phage-Therapie, die Verwendung der natürlichen Feinde von Bakterien, um bakterielle Infektionen zu bekämpfen, gewinnt neues Interesse als bakterielle Resistenz gegen Antibiotika wird weit verbreitet1,2. Diese Therapie, die seit Jahrzehnten in Osteuropa verwendet wird, könnte als eine ergänzende Behandlung von Antibiotika bei der Heilung von Lungeninfektionen bei Patienten mit CF und als mögliche therapeutische Alternative für Patienten mit Bakterien, die gegen alle derzeit verwendeten Antibiotika2 ,,3. Vorteile der Antibiotikatherapie sind, dass sich Bakteriophagen an der Infektionsstelle vermehren, während Antibiotika metabolisiert und aus dem Körper eliminiert werden4,5. In der Tat hat sich die Verabreichung von Cocktails von virulenten Phagen, die in verschiedenen Laboratorien isoliert wurden, bei der Behandlung von Pseudomonas aeruginosa Infektionen in Tiermodellen, die so unterschiedlich sind wie Insekten und Säugetiere, als wirksamerwiesen.,7,8 Die Phage-Therapie war auch in der Lage, die bakterielle Belastung in Mitpfoten von P. aeruginosa und Escherichia coli infizierten Verbrennungswunden in einer randomisierten klinischen Studie zu reduzieren9.
Zebrafische (Danio rerio) hat sich vor kurzem als ein wertvolles Modell zur Untersuchung von Infektionen mit mehreren Krankheitserregern, einschließlich P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abscessus und Burkolderia cepacia12,13. Durch die Mikroinjektion von Bakterien direkt in die Embryo-Blutzirkulation14 ist es einfach, eine systemische Infektion zu etablieren, die durch das angeborene Immunsystem des Zebrafisches entgegengewirkt wird, das evolutionär mit Neutrophilen und Makrophagenähnlichgeneration ähnlich dem menschlichen Pendant konserviert wird. Darüber hinaus fehlt zebrafischembryonen im ersten Lebensmonat die adaptive Immunantwort, was sie zu idealen Modellen für die Untersuchung der angeborenen Immunität macht, die der kritische Abwehrmechanismus bei menschlichen Lungeninfektionenist 15. Zebrafish hat sich vor kurzem als ein leistungsfähiges genetisches Modellsystem herausgebildet, um den CF-Beginn besser zu verstehen und neue pharmakologische Behandlungen zu entwickeln10,16,17. Das CF-Zebrafischmodell von cftr knock-down, das mit Morpholino-Injektion in Zebrafische erzeugt wurde, präsentierte eine gedämpfte Atemausbruchsreaktion und reduzierte Neutrophilenmigration10, während der cftr-Knock-out zu einer beeinträchtigten inneren Organposition und zur Zerstörung der exokrinen Bauchspeicheldrüse führt, einem Phänotyp, der die menschliche Krankheit widerspiegelt16,17. Von größtem Interesse war die Feststellung, dass die bakterielle Belastung von P. aeruginosa bei cftr-Funktionsverlust-Embryonen signifikant höher war als bei Kontrollen nach 8 Stunden nach der Infektion (hpi), was den Ergebnissen von Mäusen und menschlichen Bronchialepithelzellen2,18entspricht. cftr
In dieser Arbeit zeigen wir, dass die Phagentherapie gegen P. aeruginosa Infektionen in Zebrafischembryonen wirksam ist.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289329</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phospat gepufferte Kochsalzlösung PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>886-86-2</td><td>gebräuchlicher Name Tricain</td></tr><tr><td>Femtojet Mikromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>5247</td><td></td></tr><tr><td>Fleming/braun P-97</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>LE-Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11685660001</td><td></td></tr><tr><td>niedrigschmelzende Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>Methylblau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>28983-56-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektionsnadeln</td><td>Harvard-Gerät</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthioharnstoff >=98%</td><td>Aldrich-P7629</td><td>103-85-5</td><td></td>Oligo-Morpholino-Genwerkzeuge</tr><tr><td></td><td></td><td></td>, <td>entwickelt vom Forscher</td></tr><tr><td>PEG6000</td><td>Calbiochem</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>Phenolrot-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 143-74-B</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9036-06-0</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid ACS-Reagenz, &ge; 99.0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>S9I</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trypton-Oxoid</td><td></td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Oxoid</td><td>LP0021B</td><td></td></tr><tr><td>Z-MOLDS Mikroinjektion</td><td>Wort Präzisionsinstrumente</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

