2D-HELS MS Seq: Eine allgemeine LC-MS-basierte Methode zur direkten und de novo Sequenzierung von RNA-Gemischen mit unterschiedlichen Nukleotidmodifikationen
10. Juli 2020
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für eine LC-MS-basierte Sequenzierungsmethode, die als direkte Methode zur Sequenzierung kurzer RNA (<35 nt pro Lauf) ohne cDNA-Zwischenprodukt und als allgemeine Methode zur Sequenzierung verschiedener Nukleotidmodifikationen in einer einzigen Studie mit Einzelbasenpräzision verwendet werden kann.
Dieses Protokoll deckt alle wesentlichen Schritte ab, die bei der Verwendung der neuen Methode zur direkten Sequenzierung von RNA erforderlich sind, unabhängig davon, ob es sich um eine einzelsträngige, gemischte oder modifizierte RNA-Probe handelt. Die Methode wird nicht durch enzymatische Fehler oder Basenkomplementarität beeinflusst. Es bietet einen direkten Arbeitsablauf und eine allgemeine Lösung, die es ermöglicht, verschiedene RNA-Modifikationen gleichzeitig zu sequenzieren, anstatt jeweils eine spezifische Modifikation zu sequenzieren.
Diese Technologie kann zu einem diagnostischen Werkzeug entwickelt werden, um Signatur-RNA-Segmente zu bestimmen, um sie mit menschlichen Krankheiten in Verbindung zu bringen, und zu einem genauen Werkzeug zur Untersuchung von RNA-Modifikationen auf epitranskriptomischer Ebene. Die Methode stützt sich auf keine vorherige Sequenzierungsmethode. Stattdessen handelt es sich um einen völlig neuen Ansatz, und wir streben an, ihn zur Methode der Wahl für die Sequenzierung jeder modifizierten RNA zu machen.
Einige Teile dieses Protokolls enthalten kritische Aspekte, die durch visuelle Demonstration genauer vermittelt werden können, wie z. B. die Beschriftung des 3'-Endes der RNA-LC-MS-Datenerfassung und die Datenanalyse durch die MassHunter-Software. Ich werde dieses Verfahren demonstrieren und das LC-MS einrichten und unsere RNA-Proben messen. Um eine einstufige Markierungsreaktion durchzuführen, kombinieren Sie 2 Mikroliter 150 mikromolare AppCp-Biotin, 3 Mikroliter 10x Ligase-Reaktionspuffer, 1,5 Mikroliter 100 mikromolare RNA-Probe, 3 Mikroliter wasserfreies DMSO, 10 Einheiten T4-RNA-Ligase und 19,5 Mikroliter DEPC-behandeltes Wasser für ein Gesamtvolumen von 30 Mikrolitern.
Inkubieren Sie die Reaktion über Nacht bei 16 Grad Celsius und führen Sie dann eine Säulenreinigung gemäß den Anweisungen des Manuskripts durch. Nachdem Sie die RNA in drei Aliquots aufgeteilt und ein gleiches Volumen Ameisensäure hinzugefügt haben, inkubieren Sie die Reaktionen bei 40 Grad Celsius. Sobald jede Reaktion abgeschlossen ist, frieren Sie die Probe sofort auf Trockeneis ein, um den Säureabbau zu unterdrücken.
Verwenden Sie einen Zentrifugal-Vakuumkonzentrator, um die Probe etwa 30 Minuten lang zu trocknen. Die getrockneten Proben werden in 20 Mikrolitern DEPC-behandeltem Wasser resuspendiert und kombiniert. Lagern Sie die Proben bis zur LC-MS-Messung bei 20 Grad Celsius.
Übertragen Sie die RNA-Probe in das LC-MS-Probenfläschchen, nachdem Sie die mobilen Phasen vorbereitet haben. Jede Injektion sollte 100 bis 400 Pikomole RNA und 20 Mikroliter enthalten. Verwenden Sie nach der Erfassung der Daten den Workflow zur Extraktion molekularer Merkmale, um Verbindungsinformationen zu extrahieren, einschließlich Masse, Retentionszeit, Volumen und Qualitätsfaktor.
Verwenden Sie das Schwerpunkt-Datenformat in den Einstellungen für kleine Moleküle. Legen Sie die Spitzenhöhe auf mindestens 100, aber weniger als 1.000 und die Qualitätsbewertung auf mindestens 50 fest. Exportieren Sie abschließend die Daten als Excel-Datei.
Die Trennung der 3'-Leiter von der 5'-Leiter und anderen unerwünschten Fragmenten ist hier auf einem 2D-Massenretentionszeitdiagramm dargestellt. Es ist auch möglich, gemischte Proben, die zwei unterschiedlich lange RNA-Stränge enthalten, mit einer 5'-Biotin-Markierung an jeder RNA zu sequenzieren. Zur Unterscheidung von Uridin und Pseudouridin wurde die RNA mit CMC behandelt, das ein Pseudouridin in ein CMC-Pseudouridin-Addukt umwandelt.
