Evaluierung des Zelltods mit zellfreiem Überstand von Probiotika in dreidimensionalen sphäroiden Kulturen von Darmkrebszellen
13. Juni 2020
Hier werden Methoden vorgestellt, um die krebshemmende Wirkung von Lactobacillus cell-free superstandant (LCFS) zu verstehen. Darmkrebs-Zelllinien zeigen Zelltod, wenn sie mit LCFS in 3D-Kulturen behandelt werden. Der Prozess der Erzeugung von Sphäroiden kann je nach Gerüst optimiert werden und die vorgestellten Analysemethoden sind nützlich, um die beteiligten Signalwege zu bewerten.
Dieses Protokoll wurde optimiert, um die krebshemmende Wirkung des zellfreien Überstands von Lactobacillus in mehreren Arten von Sphäroiden von Dickdarmkrebszellen zu untersuchen. Diese Technik ist der erste Ansatz, der die krebshemmende Wirkung von LCFS auf Dickdarmkrebs-Sphäroide unter in vivo Mimikry-Bedingungen untersucht. Beginnen Sie damit, eine im Autoklaven sterilisierte MRS-Agarplatte in eine 37 Grad Celsius heiße anaerobe Kammer mit 20 Teilen pro Million Sauerstoff zu legen und die Platte mit frisch aufgetautem Lactobacillus-Bakterienfond zu beimpfen.
Geben Sie zwei bis drei Milliliter MRS-Brühe, ergänzt mit L-Cystein, in die Tube und verschließen Sie die Tube mit dem Butylkautschukstopfen und der Tubenkappe. Verwenden Sie als Nächstes eine Schlaufe, um eine einzelne Kolonie zu sammeln, und legen Sie die Kolonie in ein 1,5-Milliliter-Kulturröhrchen, das 500 Mikroliter PBS enthält. Resuspendieren Sie die Kolonie homogen in der Kochsalzlösung und füllen Sie die gesamte Bakteriensuspension in eine Ein-Milliliter-Spritze.
Führen Sie die Nadel in die Mitte des Deckels des Kulturröhrchens ein und geben Sie die Kolonie in das Medium ab. Stellen Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und 200 Umdrehungen pro Minute in einen Schüttelinkubator. Messen Sie nach zwei Tagen den OD620 der Kultur mit einem Spektralphotometer.
Wenn der OD620 gleich zwei ist, sedimentieren Sie die Bakterien durch Zentrifugation und waschen Sie das Bakterienpellet mit PBS. Nach der zweiten Zentrifugation resuspendieren Sie die Bakterien in vier Millilitern RPMI 1640, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum ohne Antibiotika, und legen Sie die Bakterien vier Stunden lang bei 100 Umdrehungen pro Minute in den Schüttekubator. Am Ende der Inkubation pelletieren Sie die Bakterien durch Zentrifugation und sterilisieren den zurückgewonnenen Überstand durch ein 0,22-Mikron-Sieb für eine Lagerung bei minus 80 Grad Celsius.
Um kolorektale Krebszelllinien für die Sphäroidbildung vorzubereiten, kultivieren Sie die interessierenden Zellen als Monolayer in 100-Millimeter-Petrischalen im Zellkultur-Inkubator. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 70 bis 80 % erreichen, waschen Sie die Kulturen zweimal mit vier Millilitern PBS pro Waschgang, bevor Sie die Zellen mit einem Milliliter 0,25 % Trypsin-EDTA pro Schale ablösen. Überprüfen Sie nach zwei Minuten unter einem Lichtmikroskop auf Dissoziation.
Haben sich die Zellen abgelöst, neutralisieren Sie die enzymatische Reaktion mit fünf Millilitern Wachstumsmedium. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen pro Zellkultur und resuspendieren Sie die Pellets vorsichtig mit drei Millilitern Wachstumsmedium pro Röhrchen. Zählen Sie dann die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch Trypanblau-Ausschluss.
Nach der Zählung verdünnen Sie die Zellen auf eine bis zwei mal 10 bis fünfte Zellen pro Milliliter Konzentration in frischem Medium und fügen Sie den Zellen Methylcellulose bis zu einer endgültigen Konzentration von 0,6 % hinzu. Übertragen Sie die Zellen in ein steriles Reservoir und geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 200 Mikroliter Zellen in jede Vertiefung einer 96-Well-Mikroplatte mit rundem Boden mit extrem geringer Bindung ab. Legen Sie die Platte dann für 24 bis 36 Stunden in den Zellkultur-Inkubator, bevor Sie lichtmikroskopisch auf die Bildung von Sphäroiden prüfen.
