Papierbasierte Vorkonzentration und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen
29. April 2020
Präsentiert wird ein Protokoll zur Herstellung eines papierbasierten Geräts zur effektiven Anreicherung und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen.
In diesem Protokoll beschreiben wir eine einfache Methode zur Herstellung eines papierbasierten Geräts namens XO Pad, das für die effektive Anreicherung in Isolation von extrazellulären Vesikeln entwickelt wurde. Das XO Pad ist ein einfaches Gerät, das extrazelluläre Vesikel ohne den Einsatz von Chemikalien oder Arbeitsmaschinen vorkonzentrieren und isolieren kann, während es höhere Rückgewinnungsraten als herkömmliche Methoden zeigt. Definieren Sie zunächst den Bereich, der mit Druckersoftware gedruckt werden soll.
Das Design sollte 12 wachsgemusterte Schichten haben, in denen sich die Durchmesser der kreisförmigen Probenbereiche allmählich von fünf auf zwei Millimeter verengen. Drucken Sie dann hydrophobes Wachs auf die ausgewiesenen Bereiche auf beiden Seiten des Zellulosepapiers. Legen Sie das wachsbedruckte Papier für 80 Sekunden bei 120 Grad Celsius in einen Laborofen und schneiden Sie dann das Wachsgedruckte Papier mit einem Fräser, um einzelne XO Pad-Geräte herzustellen.
Lassen Sie eine selektive Permmembran mit fünf und zwei Mikrolitern auf die Probenbereiche in den links- bzw. rechten Schichten fallen. Legen Sie die mit der perm selektiven Membran kodierenden Schichten 30 Minuten lang bei 70 Grad Celsius auf einer Kochplatte, um das Lösungsmittel zu verdampfen. Versiegeln Sie dann die äußerste Oberfläche der beschichteten Schicht mit Blick auf die Pufferlösung mit druckempfindlichem Klebeband und hinterlassen Sie ein kleines Loch.
Falten Sie das XO Pad Gerät entlang der weißen Linien hin und her, um alle Probenbereiche konvergieren danieren danieren zu können. 15 Mikroliter der Mikrovesikund- und Exosomenprobe in den konvergenten Probenbereichen pipette und einige Sekunden warten, um eine vollständige Benetzung zu gewährleisten. Legen Sie zwei Acrylkammern an beiden Enden des XO Pads und klemmen Sie es sicher mit kleinen Bindemittelclips, um eine Entfaltung zu verhindern.
Füllen Sie die Kammern mit 110 Mikroliter0,1X PBS und setzen Sie zwei Silberelektroden ein. Verwenden Sie dann ein Stromspannungsquellenmesssystem, um 30 Volt für 20 Minuten auf die Elektroden aufzutragen. Um die angereicherten Mikrovesiken und Exosomen zu isolieren, trennen Sie das gefaltete XO Pad von den Acrylkammern und entfalten Sie das Gerät, um die angereicherten Partikel von den anderen Schichten zu isolieren.
Punch out die Probenbereiche in den Schichten acht und neun, wo die Mikrovesiken und Exosomen für die nachgelagerte Analyse angereichert werden. Um die Betriebszeit für eine maximale Rückgewinnung der angereicherten Partikel zu optimieren, wurde ein Zeitraffer-Migrationstest von fluoreszierend markierten Mikrovesikeln und Exosomen durchgeführt. Die Fluoreszenzintensitäten in allen Probenbereichen wurden mit der ImageJ-Software quantifiziert.
Vor dem Anreicherungsprozess wurden Mikrovesiken und Exosomen in allen Probenbereichen mit einer allmählichen Abnahme der Intensität dispergiert. Nach 10 Minuten Verarbeitung migrierten die Partikel elektrokinetisch und ein sofortiger Vorkonzentrationsstecker erschien auf Schicht sieben. Als die Zeit 20 Minuten erreichte, konzentrierten sich Mikrovesiken und Exosomen stark auf die Schichten acht und neun und wurden auf der Grundlage der Fluoreszenzintensitäten um das Fünffache angereichert.