Das Addukt hat in einem Uridin eine andere Masse und kann im 2D-HELS MS Seq unterschieden werden. Das HPLC-Profil des Rohprodukts der Reaktion, das Pseudouridin in sein CMC-Addukt umwandelt, wurde verwendet, um die prozentuale Umwandlung zu berechnen, die 42% betrug. Eine Mischung aus fünf verschiedenen RNA-Strängen wurde mit dem 2D-HELS MS Seq-Ansatz mit 3'-End-Markierung sequenziert und zur besseren Visualisierung mehrerer RNA-Sequenzen normalisiert. Ohne die Normalisierung würden die Buchstabencodes für die Sequenzen der fünf RNAs zusammengedrängt werden.
Während Sie dieses Verfahren versuchen, richten Sie die Markierungsreaktion sorgfältig ein, um eine hohe Ausbeute an markierten RNA-Proben zu erhalten. Überwachen Sie außerdem die Abbauzeit sorgfältig, um zuverlässige Massenleitern zu erstellen und die maximale Menge an getrockneten Proben mit 20 Mikrolitern Wasser zu sammeln. Eine Frage, die nach der Durchführung dieses Protokolls gestellt werden kann, ist, wie die Breite, Länge und der Durchsatz der Sequenzierungsmethode erhöht werden können.
Ein besserer Algorithmus und ein fortschrittlicheres Instrument mit höherer Auflösung und Empfindlichkeit können helfen. Nach der Entwicklung dieses Protokolls wurde es möglich, ein breiteres Spektrum von RNA-Proben, die sowohl kanonische als auch modifizierte Nukleotide enthalten, direkt zu sequenzieren, ohne dass es zu Fehlern im Zusammenhang mit der CDA-basierten RNA-Sequenzierung kommt.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt eine neuartige, auf LC-MS basierende Sequenzierungsmethode für kurze RNA vor, die die Notwendigkeit eines cDNA-Zwischenprodukts eliminiert. Das Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Sequenzierung verschiedener RNA-Modifikationen mit Einzelbasenpräzision.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- RNA-Sequenzierung
- Epitranskriptomik
- Biotechnologie
Hintergrund
- Aktuelle Methoden der RNA-Sequenzierung beruhen häufig auf cDNA-Zwischenprodukten.
- Enzymatische Fehler können die Sequenzierungsgenauigkeit beeinträchtigen.
- Die gleichzeitige Sequenzierung von RNA-Modifikationen ist anspruchsvoll.
- Das Verständnis von RNA-Modifikationen ist entscheidend für die Erforschung menschlicher Krankheiten.
Zweck der Studie
- Eine Direktsequenzierungsmethode für RNA vorstellen.
- Die Untersuchung mehrerer RNA-Modifikationen in einer Analyse ermöglichen.
- Ein zuverlässiges Werkzeug für die Epitranskriptomik-Forschung bereitstellen.
Verwendete Methoden
- LC-MS-basierte Sequenziertechnik.
- Direkte Sequenzierung von einzelsträngiger, gemischter oder modifizierter RNA.
- Eliminierung des cDNA-Syntheseschritts.
- Arbeitsablauf für hohe Präzision und Genauigkeit konzipiert.
Hauptergebnisse
- Die Methode sequenziert erfolgreich kurze RNA (<35 nt) ohne cDNA.
- Es gelang der gleichzeitige Nachweis verschiedener RNA-Modifikationen.
- Die Technik zeigte Resilienz gegenüber enzymatischen Fehlern.
- Potentielle Anwendungen in der Diagnostik menschlicher Krankheiten wurden identifiziert.
Schlussfolgerungen
- Diese neue Sequenzierungsmethode könnte zum Standard für die Analyse modifizierter RNA werden.
- Sie bietet einen umfassenden Ansatz zur Untersuchung von RNA-Modifikationen.
- Das Protokoll hat Auswirkungen auf zukünftige Forschungen in der RNA-Biologie.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese auf LC-MS basierende RNA-Sequenzierungsmethode ermöglicht die direkte, de novo-Sequenzierung modifizierter RNA-Gemische ohne cDNA-Synthese und löst damit einen zentralen Engpass bei der Validierung epitranskriptomischer Zielstrukturen. Durch die Bereitstellung quantitativer, modificationsauflösender Sequenzierungsdaten unterstützt sie den frühen Nachweis RNA-basierter Biomarker und die mechanistische Entschärfung therapeutischer Oligonukleotide. Der Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Identifizierung von Leitstrukturen, indem er sequenzbestätigte, modificationspezifische Ergebnisse liefert, die direkt in Screening- und Assay-Entwicklungsworkflows einsetzbar sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch direkte Sequenzierung von RNA-Modifikationen wie Pseudouridin und 5-Methylcytosin in nativen Kontexten.
- Operationaler Wert: Bietet eine allgemeine Lösung zur gleichzeitigen Detektion kanonischer und modifizierter Nukleotide und reduziert damit den Bedarf an sequenziellen, modifications-spezifischen Assays.