phage therapy anwendung gegen pseudomonas aeruginosa infektion bei mukoviszidose zebrafisch embryonen

Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos

Antimikrobielle Resistenzen, eine wichtige Folge diagnostischer Unsicherheit und antimikrobieller Überverschreibung, sind eine zunehmend anerkannte Ursache für schwere Infektionen, Komplikationen und Sterblichkeit weltweit mit enormen Auswirkungen auf unsere Gesellschaft und das Gesundheitssystem. Insbesondere Patienten mit geschwächtem Immunsystem oder bereits bestehenden und chronischen Pathologien, wie Zwiespäitische Fibrose (CF), werden häufigen Antibiotikabehandlungen unterzogen, um die Infektionen mit dem Auftreten und der Diffusion multiresistenter Isolate zu kontrollieren. Daher ist es dringend notwendig, alternative Therapien anzugehen, um bakteriellen Infektionen entgegenzuwirken. Die Verwendung von Bakteriophagen, den natürlichen Feinden von Bakterien, kann eine mögliche Lösung sein. Das in dieser Arbeit beschriebene Protokoll beschreibt die Anwendung der Phagentherapie gegen Pseudomonas aeruginosa Infektion bei CF-Zebrafischembryonen. Zebrafisch-Embryonen wurden mit P. aeruginosa infiziert, um zu zeigen, dass die Phagentherapie gegen P. aeruginosa-Infektionen wirksam ist, da sie Dielealität, bakterielle Belastung und pro-entzündliche Immunantwort bei CF-Embryonen reduziert.

Die hier vorgestellten Ergebnisse und Zahlen beziehen sich auf CF-Embryonen, die durch injektion von cftr morpholinos erzeugt wurden, wie zuvorbeschrieben 10 und in Schritt 5. Zur Validierung des CF-Phänotyps wurde die eingeschränkte Position der inneren Organe wie Herz, Leber und Bauchspeicheldrüse, wie zuvor beschrieben17 (Abbildung 1) berücksichtigt. Ähnliche Ergebnisse wurden bei den WT-Embryonen erzielt, wie in unserer vorherigen ...

Präsentiert hier ist ein Protokoll für Pseudomonas aeruginosa Infektion und Phagentherapie Anwendung bei Mukoviszidose (CF) Zebrafisch-Embryonen.

Phage Therapy Anwendung gegen Pseudomonas aeruginosa Infektion bei Mukoviszidose Zebrafisch Embryonen

Antimicrobial resistance, a major consequence of diagnostic uncertainty and antimicrobial overprescription, is an increasingly recognized cause of severe ...

