Name: Papierbasierte Vorkonzentration und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 26 s
Description: Erfahren Sie die papierbasierte Vorkonzentration und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen mit dem XO Pad. Diese chemiefreie Methode zeigt höhere Wiederfindungsraten als konventionelle Verfahren und vereinfacht die Erforschung extrazellulärer Vesikel erheblich.

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Diese Studie wurde von der National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A090840444 unterstützt. J. H. Lee wurde 2019 durch ein Forschungsstipendium der Kwangwoon University unterstützt. Hyerin Kim wurde vom "Competency Development Program for Industry Specialists" des koreanischen Ministeriums für Handel, Industrie und Energie (MOTIE) unterstützt, das vom Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (Nr. P0002397, HRD-Programm zur industriellen Konvergenz tragbarer Intelligenter Geräte).

1. Gerätefertigung
<ol><li>Definieren Sie den Bereich, der auf Papier gedruckt werden soll, mit DerDruckersoftware (Tabelle der Materialien). HINWEIS: Das Design hat 12 wachsgemusterte Schichten, in denen sich die Durchmesser der kreisförmigen Probenbereiche allmählich von 5 mm bis 2 mm verengen(Abbildung 1A).</li>
	<li>Drucken Sie hydrophobes Wachs auf den ausgewiesenen Bereichen auf beiden Seiten des Zellulosepapiers (Materialtabelle) mit einem kommerziellen Wachsdrucker (Materialtabelle) (Abbildung 1B).</li>
	<li>Das wachsbedruckte Papier in einen Laborofen für 80 s bei 120 °C stellen. HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht es dem Wachs, die Innenseite des Papiers zu erreichen, indem es einen thermischen Rückfluss des bedruckten Wachses erreicht. Bei diesem Inkubationsprotokoll beträgt die Auflösung des Musters 2 mm. Achten Sie also darauf, keine Muster von weniger als 2 mm zu drucken. Andernfalls werden die Muster durch das Wachs blockiert.</li>
	<li>Schneiden Sie das wachsbedruckte Papier mit einem Fräser, um einzelne Geräte herzustellen (Abbildung 1C).</li>
	<li>Tropfen Sie 5 l und 2 l permselektive Membran (z. B. Nafion; Materialtabelle) auf die Stichprobenbereiche in der linken bzw. rechten Schicht(Abbildung 1D).</li>
	<li>Legen Sie die mit der permselektiven Membran beschichteten Schichten 30 min bei 70 °C auf eine Kochplatte, um das permselektive Membranlösungsmittel zu verdampfen.</li>
	<li>Versiegeln Sie die äußerste Oberfläche der beschichteten Schicht gegenüber der Pufferlösung mit druckempfindlichem Klebeband und hinterlassen Sie ein kleines Loch.</li>
	<li>Falten Sie das gedruckte Einzelgerät (z.B. Exo-PAD) entlang der weißen Linien hin und her. HINWEIS: Durch Falten des Geräts werden alle Probenbereiche konvergend verbunden (Abbildung 1E). Dieses konvergente Design fokussiert die elektrischen Feldleitungen, wenn die Spannung für ICP angewendet wird, wodurch eine intensivere Vorkonzentration der Mikrovesiken und Exosomen erreicht wird.</li>
</ol>2. Anreicherung und räumliche Fokussierung von Mikrovesikeln und Exosomen durch Ionenkonzentrationspolarisation