Die Integrität der angereicherten Mikrovesikle und Exosomen in Schicht 8 wurde mit SEM untersucht. Deutlich mehr nicht geschädigte Partikel wurden nach dem Anreicherungsprozess beobachtet. Die Größenverteilung der angereicherten Mikrovesiken und Exosomen wurde ebenfalls analysiert.
Anschließend wurde die tatsächliche Konzentration der angereicherten Mikrovesikeln und Exosomen auf den Probenbereichen in den Schichten sechs, acht und 10 analysiert. In Schicht acht wurden die Mikrovesiken und Exosomen um den Faktor 5,58 vorkonzentriert, in den anderen Schichten wurde jedoch keine spürbare Vorkonzentration beobachtet. Um die Reproduzierbarkeit dieses Verfahrens zu gewährleisten, befolgten Sie genau das Protokoll für Ofeninkubationszeit und -temperatur während der Geräteüberprüfung und Der Gerätebetriebszeit, da dies die optimierten Bedingungen sind.
Das XO Pad kann auch verwendet werden, um extrazelluläre Vesikel von proteinreichen Proben wie Serum oder Plasma zu trennen und zu isolieren, indem Carbonatpuffer verwendet werden. Dieses Protokoll kann ein effizientes, einfaches Vorbereitungswerkzeug mit seinen vorkonzentrierenden und isolierenden Fähigkeiten bieten, die für die klinische Forschung erforderlich sind, wie Diagnose, Arzneimittelabgabe, Immuntherapie und andere Therapeutika.
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Übersicht
In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Herstellung eines papierbasierten Geräts namens XO Pad vorgestellt, das zur effektiven Anreicherung und Isolierung extrazellulärer Vesikel konzipiert ist. Der XO Pad ermöglicht eine Voranreicherung und Isolierung ohne Verwendung von Chemikalien oder Geräten und weist höhere Rückgewinnungsraten als herkömmliche Methoden auf.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biotechnologie
- Extrazelluläre Vesikel
Hintergrund
- Extrazelluläre Vesikel spielen eine entscheidende Rolle bei der Zellkommunikation.
- Konventionelle Methoden zur Isolierung dieser Vesikel beinhalten häufig komplexe Verfahren.
- Der XO Pad bietet eine einfachere Alternative für Forschende.
- Höhere Gewinnungsraten können die Untersuchung extrazellulärer Vesikel verbessern.
Zweck der Studie
- Eine einfache Methode zur Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen bereitzustellen.
- Die Ausbeute im Vergleich zu bestehenden Techniken zu verbessern.
- Die Forschung in der Biologie extrazellulärer Vesikel zu erleichtern.
Verwendete Methoden
- Konstruktion des XO-Pads mit 12 wachsgestalteten Schichten.
- Bedrucken von Cellulosepapier mit hydrophobem Wachs.
- Erhitzen des bedruckten Papiers in einem Laborofen.
- Zuschneiden des mit Wachs bedruckten Papiers zu einzelnen XO-Pad-Geräten.
Hauptergebnisse
- Das XO-Pad bereichert und isoliert extrazelluläre Vesikel effektiv.
- Zeigte höhere Rückgewinnungsraten als herkömmliche Methoden.
- Einfacher Herstellungsprozess ohne Verwendung von Chemikalien.
- Besteht Potenzial für eine breite Anwendung in der Forschung.
Schlussfolgerungen
- Das XO-Pad ist ein wertvolles Werkzeug für Forscher, die extrazelluläre Vesikel untersuchen.
- Es vereinfacht den Isolationsprozess und verbessert gleichzeitig die Effizienz.