Dieses Protokoll erleichtert die Herstellung und Verabreichung eines Virus- und Phagencocktails gegen Pseudomonas aeruginosa in Zebrafischembryonen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine in vivo Bewertung der Phagenwirksamkeit bei der Bekämpfung der bakteriellen Infektion ermöglicht. Der Phagencocktail ist sowohl bei Wildtyp- als auch bei Mukoviszidose-Zebrafischmodellen effizient.Öffnung der Möglichkeit, die Phagentherapie auf bakterielle Infektionen bei Mukoviszidose-Patienten anzuwenden. Die Phage-Therapie kann auch angewendet werden, um bestimmten bakteriellen Infektionen in anderen Modellsystemen entgegenzuwirken. Vorbereitung eines Phagenbestands für das Experiment.Fügen Sie 1,25 mal 10 zu den siebten Phagen zu einem OD 600 von 0.05 P.aeruginosa Kultur zu einer Vielzahl von Infektionen von ein mal 10 zu den negativen drei und bebrüten die Kultur für drei bis vier Stunden mit Schütteln, bis die OD 600 auf 0,1 bis 0,3 fällt. Am Ende der Inkubation inkubieren Sie das Lysat mit einem Mikrogramm pro Milliliter DNAse und RNAse für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Und pellet die Zellen durch Zentrifugation.Am Ende des Zentrifugationsfilters den Überstand durch einen Porendurchmesser von 0,8 Mikrometer und 58 Gramm pro Liter Natriumchlorid und 105 Gramm pro Liter PEG 6000. Inkubieren Sie die Lösung bei vier Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Morgen, niederschlagen Sie den Phagen durch Zentrifugation.Am Ende der Zentrifuge den Überstand entfernen und das Phagenpellet vorsichtig in 15 Milliliter Tris Natriumchloridpuffer auflösen. Um die Phagen durch Cäsiumchloriddichtegradienten zu reinigen, schichten Sie zunächst zwei Milliliter vier verschiedener Cäsiumchloridlösungen in Polyallomer-Ultrazentrifugenrohren für einen SW 41 Rotor und fügen 3,5 Milliliter der Phagensuspension zu jedem Rohr hinzu. Cäsiumchlorid ist giftig.Nehmen Sie immer geeignete Sicherheitsverfahren bei der Handhabung und Entsorgung dieser Verbindung. Wenn alle Rohre geladen sind, legen Sie die Rohre in den Rotor, um darauf zu achten, dass die Rohre ausbalanciert sind. Und zentrifugieren Sie die Proben für zwei Stunden bei 100, 000 mal g und vier Grad Celsius.Verwenden Sie am Ende der Zentrifugation eine Spritze mit einer 19-Meter-Nadel, um die weiße Schicht zwischen dem D und dem D gleich 1,4 Dichteregionen zu aspirieren. Und übertragen Sie die Aufhängungen in neue Polyallomerrohre der Größe SW 60. Zentrifugieren Sie die Suspensionen für mindestens 16 Stunden bei 150, 000 mal g und vier Grad Celsius.Und übertragen Sie die sichtbaren Bänder in Dialyseröhren mit einem 6.000 Dalton Cutoff. Dann dialysieren Sie die gesammelten Proben zweimal gegen 500 Milliliter Wasser für 20 Minuten pro Dialyse und über Nacht gegen 500 Milliliter Tris Natriumchloridpuffer. Am nächsten Morgen den resultierenden Phagenbestand mit einem 0,22 Mikrometer Porenfilter filtern und bei vier Grad Celsius lagern.Am Tag der Mikroinjektion zwei Mikromolarmorpholinos-Stammlösungen in sterilem Wasser auf eine Endkonzentration von 0,25 Picomolar pro Embryo verdünnen, um eine 5-Mikroliter-Morpholino-Injektionslösung zu erhalten. Und fügen Sie 0,5 Mikroliter Phenolrot zu jeder Lösung hinzu. Als nächstes verwenden Sie eine 20 Mikroliter Mikropipette mit einer feinen Gel-Ladespitze, um eine Mikro-Injektionsnadel mit dem gesamten Volumen der Morpholino-Mischlösung zu laden und die Nadel an einem Mikromanipulator zu befestigen, der mit einem Ständer unter einem Stereomikroskop verbunden ist.Dann mit ein oder zwei Zellen, Zebrafisch Embryonen auf einem Glasschlitten innerhalb einer 96 Millimeter Durchmesser Petrischale angeordnet, durchdringen die Chorion und das Eigelb mit der Mikro-Injektion Nadelspitze und injizieren zwei Nanoliter der Morphlino-Mischung in den Embryo. Nach der Befruchtung nach 26 Stunden eine Mikroinjektionsnadel mit etwa fünf Mikrolitern P.aeruginosa inoculum beladen und die Nadel dorsal an den Ausgangspunkt des Cuvierkanals legen, an dem sich der Kanal über den Eigelbsack auszubreiten beginnt. Injizieren Sie ein bis drei Nanoliter des PAO1-Inokulums in den Embryo, um sicherzustellen, dass sich das Volumen direkt innerhalb des Kanals ausdehnt und in den Kreislauf gelangt.Nach der Injektion transferiert der Embryo in eine von zwei neuen Petrischalen mit frischem E3-Medium, ergänzt mit Phenylthiourea für eine 30-minütige oder dreistündige Inkubation