2D-HELS MS Seq: Eine allgemeine LC-MS-basierte Methode zur direkten und de novo Sequenzierung von RNA-Gemischen mit unterschiedlichen Nukleotidmodifikationen
July 10th, 2020
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für eine LC-MS-basierte Sequenzierungsmethode, die als direkte Methode zur Sequenzierung kurzer RNA (<35 nt pro Lauf) ohne cDNA-Zwischenprodukt und als allgemeine Methode zur Sequenzierung verschiedener Nukleotidmodifikationen in einer einzigen Studie mit Einzelbasenpräzision verwendet werden kann.
Dieses Protokoll deckt alle wesentlichen Schritte ab, die bei der Verwendung der neuen Methode zur direkten Sequenzierung von RNA erforderlich sind, unabhängig davon, ob es sich um eine einzelsträngige, gemischte oder modifizierte RNA-Probe handelt. Die Methode wird nicht durch enzymatische Fehler oder Basenkomplementarität beeinflusst. Es bietet einen direkten Arbeitsablauf und eine allgemeine Lösung, die es ermöglicht, verschiedene RNA-Modifikationen gleichzeitig zu sequenzieren, anstatt jeweils eine spezifische Modifikation zu sequenzieren.
Diese Technologie kann zu einem diagnostischen Werkzeug entwickelt werden, um Signatur-RNA-Segmente zu bestimmen, um sie mit menschlichen Krankheiten in Verbindung zu bringen, und zu einem genauen Werkzeug zur Untersuchung von RNA-Modifikationen auf epitranskriptomischer Ebene. Die Methode stützt sich auf keine vorherige Sequenzierungsmethode. Stattdessen handelt es sich um einen völlig neuen Ansatz, und wir streben an, ihn zur Methode der Wahl für die Sequenzierung jeder modifizierten RNA zu machen.
Einige Teile dieses Protokolls enthalten kritische Aspekte, die durch visuelle Demonstration genauer vermittelt werden können, wie z. B. die Beschriftung des 3'-Endes der RNA-LC-MS-Datenerfassung und die Datenanalyse durch die MassHunter-Software. Ich werde dieses Verfahren demonstrieren und das LC-MS einrichten und unsere RNA-Proben messen. Um eine einstufige Markierungsreaktion durchzuführen, kombinieren Sie 2 Mikroliter 150 mikromolare AppCp-Biotin, 3 Mikroliter 10x Ligase-Reaktionspuffer, 1,5 Mikroliter 100 mikromolare RNA-Probe, 3 Mikroliter wasserfreies DMSO, 10 Einheiten T4-RNA-Ligase und 19,5 Mikroliter DEPC-behandeltes Wasser für ein Gesamtvolumen von 30 Mikrolitern.
Inkubieren Sie die Reaktion über Nacht bei 16 Grad Celsius und führen Sie dann eine Säulenreinigung gemäß den Anweisungen des Manuskripts durch. Nachdem Sie die RNA in drei Aliquots aufgeteilt und ein gleiches Volumen Ameisensäure hinzugefügt haben, inkubieren Sie die Reaktionen bei 40 Grad Celsius. Sobald jede Reaktion abgeschlossen ist, frieren Sie die Probe sofort auf Trockeneis ein, um den Säureabbau zu unterdrücken.
Verwenden Sie einen Zentrifugal-Vakuumkonzentrator, um die Probe etwa 30 Minuten lang zu trocknen. Die getrockneten Proben werden in 20 Mikrolitern DEPC-behandeltem Wasser resuspendiert und kombiniert. Lagern Sie die Proben bis zur LC-MS-Messung bei 20 Grad Celsius.
Übertragen Sie die RNA-Probe in das LC-MS-Probenfläschchen, nachdem Sie die mobilen Phasen vorbereitet haben. Jede Injektion sollte 100 bis 400 Pikomole RNA und 20 Mikroliter enthalten. Verwenden Sie nach der Erfassung der Daten den Workflow zur Extraktion molekularer Merkmale, um Verbindungsinformationen zu extrahieren, einschließlich Masse, Retentionszeit, Volumen und Qualitätsfaktor.