- Diese Methode kann das Verständnis der Funktionen extrazellulärer Vesikel voranbringen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Isolierung extrazellulärer Vesikel stellt aufgrund geringer Ausbeute und Probenschädigung durch konventionelle Methoden weiterhin eine Engstelle bei der Biomarker-Entdeckung dar. Der auf Papier basierende Exo-PAD ermöglicht eine chemikalienfreie, fünffache Anreicherung von Mikrovesikeln und Exosomen und verbessert so die Rückgewinnung, während die Integrität der Vesikel erhalten bleibt. Dies unterstützt die Validierung von Zielstrukturen im Frühstadium und die Assay-Entwicklung, indem ein skalierbarer und reproduzierbarer Workflow für nachgeschaltete Omics- und Funktionsanalysen bereitgestellt wird.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Analyse angereicherten Vesikel-Inhalts.
- Operationaler Wert: Verringert im Vergleich zur Ultrazentrifugation Probenvolumenverlust und -schädigung und erhöht somit die Menge nutzbarer Materialien für die Entschärfung von Zielrisiken.
- Prädiktiver Wert: Eine fünffache Anreicherung verbessert die Signaldetektion bei Biomarkern mit geringer Häufigkeit und unterstützt Entscheidungen zur Priorisierung von Portfolio-Projekten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte, konzentrierte Vesikelpräparationen, die für die Assay-Standardisierung geeignet sind.
- Operativer Wert: Macht Zentrifugen und Chemikalien überflüssig, vereinfacht den Arbeitsablauf und reduziert die betriebliche Komplexität.
- Skalierbarkeit: Das auf Papier basierende Design ermöglicht die parallele Verarbeitung und die Wiederverwendung der Plattform für verschiedene Probentypen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationaler Zusammenhang: Angereicherte Vesikel behalten ihre Integrität für funktionelle Nachweismethoden und Biomarker-Profilierungen in nachfolgenden Analysen bei.
- Krankheitsrelevante Systeme: Kompatibel mit Körperflüssigkeiten wie Serum oder Plasma, wenn Carbonatpuffer verwendet wird, was die klinische Relevanz unterstützt.
- Mechanistische Risikominderung: Eine zuverlässige Isolierung ermöglicht eine konsistente Bewertung vesikelvermittelter Mechanismen in präklinischen Modellen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Exo-PAD fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung bis zur Identifizierung von Leitstrukturen ein und ermöglicht eine zuverlässige Vesikelpräparation für analytische und funktionelle nachgeschaltete Anwendungen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung, indem intakte Vesikel für die Analyse von Frachtinhalten und Signalwegen bereitgestellt werden.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Ergebnisse, die für die Bereitschaft von Assays und für Screening-Kampagnen von Wirkstoffen unerlässlich sind.
- Analytik: Ermöglicht fluoreszenzbasierte Quantifizierung und Analyse der Größenverteilung zur Bewertung unter vergleichenden Bedingungen.
- Translationale Forschung: Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch Erhaltung der Vesikelstruktur und -funktion.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Einfache Herstellung und Handhabung ermöglichen die Einführung als wiederverwendbares Plattformsystem über Teams und Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Zuverlässigkeit der Zielvalidierung durch höhere Ausbeute und die Isolierung intakter Vesikel.
- Operativer Wert: Standardisiert den Anreicherungsprozess, reduziert den Reagenzienverbrauch und eliminiert die Abhängigkeit von spezieller Ausrüstung.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen, indem falsch-negative Ergebnisse bei der Biomarker-Detektion verringert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Weiterentwicklung durch zuverlässige und skalierbare Vesikelpräparation für diagnostische und therapeutische Anwendungen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Wachsmusterung und den Prinzipien der Ionenkonzentrationspolarisation für die Herstellung der Vorrichtung.
- Benötigt Zugang zu Laborofen, Heizplatte, Schneidegerät und Spannungsquelle für den Betrieb.
- Erfordert die Standardisierung von Probenmenge, Pufferzusammensetzung und Bearbeitungszeit zwischen verschiedenen Anwendern.
- Die Anpassung an viskose Bioprotektionsflüssigkeiten könnte eine Optimierung des Puffers erfordern, beispielsweise hinsichtlich der Verträglichkeit mit Carbonatserum/Plasma.
- Praktische Einschränkung: Die Anreicherung ist schichtspezifisch (Schichten 8–9), was ein präzises Abschneiden für die nachfolgende Analyse notwendig macht.