bei 28 Grad Celsius. Als nächstes laden Sie eine Mikro-Injektionsnadel mit etwa fünf Mikrolitern des Phagencocktails und fixieren Sie die Nadel am Mikroinjektor. Dann injizieren Sie ein bis drei Nanoliter Phagencocktail in den Kanal von Cuvier jedes Embryos, der zuvor mit Bakterien injiziert wurde, und legen Sie die Embryonen in eine von zwei neuen Petrischalen, die frisches E3-Medium enthalten, das mit Phenylthiourea bei 28 Grad Celsius ergänzt wird.Nach einer vierstündigen Nachinfektion verwenden Sie eine Plastikpipette, um einen anästhesierten Embryo in eine Glasbodenschale zu übertragen. Und füllen Sie die Schale mit warmen niedrigen Schmelzpunkt Agarose Lösung. Wenn die Agarose kalt ist, füllen Sie die Schale vorsichtig mit E3 Medium, ergänzt mit Anästhetikumlösung.Legen Sie die Schale unter das Stereomikroskop und positionieren Sie den Embryo mit einer Pipettenspitze in der gewünschten Ausrichtung. Dann legen Sie die Schale unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop mit einem Fluoreszenzfilter für GFP-positive Bakterien für bis zu 18 Stunden nach der Infektion und stellen Sie den Embryo für das Fortschreiten der GFP-Expression bei neun, 14 und 18 Stunden nach der Infektion ab. Um die bakterielle Belastung nach acht Stunden nach der Infektion zu bestimmen, übertragen Sie 15 anästhesierte mikroinjizierte Embryonen in ein 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr und ersetzen die Anästhesielösung durch 300 Mikroliter 1%Triton X-100 in PBS.Passieren Sie die Nadeln mindestens 15 Mal durch die sterile 27-Meter-Nadel einer Insulinspritze, um die Embryonen zu homogenisieren. Und vorbereiten serielle Verdünnungen des Homogenats durch Übertragung von 100 Mikroliter n der resultierenden Mischung in 900 Mikroliter steriler PBS pro Verdünnung. Zur Auswahl des natürlich ampicillinresistenten P.aeruginosa-Stamms 10 Mikroliter der Verdünnungen auf LB-Agar mit Ampicillin ergänzt und über Nacht bei 37 Grad Celsius bebrütet.Am nächsten Tag zählen die Anzahl der Kolonien. Um die Berechnung der Gesamtzahl der koloniebildenden Einheiten und der durchschnittlichen Anzahl von Koloniebildenden Einheiten pro infiziertem Embryo zu ermöglichen. Um die Letalität der P.aeruginosa-Infektion zu bewerten, bewerten Sie die injizierten Embryonen nach der Infektion 20 Stunden nach der Infektion unter einem Stereomikroskop, indem sie die Anzahl der toten weißen undurchsichtigen Embryonen zählen.Berechnen Sie dann die halbmaximale tödliche Konzentration 50 Dosis von P.aeruginosa, die zum Tod von 50% der injizierten Embryonen nach 20 Stunden nach der Infektion führte. Zur Validierung des Mukoviszidose-Phänotyps kann die gestörte Position der inneren Organe wie Herzleber und Bauchspeicheldrüse bewertet werden. Die bakterielle Belastung wird durch Phagentherapie bei mukovisen Fibrose-Embryonen, die mit P.Aeruginosa infiziert sind, reduziert.In 48 Stunden nach der Befruchtung mukovisen Fibrose Embryonen mit GFP-positiven P.Aeroginosa-Bakterien infiziert eine 30 Kolonie bildende Einheiten pro Embryo Dosis zeigt eine 50%tödliche Nachinfektion. Phage-Therapie ist gleichermaßen wirksam bei 20 Stunden nach der Infektion, wenn 30 Minuten oder sieben Stunden nach der bakteriellen Injektion geliefert. Hier wird eine Mukoviszidose und GFP-positive P.Aeruginosa injizierte Embryo bei vier, neun, 14 und 18 Stunden nach der Infektion gezeigt.Im Gegensatz dazu zeigt die Mukoviszidose plus P.Aeruginosa plus Phagen injiziert embryonal eine reduzierte Fluoreszenz durch die Phagenwirkung gegen die Bakterien. Die entzündliche Reaktion, die durch eine P.aeruginosa-Infektion bei Mukoviszidose-Embryonen erzeugt wird, ist signifikant erhöht, wie die Expression der pro-inflammatorischen Zytokine, TNF alpha und Interleukin 1 beta nach DerP.aeruginosa-Injektion zeigt, verglichen mit der Kontrolle injizierter Zebrafische. Die Expression der beiden entzündlichen Zytokine wird jedoch bei Phagencocktail-Mitinjizierten reduziert.Die Phagen müssen sorgfältig gereinigt werden, um kontaminierendes Endotoxin zu entfernen, das während der Zubereitung zurückgehalten werden kann. Die Phagenpräparate können mittels Elektronenmikroskopie analysiert werden, um die Virionmorphologie zu bewerten. Es wäre interessant zu testen, ob die Infektion bei menschlichen Patienten durch andere Bakterien als Pseudomonas aeruginosa mit Phagentherapie im Zebrafischmodell der Mukoviszidose geheilt werden kann.