Verwenden Sie das Schwerpunkt-Datenformat in den Einstellungen für kleine Moleküle. Legen Sie die Spitzenhöhe auf mindestens 100, aber weniger als 1.000 und die Qualitätsbewertung auf mindestens 50 fest. Exportieren Sie abschließend die Daten als Excel-Datei.
Die Trennung der 3'-Leiter von der 5'-Leiter und anderen unerwünschten Fragmenten ist hier auf einem 2D-Massenretentionszeitdiagramm dargestellt. Es ist auch möglich, gemischte Proben, die zwei unterschiedlich lange RNA-Stränge enthalten, mit einer 5'-Biotin-Markierung an jeder RNA zu sequenzieren. Zur Unterscheidung von Uridin und Pseudouridin wurde die RNA mit CMC behandelt, das ein Pseudouridin in ein CMC-Pseudouridin-Addukt umwandelt.
Das Addukt hat in einem Uridin eine andere Masse und kann im 2D-HELS MS Seq unterschieden werden. Das HPLC-Profil des Rohprodukts der Reaktion, das Pseudouridin in sein CMC-Addukt umwandelt, wurde verwendet, um die prozentuale Umwandlung zu berechnen, die 42% betrug. Eine Mischung aus fünf verschiedenen RNA-Strängen wurde mit dem 2D-HELS MS Seq-Ansatz mit 3'-End-Markierung sequenziert und zur besseren Visualisierung mehrerer RNA-Sequenzen normalisiert. Ohne die Normalisierung würden die Buchstabencodes für die Sequenzen der fünf RNAs zusammengedrängt werden.
Während Sie dieses Verfahren versuchen, richten Sie die Markierungsreaktion sorgfältig ein, um eine hohe Ausbeute an markierten RNA-Proben zu erhalten. Überwachen Sie außerdem die Abbauzeit sorgfältig, um zuverlässige Massenleitern zu erstellen und die maximale Menge an getrockneten Proben mit 20 Mikrolitern Wasser zu sammeln. Eine Frage, die nach der Durchführung dieses Protokolls gestellt werden kann, ist, wie die Breite, Länge und der Durchsatz der Sequenzierungsmethode erhöht werden können.
Ein besserer Algorithmus und ein fortschrittlicheres Instrument mit höherer Auflösung und Empfindlichkeit können helfen. Nach der Entwicklung dieses Protokolls wurde es möglich, ein breiteres Spektrum von RNA-Proben, die sowohl kanonische als auch modifizierte Nukleotide enthalten, direkt zu sequenzieren, ohne dass es zu Fehlern im Zusammenhang mit der CDA-basierten RNA-Sequenzierung kommt.
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Überblick
Dieser Artikel stellt eine neuartige LC-MS-basierte Sequenzierungsmethode für kurze RNA vor, die den Bedarf an einem cDNA-Zwischenprodukt eliminiert. Das Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Sequenzierung verschiedener RNA-Modifikationen mit Einzelbasen-Präzision.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- RNA-Sequenzierung
- Epitranskriptomik
- Biotechnologie
Hintergrund
- Aktuelle RNA-Sequenzierungsmethoden beruhen oft auf cDNA-Zwischenprodukten.
- Enzymatische Fehler können die Sequenzierungsgenauigkeit beeinflussen.
- Die gleichzeitige Sequenzierung von RNA-Modifikationen ist herausfordernd.
- Das Verständnis von RNA-Modifikationen ist entscheidend für die Untersuchung menschlicher Krankheiten.
Ziel der Studie
- Einführung einer direkten Sequenzierungsmethode für RNA.
- Ermöglichung der Untersuchung mehrerer RNA-Modifikationen in einer Analyse.
- Bereitstellung eines zuverlässigen Werkzeugs für die epitranskriptomische Forschung.
Verwendete Methoden
- LC-MS-basierte Sequenzierungstechnik.
- Direkte Sequenzierung einzelsträngiger, gemischter oder modifizierter RNA.
- Eliminierung des cDNA-Syntheseschritts.
- Workflow, der für hohe Präzision und Genauigkeit ausgelegt ist.
Hauptergebnisse
- Die Methode sequenziert erfolgreich kurze RNA (<35 nt) ohne cDNA.