<ol><li>Laden Sie 15 l der Mikrovesikel- und Exosomenprobe (3 x 1011 Partikel/ml in 0,1x Phosphatgepufferte Saline [PBS] mit 0,05 % Tween 20) in die konvergenten Probenbereiche durch Pipetieren und warten Sie einige Sekunden, um eine vollständige Benetzung aller Probenbereiche sicherzustellen (Abbildung 1F).</li>
	<li>Legen Sie zwei Acrylkammern an beiden Enden des Exo-PAD und klemmen Sie den Exo-PAD sicher mit kleinen Bindeklammern, um eine Entfaltung zu verhindern (Abbildung 1G).</li>
	<li>Füllen Sie die Kammern mit 110 l 0,1x PBS und setzen Sie zwei Ag/AgCl-Elektroden ein (Abbildung 1H).</li>
	<li>30 V auf die Elektroden für 20 min mit einem Strom-Spannungs-Quellenmesssystem (Materialtabelle )auftragen. HINWEIS: Die angelegte Spannung erzeugt das ICP-Phänomen und konzentriert damit die Mikrovesiken und Exosomen auf die Schichten 8 und 9 des Exo-PAD.</li>
</ol>3. Isolierung der angereicherten Mikrovesikeln und Exosomen
<ol><li>Trennen Sie den gefalteten Exo-PAD von den Acrylkammern und entfalten Sie das Gerät, um die angereicherten Mikrovesiken und Exosomen von den anderen Schichten zu isolieren (Abbildung 1I).</li>
	<li>Die Probenbereiche in den Schichten 8 und 9, in denen die Mikrovesiken und Exosomen angereichert sind, für die nachgelagerte Analyse herausstechen (Abbildung 1J).</li>
</ol>4. Rasterelektronenmikroskopische Analyse
<ol><li>Fixieren Sie die angereicherten Mikrovesikeln und Exosomen, indem Sie die gestanzten Bereiche in 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Natrium-Cakodylat-Puffer für 1 h und in 1% Osmiumtetroxid in 0,1 M Natriumcakodylat für 1 h eintauchen. VORSICHT: Osmiumtetroxid ist hochgiftig und gefährlich chemisch. Da Osmiumtetroxid in Kunststoffe eindringen kann, muss es in Glas gelagert werden. Jede Handhabung von Osmiumtetroxid muss in einer chemischen Rauchhaube mit doppelten Nitrilhandschuhen erfolgen.</li>
	<li>Dehydrieren Sie die festen Mikrovesikeln und Exosomen mit aufsteigenden Qualitäten von 200 nachgewiesenem Ethanol (d. h. 50 %, 70 %, 90 % und 100 %) für jeweils 30 min.</li>
	<li>Trocknen Sie die Probe chemisch, indem Sie sie 30 min lang in Hexamethyldisilazan in einen Trockenbaumittel eintauchen. VORSICHT: Hexamethyldisilazan ist eine brennbare und feuchtigkeitsempfindliche Chemikalie. Es muss in einem trockenen und gut belüfteten Bereich abseits von Zündquellen gelagert werden.</li>
	<li>Beschichten Sie die vollständig getrockneten Mikrovesiken und Exosomen mit Gold/Palladium (ca. 20 nm) über Sputtern und erfassen Sie Rasterelektronenmikroskopie (SEM)-Bilder.</li>
</ol>5. Nanopartikel-Tracking-Analyse
<ol><li>Stanzen Sie die Probenbereiche in den Schichten 6, 8 und 10 mit einem Biopsie-Punch nach 20 min Gerätebetrieb aus.</li>
	<li>Tauchen Sie jeden ausgestanzten Bereich in Pufferlösung ein (0,1x PBS mit 0,01% Tween 20).</li>
	<li>Wirbel für 10 min und Zentrifuge für 30 s bei 6.000 U/min, um die angereicherten Mikrovesikeln und Exosomen wieder auszusetzen.</li>
	<li>Entfernen Sie die ausgestanzten Bereiche aus der Lösung und messen Sie die Konzentration von Mikrovesikeln und Exosomen mit einem Nanopartikel-Tracking-Analyse-Analyse-Instrument (NTA)(Tabelle der Materialien).</li>
</ol>