- Prädiktiver Wert: Stärkt die Zuverlässigkeit der Zielstruktur durch direkte Korrelation von Masse und Retentionszeit modifizierter Nukleinbasen und ermöglicht so eine genaue, standortspezifische Kartierung von Modifikationen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Massen- und Retentionszeit-Ausgaben, die eine zuverlässige Unterscheidung von RNA-Sequenzen in Gemischen mit bis zu 12 unterschiedlichen Oligonukleotiden ermöglichen.
- Operativer Wert: Liefert reproduzierbare, zur Normalisierung bereite Daten, die mit gängigen hochauflösenden LC-MS-Systemen kompatibel sind und die Standardisierung von Assays für kurze RNA-Panels unterstützen.
- Skalierbarkeit: Erleichtert die Herstellung validierter biologischer Systeme für nachgeschaltete Screening-Verfahren, indem sie sequenzverifizierte RNA-Standards mit definierten Modifikationsmustern bereitstellt.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationaler Zusammenhang: Unterstützt die Sequenzverifikation modifizierter therapeutischer RNA-Oligonukleotide und verbindet Modifikationen aus der Entdeckungsphase mit der Bewertung präklinischer Kandidaten.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Ermöglicht den Nachweis von durch Modifikationen verursachten Massenverschiebungen (z. B. CMC-Pseudouridin-Addukt), um echte Signale von Zerfallsartefakten in komplexen Proben zu unterscheiden.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Bietet die Sequenzbestätigung ohne enzymatische Verzerrungen, verringert falsch-negative Ergebnisse bei der Modifikations-Screening und verbessert die Zuverlässigkeit von Go/No-Go-Entscheidungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows als vorgeschalteter Sequenzierungstool für hypothesengetriebene RNA-Analysen und unterstützt die Identifizierung von Leitstrukturen, indem sie die Sequenz und den Modifikationsstatus synthetischer oder endogener RNA-Ziele vor der funktionellen Untersuchung bestätigt.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen, indem direkte Nachweise für das gleichzeitige Vorkommen von RNA-Sequenzen und -Modifikationen in nativen oder synthetischen Gemischen geliefert werden.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch Erzeugung von Massen-Retentionszeit-Läufen, die als quantitative Referenzen für durch Verbindungen induzierte RNA-Modifikationen oder zur Profilierung des RNA-Abbaus dienen.
- Analytik: Erzeugt zentroidbasierte molekulare Merkmalsdaten (Masse, Retentionszeit, Volumen, Qualitätsbewertung), die nach Excel exportiert werden können, um einen Vergleich über verschiedene Bedingungen hinweg sowie eine statistische Bewertung der Stabilität von Modifikationen zu ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Forschung, indem sequenzverifizierte, modifizierte RNA-Standards bereitgestellt werden, die für die Abstimmung von Biomarkern und deren funktionelle Validierung in krankheitsrelevanten Systemen geeignet sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare, auf LC-MS basierende Methode zur schnellen Sequenzierung kurzer RNA-Varianten (<35 nt), wodurch die Abhängigkeit von externer Sequenzierung verringert und interne Screening-Zyklen für Modifikationen beschleunigt werden.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert eine vorhersagbare Sicherheit bei der Target-Validierung, indem cDNA-vermittelte Fehler eliminiert und die direkte Beobachtung modifikationsspezifischer Massensignaturen ermöglicht wird.
- Operationaler Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Markierung, Ansäuerung und Normalisierungsschritte, die die Variabilität zwischen Durchgängen bei komplexen RNA-Mischungen minimieren.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem die eigene Sequenzierung modifizierter RNA ermöglicht wird, wodurch die Abhängigkeit von externen Dienstleistern verringert und die Iterationszyklen in der Optimierung von Leitverbindungen beschleunigt werden.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem klare Sequenz- und Modifikationsdaten bereitgestellt werden, wodurch die Ausscheidung in späteren Entwicklungsstadien aufgrund unentdeckter RNA-Heterogenität oder fehlerhafter Annotation reduziert wird.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit RNA, der Bedienung von LC-MS-Systemen und der molekularen Merkmalsextraktion auf Basis von MassHunter für eine genaue Dateninterpretation.
- Basiert auf dem Zugang zu hochauflösenden LC-MS-Systemen, die in der Lage sind, zentroidierte Datenakquise mit definierten Schwellwerten für Peakhöhe (100–1000) und Qualitätsbewertung (≥50) durchzuführen.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über verschiedene Arbeitsgruppen hinweg bei der Markierungseffizienz, dem Zeitpunkt des Abbaus und den Normalisierungsprotokollen voraus, um eine konsistente Erzeugung von Massenladdern über verschiedene Anwender und Plattformen hinweg sicherzustellen.
- Erfordert Anpassungen, wenn die Methode über kurze RNA (<35 nt) hinaus oder auf komplexe biologische Proben ausgeweitet wird, abhängig von zukünftigen Verbesserungen der Algorithmen und Instrumente.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen wie derzeitige Durchsatzbegrenzungen sowie die Abhängigkeit von manueller Optimierung der Markierungsreaktionen (z. B. AppCp-Biotin, T4-Ligase, DMSO), um Ausbeute und Auflösung der Ladder zu maximieren.