Für die LCFS-Behandlung verdünnen Sie die vorbereitete aufgetaute LCFS-Stammlösung seriell in frischem Wachstumsmedium auf Konzentrationen von 25, 12,5 und 6 % und verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um vorsichtig so viel Überstand wie möglich aus jeder Vertiefung der plattierten Darmkrebszelllinienkulturen zu entfernen. Geben Sie dann vorsichtig 200 Mikroliter LCFS-supplementiertes Wachstumsmedium in dreifacher Ausfertigung zu jedem Satz von Krebszellen und stellen Sie die Platte für weitere 24 bis 48 Stunden in den Inkubator. Eine Methylcellulosekonzentration von 0,6 % verwandelt die getesteten Zellen der Krebszelllinien in kompakte Sphäroide, was darauf hindeutet, dass Sphäroide aus verschiedenen Arten von Darmkrebs mit diesem Protokoll erzeugt werden können.
Sphäroide, die mit 25%LCFS kultiviert wurden, weisen dosisabhängig gestörte Oberflächen und eine verminderte Zellviabilität auf. Tatsächlich weisen LCFS-kokultivierte Zellen im Vergleich zu lebensfähigen Kontrollzellen eine höhere Propidiumiodid-Expression auf. Reverse-Transkriptase-PCR-Analysen, Western-Blotting und durchflusszytometrische Annexin-V/7-AAD-Analysen können ebenfalls durchgeführt werden, um die Auswirkungen von LCFS auf die Apoptose von Krebszellen zu beurteilen.
Achten Sie darauf, die Sphäroide vorsichtig zu behandeln, wenn Sie das Wachstumsmedium entfernen, da die Sphäroide leicht brechen können, was es unmöglich macht, die Wirkung der LCFS-Behandlung zu beobachten. Im Anschluss an dieses Verfahren können Zellviabilitätsassays, quantitative Echtzeit-PCR, Western Blotting und FACS-Analysen durchgeführt werden, um die krebshemmende Wirkung von LCFS detaillierter zu charakterisieren.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Untersuchung der anti-karzinogenen Wirkungen von Lactobacillus-Zellfreiem Überstand (LCFS) auf Kolonkarzinom-Sphäroiden vor. Die Studie optimiert die Erzeugung von Sphäroiden und bewertet die an der Zelltod-Signalübertragung beteiligten Signalwege.
Wichtige Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Krebsforschung
Hintergrund
- Lactobacillus ist für seine potenziellen gesundheitlichen Vorteile bekannt.
- Zellfreie Überstände können bioaktive Verbindungen enthalten.
- Das kolorektale Karzinom bleibt eine bedeutende gesundheitliche Herausforderung.
- 3D-Zellkulturen bilden in-vivo-Bedingungen besser nach.
Zweck der Studie
- Untersuchung der anti-karzinogenen Wirkungen von LCFS auf kolorektale Krebs-Sphäroide.
- Optimierung der Methoden zur Sphäroid-Generierung.
- Analyse der Signalwege, die an den beobachteten Wirkungen beteiligt sind.
Verwendete Methoden
- Herstellung von MRS-Agarplatten in einer anaeroben Kammer.
- Inokulation der Platten mit Lactobacillus-Bakterienstamm.
- Kultivierung der Bakterien in MRS-Brühe, ergänzt mit L-Cystein.
- Sammlung und Resuspension bakterieller Kolonien zur Behandlung.
Hauptergebnisse
- Kolonkarzinomzelllinien zeigten Zelltod, wenn sie mit LCFS behandelt wurden.
- Optimierte Methoden zur Sphäroid-Generierung verbesserten die experimentellen Ergebnisse.
- Die an dem Zelltod beteiligten Signalwege wurden effektiv analysiert.
- Die Studie bietet einen neuartigen Ansatz für die Krebsbehandlungsforschung.
Schlussfolgerungen
- LCFS zeigt vielversprechende Wirkung als potenzieller Antikrebswirkstoff.
- 3D-Kultivierungstechniken sind entscheidend für eine genaue Modellierung.
- Weitere Forschung ist erforderlich, um die beteiligten Mechanismen vollständig zu verstehen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht es Teams aus der Biopharma-Forschung und Entwicklung, probiotisch gewonnene Überstände auf ihre Anti-Krebs-Aktivität in physiologisch relevanten 3D-Modellen des kolorektalen Karzinoms zu untersuchen. Mithilfe des zellfreien Überstands von Lactobacillus fermentum (LCFS) in stabilen Sphäroidkulturen unterstützt das Verfahren die mechanistische Risikominimierung natürlicher Produktkandidaten und erhöht die Vorhersagegenauigkeit bei der Validierung von Zielstrukturen. Der Ansatz verbindet die Screening-Phase der Entdeckung mit translationaler Relevanz, indem er Wechselwirkungen im Darummilieu modelliert, die die Lebensfähigkeit von Krebszellen beeinflussen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht therapeutische Hypothesen bezüglich mikrobieller Metabolite und deren Einfluss auf die programmierte Zelltodwege von Darmkrebszellen.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch dosisabhängige Vitalitätsmessungen in 3D-Sphäroidmodellen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Selektion von Wirkstoffkandidaten, indem die LCFS-induzierte Apoptose mit messbaren molekularen Markern über qRT-PCR, Western Blot und FACS verknüpft wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Verbindungsscreening unter Verwendung reproduzierbarer Sphäroidbildung in Platten mit ultra-niedriger Anhaftung vor.