<ol><li>Edgar, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q+%26+A%3A+What+are+exosomes%2C+exactly%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Q & A: What are exosomes, exactly.</a> BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).</li>
<li>Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+exosome+isolation+and+analysis%3A+Enabling+liquid+biopsy+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).</li>
<li>Simons, M., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+-+vesicular+carriers+for+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).</li>
<li>Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+microvesicles+in+normal+physiology%2C+pathophysiology%2C+and+renal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases.</a> Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).</li>
<li>Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+devices+for+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52722(2015).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origami-paper-based+device+for+microvesicle%2Fexosome+preconcentration+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation.</a> Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+microvesicles%3A+Extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-Free+Isolation+of+Exosomes+from+Extracellular+Vesicles+by+Microfluidic+Viscoelastic+Flows%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows.</a> ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).</li>
<li>Marczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+isolation+and+preconcentration+of+exosomes+by+ion+concentration+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization.</a> Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).</li>
<li>Livshts, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+exosomes+by+differential+centrifugation%3A+Theoretical+analysis+of+a+commonly+used+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).</li>
<li>Chiriacò, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-chip+for+exosomes+and+microvesicles+detection+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization.</a> Sensors. 18 (10), 3175(2018).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li>
<li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrokinetic+size-based+spatial+separation+of+micro%2Fnanospheres+using+paper-based+3d+origami+preconcentrator%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator.</a> Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).</li>
<li>Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+pre-concentration+with+high+enrichment+factors+at+a+fixed+location+in+paper-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Obwohl der Exo-PAD erfolgreich zur Anreicherung und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen eingesetzt wurde, sollten mehrere kritische Punkte sorgfältig berücksichtigt werden: 1) die Inkubationszeit und -temperatur des Ofens während der Gerätevorbereitung, 2) Verarbeitungszeit, 3) Anwendung von Spannung mit unterschiedlichen Schichtzahlen und Probenflächendurchmessern und 4) Anwendbarkeit auf klinische Proben.
Die im Protokoll angegebene Inkubationszeit und -temperatur sind optimierte Bedin...

Mikrovesikeln und Exosomen sind kleine Membranbläschen mit einer Größe von 0,2 x 1 m bzw. 30 bis 200 nm. Sie werden von mehreren verschiedenen Zelltypen1,2,3,4,5in die extrazelluläre Umgebung sezerniert. Sie enthalten elterliche Zellinformationen in Form von Teilmengen von DNA, mRNA, miRNA, Proteinen und Lipiden und zirkulieren im ganzen Körper über verschiedene Körperflüssigkeiten wie Serum, Plasma, Urin, Zerebrospinalflüssigkeit, Fruchtwasser und Speichel6,7,8,9. So können Techniken zur effizienten Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen aus biologischen Flüssigkeiten umfangreiche Möglichkeiten in den Bereichen Diagnose, Prognose und Echtzeitüberwachung von Krankheiten sowie bei der Entwicklung neuer Therapeutika bieten.
Die herkömmliche Isolationsmethode für Mikrovesikeln und Exosomen auf Basis der Ultrazentrifugation ist jedoch extrem zeitaufwändig und verursacht einen erheblichen Verlust und eine Kontamination der Probe. Dies liegt daran, es beinhaltet mehrere umständliche Pipettier- und Ladeschritte und das Wegwerfen verschiedener Reagenzien mit wiederholter Ultrazentrifugation5,6,10,11,12. Darüber hinaus kann die hohe Scherspannung, die durch Ultrazentrifugation induziert wird (100.000 x g), die physikalische Lyse von Mikrovesikeln und Exosomen verursachen und zu schlechten Rückgewinnungsraten (5-23%)6,13,14führen. Daher muss eine hocheffiziente, unauffällige Isolationstechnik für Mikrovesikeln und Exosomen entwickelt werden, um Schäden und Verluste zu reduzieren und so höhere Rückgewinnungsraten zu erzielen.
Ein Origami-Papier-basiertes Gerät (Exo-PAD) wurde für eine einfachere, schonendere und hocheffiziente Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen6entwickelt. Das Design des Exo-PAD ist ein mehrfaches Papier mit seriell verbundenen Probenbereichen, die allmählich im Durchmesser abnehmen. Die Ionkonzentrationspolarisationstechnik (ICP), ein nano-elektrokinetisches Phänomen, das geladene Biomoleküle vorkonzentriert, wurde in dieses einzigartige Design integriert. Der Einsatz des Exo-PAD führte zu einer fünffachen Anreicherung der Mikrovesikeln und Exosomen in bestimmten Schichten und deren Isolierung durch einfaches Entfalten des Geräts. Dieser Artikel beschreibt die Exo-PAD im Detail, von der gesamten Gerätefertigung und -bedienung bis zur Analyse ihrer Verwendung, um die Methode zu veranschaulichen und repräsentative Ergebnisse zu zeigen6.