phage-therapy-application-to-counteract-pseudomonas-aeruginosa

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Transparente Zebrafischembryonen haben nützliches Modell Gastgeber zu visualisieren und funktionell Studie Wechselwirkungen zwischen Zellen des angeborenen Immunsystems und intrazelluläre bakterielle Erreger wie...

Die Infektion von Zebrafisch-Embryos mit Intrazelluläre bakterielle Krankheitserreger

Die rasante Entwicklung, geringe Größe und Transparenz der Zebrafisch sind enorme Vorteile für das Studium der angeborenen Immunabwehr Kontrolle der...

Nicht-invasive Bildgebung von disseminierter Candidiasis in Zebrafischlarven

Das Video demonstriert die Phagentherapietechnik, die auf eine Pseudomonas aeruginosa-Infektion in Mukoviszidose-Zebrafischembryonen abzielt. Die Phagentherapie verringert effektiv die bakterielle Belastung und mildert die proinflammatorischen Immunreaktionen bei CF-Zebrafischembryonen, die mit Bakterien infiziert sind, was zu einer verringerten Letalität von CF-Embryonen führt.

Eine Phagentherapie gegen Pseudomonas aeruginosa-Infektion in Zebrafischembryonen

Dieses Video Artikel beschreibt das Hochdurchsatz-Pipeline, die erfolgreich etabliert hat, zu infizieren und zu analysieren, eine große Zahl von Zebrafisch-Embryonen bietet eine neue Verbindung leistungsfähiges Werkzeug für Test-und Wirkstoffforschung mit einer ganzen Wirbeltierorganismus.

Aufbau und Optimierung eines Hochdurchsatz-Setup zum Studium<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Und<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infektion als Modell für Drug Discovery

In vivo räumlich-zeitliche Interaktionen von Krankheitserregern und Immunabwehr auf Schleimhautebene sind in bestehenden Wirbeltierwirten nicht leicht abzubilden. Die hier vorgestellte Methode beschreibt eine vielseitige Plattform zur Untersuchung der mukosalen Candidiasis bei lebenden Wirbeltieren unter Verwendung der Schwimmblase des juvenilen Zebrafisches als Infektionsstelle.