- Quantitative Ausgabe: Erzeugt Dosis-Wirkungs-Daten (25 %, 12,5 %, 6 % LCFS), die die Schätzung der IC50 und die Modellierung der Struktur-Wirkungs-Beziehung ermöglichen.
- Skalierbarkeit: Verwendet ein 96-Loch-Format, das mit automatisierter Flüssigkeitshandhabung und hochdurchsatzfähiger Vitalitätsscreening kompatibel ist.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert die Pathophysiologie von kolorektalem Krebs unter Verwendung von Sphäroiden aus patienteneigenen oder etablierten Zelllinien, die die Tumorarchitektur in vivo widerspiegeln.
- Translationale Kontinuität: Verbindet entdeckte Befunde mit der präklinischen Validierung, indem über alle Teststufen hinweg konsistente 3D-Kulturbedingungen beibehalten werden.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Ermöglicht Go/No-Go-Kriterien basierend auf der Induktion von Apoptose und beobachteten Vitalitätsschwellen in Sphäroid-Kokulturen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode ist in frühe Entdeckungsworkflows integriert, die auf die Zielidentifizierung folgen und der Leadoptimierung vorausgehen, und bietet ein krankheitsrelevantes System zur Bewertung bioaktiver Überstände mikrobieller Quellen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung mikrobieller Anti-Krebs-Mechanismen und die Aufklärung von Signalwegen in 3D-Modellen, die in-vivo-Reaktionen besser vorhersagen.
- Screening: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch standardisierte Sphäroidbildung und LCFS-Behandlungsprotokolle.
- Analytik: Ermöglicht quantitative Messungen abhängiger Variablen (Lebensfähigkeit, Apoptosemarker), die statistische Vergleiche zwischen Behandlungsbedingungen und Zelllinien unterstützen.
- Translationale Forschung: Gewährleistet Kontinuität von der sphäroidbasierten Bildschirmanalyse bis zur präklinischen Validierung, indem die Authentizität der 3D-Kultur erhalten bleibt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zum Screening von Probiotika-Überständen, Fermentationsprodukt-Extrakten oder therapeutischen Wirkstoffen aus dem Mikrobiom über mehrere Krebsarten hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem falsch-positive Ergebnisse aus 2D-Modellen reduziert und mikroumgebungsabhängige Effekte erfasst werden.
- Operativer Wert: Standardisiert die Erzeugung und Behandlung von Sphäroiden, verbessert die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Standorten und verringert die Variabilität von Assays.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem eine frühzeitige Risikominderung mikrobiomzielgerichteter Interventionen vor kostspieligen In-vivo-Studien ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung natürlicher Produkt-Leads basierend auf der Induktion von Apoptose und Dosis-Wirkungsbeziehungen in klinisch relevanten Modellen.
Durchführungsaspekte
- Setzt Fachkenntnisse in der anaeroben Bakterienkultur, im Umgang mit 3D-Sphäroiden und in Apoptose-Assay-Techniken (qPCR, WB, FACS) voraus.
- Ist abhängig von Instrumenten wie Anaerobkammern, Schüttelinkubatoren, Spektrophotometern und Durchflusszytometern.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Mikrobiologie- und Krebsbiologie-Teams zur konsistenten Herstellung von LCFS und zur Qualitätssicherung der Sphäroide.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn die Methode auf andere Bakterienstämme oder Krebsarten jenseits von kolorektalen Modellen ausgeweitet wird.
- Ist durch die Empfindlichkeit der Sphäroide während des Mediumwechsels begrenzt, was ein schonendes Vorgehen erfordert, um die strukturelle Integrität für aussagekräftige Messergebnisse zu bewahren.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:34
Bacterial Cell Culture and Lactobacillus Cell-Free Supernatant (LCFS) Preparation
2:18
Colorectal Cancer Cell Line Preparation
3:12
Spheroid Formation
3:49
3D colorectal Cancer Cell LCFS Treatment
4:26
Results: Representative Effects of LCFS Co-Culture on Spheroid Formation and Viability
5:22
Conclusion