<table><tbody><tr><td>Ag/AgCl-Elektroden</td><td>A-M Systems, Inc.</td><td>531500</td> Albumin <td>mit 0,15" Durchmesser</td></tr><tr><td>aus Rinderserum (BSA), Alexa Fluor 594 Konjugat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A13101</td><td>BSA, konjugiert mit Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)</td></tr><tr><td>Karbonat-Bicarbonat-Puffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3041-50CAP</td><td>Karbonat-Puffer</td></tr><tr><td>CorelDraw-Software (Coral Co., Kanada)</td><td>Corel Corporation</td><td></td><td>Druckersoftware zur Definition des Wachsdrucks Region</td></tr><tr><td>ColorQube 8870</td><td>Xerox Corporation</td><td></td><td>Wachsdrucker</td></tr><tr><td>Chromatographiepapier Klasse 1</td><td>Whatman</td><td>3001-861</td><td>Zellulosepapier, Abmessung: 20 * 20 cm</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmarkierte Exosomenstandards</td><td>HansaBioMed Life Sciences, Ltd.</td><td>HBM-F-PEP-100</td><td>Exosom markiert mit FITC (Ex/Em: 490/520 nm)</td></tr><tr><td>Keithley 2410 Strom-/Spannungsquellenmessgerät</td><td>Keithley Instruments, Inc.</td><td></td><td>Aktuell&ndash; Spannungsquellen-Messsystem</td></tr><tr><td>Nafion perfluorierte Harzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31175-20-9</td><td>Permselektive Membran, 20 Gew.-% in der Mischung aus niederen aliphatischen Alkoholen und Wasser; enthält 34 % Wasser</td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td><td>NanoSight Technology</td><td></td><td>Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) Gerät</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH7,4)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010001</td><td></td></tr></tbody></table>

papierbasierte vorkonzentration und isolierung von mikrovesikeln und exosomen

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

Mikrovesikeln und Exosomen sind kleine membranöse Vesikel, die in die extrazelluläre Umgebung freigesetzt und im ganzen Körper zirkuliert. Da sie verschiedene elterzellabgeleitete Biomoleküle wie DNA, mRNA, miRNA, Proteine und Lipide enthalten, sind ihre Anreicherung und Isolierung entscheidende Schritte für ihre Ausnutzung als potenzielle Biomarker für klinische Anwendungen. Herkömmliche Isolationsmethoden (z. B. Ultrazentrifugation) verursachen jedoch signifikante Verluste und Schäden an Mikrovesikeln und Exosomen. Diese Methoden erfordern auch mehrere sich wiederholende Schritte der Ultrazentrifugation, Desagung und Verschwendung von Reagenzien. Dieser Artikel beschreibt eine detaillierte Methode zur Herstellung eines Origami-Papier-basierten Geräts (Exo-PAD), das für die effektive Anreicherung und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen auf einfache Weise entwickelt wurde. Das einzigartige Design des Exo-PAD, bestehend aus akkordeonartigen mehrfaltigen Schichten mit konvergenten Probenbereichen, ist in die Ionenkonzentrationspolarisationstechnik integriert und ermöglicht so eine fünffache Anreicherung der Mikrovesiken und Exosomen auf bestimmte Schichten. Darüber hinaus werden die angereicherten Mikrovesiken und Exosomen durch einfaches Entfalten des Exo-PAD isoliert.