- Gleichzeitige Detektion verschiedener RNA-Modifikationen wurde erreicht.
- Die Technik zeigte Widerstandsfähigkeit gegen enzymatische Fehler.
- Potenzielle Anwendungen in der Diagnostik für menschliche Krankheiten wurden identifiziert.
Schlussfolgerungen
- Diese neue Sequenzierungsmethode könnte ein Standard für die Analyse modifizierter RNA werden.
- Sie bietet einen umfassenden Ansatz zur Untersuchung von RNA-Modifikationen.
- Das Protokoll hat Auswirkungen auf zukünftige Forschungen in der RNA-Biologie.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This LC-MS-based RNA sequencing method enables direct, de novo sequencing of modified RNA mixtures without cDNA synthesis, addressing a key bottleneck in epitranscriptomic target validation. By providing quantitative, modification-resolved sequencing data, it supports early discovery of RNA-based biomarkers and mechanistic de-risking of therapeutic oligonucleotides. The approach enhances predictive confidence in lead identification by delivering sequence-confirmed, modification-specific outputs directly applicable to screening and assay development workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by directly sequencing RNA modifications such as pseudouridine and 5-methylcytosine in native contexts.
- Operational Value: Provides a general solution for simultaneous detection of canonical and modified nucleotides, reducing need for sequential modification-specific assays.
- Predictive Value: Supports target confidence through direct mass-retention time correlation of modified nucleobases, facilitating accurate site-specific modification mapping.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative mass and retention time outputs that enable reliable discrimination of RNA sequences in mixtures of up to 12 distinct oligonucleotides.
- Operational Value: Delivers reproducible, normalization-ready data compatible with standard high-resolution LC-MS systems, supporting assay standardization across short RNA panels.
- Scalability: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream screening by yielding sequence-verified RNA standards with defined modification patterns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports sequence verification of modified therapeutic RNA oligonucleotides, linking discovery-phase modifications to preclinical candidate evaluation.
- Mechanistic De-risking: Enables detection of modification-induced mass shifts (e.g., CMC-pseudouridine adduct) to distinguish true signal from degradation artifacts in complex samples.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides sequence confirmation without enzymatic bias, reducing false negatives in modification screening and improving go/no-go decision reliability.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows as a front-end sequencing tool for hypothesis-driven RNA analysis, feeding into lead identification by confirming sequence and modification status of synthetic or endogenous RNA targets prior to functional screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by delivering direct evidence of RNA sequence and modification co-occurrence in native or synthetic mixtures.
- Screening: Enables assay readiness through generation of mass-retention time ladders that serve as quantitative references for compound-induced RNA modifications or degradation profiling.
- Analytics: Produces centroid-based molecular feature data (mass, retention time, volume, quality score) exportable to Excel, enabling cross-condition comparison and statistical evaluation of modification stability.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing sequence-verified modified RNA standards suitable for biomarker alignment and functional validation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable LC-MS-based capability for rapid sequencing of short RNA variants (<35 nt), reducing dependency on outsourced sequencing and accelerating internal modification screening cycles.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence in target validation by eliminating cDNA-mediated errors and enabling direct observation of modification-specific mass signatures.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized labeling, acid quenching, and normalization steps that minimize inter-run variability in complex RNA mixtures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling internal sequencing of modified RNA, reducing reliance on external vendors and accelerating iteration cycles in lead optimization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering unambiguous sequence and modification data, decreasing late-stage attrition due to undetected RNA heterogeneity or misannotation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling, LC-MS operation, and MassHunter-based molecular feature extraction for accurate data interpretation.
- Depends on access to high-resolution LC-MS systems capable of centroid data acquisition with defined peak height (100–1000) and quality score (≥50) thresholds.
- Necessitates cross-team standardization of labeling efficiency, degradation timing, and normalization protocols to ensure consistent mass ladder generation across users and platforms.
- Involves adaptation considerations when extending beyond short RNA (<35 nt) or to complex biological samples, pending future algorithm and instrument improvements.
- Involves practical limitations including current throughput constraints and dependency on manual optimization of labeling reactions (e.g., AppCp-biotin, T4 ligase, DMSO) to maximize yield and ladder resolution.