Modellierung Mucosal Candidiasis in Zebrafisch-Larven von Schwimmblase Injection

Optisch transparente Zebrafischembryonen werden häufig verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen pathogenen Mikroorganismen und den angeborenen Immunzellen in Echtzeit zu untersuchen und zu visualisieren. Die Mikroinjektion von Mycobacterium abscessus, kombiniert mit Fluoreszenzbildgebung, wird verwendet, um wesentliche pathogene Merkmale wie die Nabelschnurbildung in Zebrafischembryonen zu untersuchen.

Entschlüsselung und Imaging Pathogenese und Cording von<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; In Zebrafischembryonen

Systemische und lokalisierte Zebrafisch-Infektionsmodelle für humane Influenza-A-Viren werden demonstriert. Unter Verwendung eines systemischen Infektionsmodells kann der Zebrafisch zum Screening von antiviralen Medikamenten verwendet werden. Unter Verwendung eines lokalisierten Infektionsmodells kann der Zebrafisch zur Charakterisierung der Immunzellreaktionen des Wirts verwendet werden.

Mit Zebrabärbling Modelle menschlicher Influenza-A-Virus-Infektionen Virostatika auf Bildschirm und Host-Immun-Zell-Antworten Charakterisieren

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Sumpf Tupfer und Schlamm Analyse der Zebrafisch Systeme führt zu erhöhten Erkennung im Vergleich zu den alleinigen Einsatz von Wächter, Krankheitserreger wie Aeromonas Hydrophila, Mycobacterium spp. und zu erkennen Pseudocapillaria Tomentosa. Außerdem wird ein System zur Überwachung von p. Tomentosa Eiern in Quarantäne vorgeschlagen.

Environmental Screening von Aeromonas Hydrophila, Mycobacterium spp. und Pseudocapillaria Tomentosa im Zebrafisch-Systeme

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Impfung von der Erwachsenen Zebrabärbling (Danio Rerio) mit einem DNA-basierten Impfstoff und die Validierung einer erfolgreichen Impfung Veranstaltung zu demonstrieren. Diese Methode eignet sich für die präklinische Screening Impfstoffkandidaten in verschiedenen Infektionsmodelle.

Impfung von Erwachsenen Zebrafisch für die präklinische Screening von DNA-basierte Impfstoffe

Dieses Protokoll enthält Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Generierung und Fehlerbehebung von Xenotransplantaten der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) beim Menschen aus Zelllinien und frischem Patientenmaterial in transient immunsupprimierten Zebrafischembryonen sowie Richtlinien für die Beurteilung des Ansprechens auf das Arzneimittel mittels Durchflusszytometrie. Die experimentelle Pipeline kann auch für solide Tumore angepasst werden.

Schnelle in vivo Vorhersage des Ansprechens auf Medikamente mit Hilfe von Leukämiezelltransplantaten in Zebrafischembryonen

Derzeit fehlt es an in vivo-Modellen , die sich für ein Wirkstoffscreening gegen chronische bakterielle Infektionen eignen. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für die Wundinfektion mit einem klinischen Isolat von Pseudomonas aeruginosa , um eine persistierende Infektion bei Zebrafischlarven zu erzeugen.

Modellierung einer persistierenden Pseudomonas aeruginosa-Infektion bei verwundeten Zebrafischlarven

Erfahren Sie die Anwendung von Phagentherapie gegen Pseudomonas aeruginosa bei Mukoviszidose-Zebrafischembryonen. Diese Methode ermöglicht die in vivo Bewertung der Phagenwirksamkeit bei bakteriellen Infektionen.

Phage Therapy Anwendung gegen Pseudomonas aeruginosa Infektion bei Mukoviszidose Zebrafisch Embryonen

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