Die Betriebszeit muss optimiert werden, um die maximale Rückgewinnungsausbeute der angereicherten Mikrovesiken und Exosomen zu erreichen. Unzureichende Zeit erlaubt keine ausreichende Migration der Mikrovesiken und Exosomen, was die Anreicherung verringert, während übermäßige Zeit die räumliche Fokussierung verschlechtert und somit die Mikrovesiken und Exosomen dispergiert. So kann durch den Zeitoptimierungsschritt der maximale Präkonzentrationsfaktor von Mikrovesikeln und Exosomen und der endgültige Ort, an dem Mikroves...

Präsentiert wird ein Protokoll zur Herstellung eines papierbasierten Geräts zur effektiven Anreicherung und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen.

Papierbasierte Vorkonzentration und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

In diesem Protokoll beschreiben wir eine einfache Methode zur Herstellung eines papierbasierten Geräts namens XO Pad, das für die effektive Anreicherung in Isolation von extrazellulären Vesikeln entwickelt wurde. Das XO Pad ist ein einfaches Gerät, das extrazelluläre Vesikel ohne den Einsatz von Chemikalien oder Arbeitsmaschinen vorkonzentrieren und isolieren kann, während es höhere Rückgewinnungsraten als herkömmliche Methoden zeigt. Definieren Sie zunächst den Bereich, der mit Druckersoftware gedruckt werden soll.Das Design sollte 12 wachsgemusterte Schichten haben, in denen sich die Durchmesser der kreisförmigen Probenbereiche allmählich von fünf auf zwei Millimeter verengen. Drucken Sie dann hydrophobes Wachs auf die ausgewiesenen Bereiche auf beiden Seiten des Zellulosepapiers. Legen Sie das wachsbedruckte Papier für 80 Sekunden bei 120 Grad Celsius in einen Laborofen und schneiden Sie dann das Wachsgedruckte Papier mit einem Fräser, um einzelne XO Pad-Geräte herzustellen.Lassen Sie eine selektive Permmembran mit fünf und zwei Mikrolitern auf die Probenbereiche in den links- bzw. rechten Schichten fallen. Legen Sie die mit der perm selektiven Membran kodierenden Schichten 30 M

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Papier zeigt Methoden zur Isolierung, Aufreinigung und Detektion von Exosomen, sowie Techniken für die Analyse ihrer molekularen Inhalten. Diese Methoden sind anpassungsfähig für Exosom Isolation von beiden Zellkulturmedien und biologischen Flüssigkeiten, und kann darüber hinaus Analyse molekularer Inhalte auch in funktionellen Studien nützlich sein.

Isolierung und Charakterisierung von RNA-haltigen Exosomen

Diese Protokollinformationen ein Verfahren zur extrazellulären Vesikeln (EVs), kleine membranöse Teilchen aus Zellen freigesetzt zu isolieren, von so wenig wie 10 ul Serumproben. Dieser Ansatz umgeht die Notwendigkeit von Ultrazentrifugation, nur wenige Minuten von Testzeit erfordert und ermöglicht die Isolation von Elektrofahrzeugen aus Proben von begrenzten Mengen.

Auf Papier basierende Vorrichtungen zur Isolierung und Charakterisierung von extrazellulärer Vesikel

Gallenflüssigkeit ist eine wertvolle Quelle für extrazelluläre Vesikel/Exosomen, die potenziell wichtige Biomarker enthalten. Dieses Protokoll stellt eine robuste Methode zur Isolierung von Exosomen aus menschlicher Galle für weitere Analysen, einschließlich miRNA-Profiling, dar.

Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile

Extrazelluläre Vesikel im Blut wurden als neuartige Biomarker für verschiedene Krankheiten vorgeschlagen. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die Isolierung von großen Mikrovesikeln aus Plasmamembranen aus peripheren Blutproben und deren anschließende Analyse mittels konventioneller Durchflusszytometrie und Western Blotting vor.

Isolierung und Charakterisierung von Mikrovesikeln aus peripherem Blut

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll exosomen von Plasma und Serum mit reduzierter CO Reinigung nicht Exosomal Blut zu reinigen. Das optimierte Protokoll beinhaltet Ultrafiltration, Protease Behandlung und Größe Ausgrenzung Chromatographie. Verbesserte Reinigung von exosomen Vorteile nachgeschalteten Analysen, einschließlich genauere Quantifizierung von Vesikeln und Proteomic Charakterisierung.

Proteinverdauung, Ultrafiltration und Größe Ausgrenzung Chromatographie, die Isolation der Exosomen aus menschlichem Blutplasma und Serum zu optimieren

Dies ist ein Protokoll, um Gewebe extrazelluläre Vesikel (EVs) aus der Leber zu isolieren. Das Protokoll beschreibt einen zweistufigen Prozess mit Kollagenaseperfusion, gefolgt von differentialer Ultrazentrifugation, um Lebergewebe-EVs zu isolieren.

Isolierung von Gewebe extrazellulären Vesikeln aus der Leber

Dieses Protokoll isoliert extrazelluläre Vesikel (EVs) von Virionen mit hoher Effizienz und Ausbeute, indem EV-Fällung, Dichtegradient-Ultrazentrifugation und Partikelerfassung integriert werden, um einen optimierten Workflow und eine Reduzierung des Startens zu ermöglichen. Mengenanforderungen, die zu reproduzierbaren Präparaten für den Einsatz in allen EV-Forschungen führen.

Reinigung von hochertragreichen extrazellulären Vesikelpräparaten weg vom Virus

Dieses Protokoll demonstriert, wie die kleinen extrazellulären Vesikel (hUC-MSC-sEVs) von humanen Nabelschnurstammzellen (hUC-MSC-sEVs) mit einer einfachen Laborumgebung isoliert werden können. Die Größenverteilung, Proteinkonzentration, sEVs-Marker und Morphologie isolierter hUC-MSC-sEVs werden durch Nanopartikel-Tracking-Analyse, BCA-Protein-Assay, Western Blot bzw. Transmissionselektronenmikroskop charakterisiert.

Eine einfache Tischfiltrationsmethode zur Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus humanen mesenchymalen Stammzellen

Dieses Protokoll bietet eine schnelle und größenspezifische Isolationsmethode für kleine extrazelluläre Vesikel, indem die Größe der Luftsprühdüse, der Mantelflüssigkeitsdruck, der Probenflussdruck, die Spannung, die Verstärkung und die Auslöseschwellenparameter optimiert werden.

Optimierung der durchflusszytometrischen Sortierparameter für die Hochdurchsatzisolierung und Aufreinigung kleiner extrazellulärer Vesikel

Extrazelluläre Vesikel sind für biomedizinische Anwendungen sehr vielversprechend, aber die derzeitigen Isolierungsmethoden sind zeitaufwändig und für den klinischen Einsatz unpraktisch. In dieser Studie stellen wir ein mikrofluidisches Gerät vor, das die direkte Isolierung extrazellulärer Vesikel aus großen Mengen von Bioflüssigkeiten in einer kontinuierlichen Weise mit minimalen Schritten ermöglicht.

Einstufige Isolierung extrazellulärer Vesikel aus großvolumigen Proben mit einem gegabelten mikrofluidischen A4F-Gerät

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Mausskelettmuskeln und Knochenmark mittels enzymatischer Verdauung und Größenausschlusschromatographie, wodurch reproproduzierbare Rückgewinnung von vesikelangereicherten Fraktionen aus strukturell komplexen, leistungsarmen Geweben für die nachgelagerte molekulare Analyse ermöglicht wird.

Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Mausskelettmuskulatur und Knochenmark mittels Größenausschlusschromatographie

Erfahren Sie die papierbasierte Vorkonzentration und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen mit dem XO Pad. Diese chemiefreie Methode zeigt höhere Wiederfindungsraten als konventionelle Verfahren und vereinfacht die Erforschung extrazellulärer Vesikel erheblich.

Papierbasierte Vorkonzentration und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen

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