Papierbasierte Vorkonzentration und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen
29. April 2020
Präsentiert wird ein Protokoll zur Herstellung eines papierbasierten Geräts zur effektiven Anreicherung und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen.
In diesem Protokoll beschreiben wir eine einfache Methode zur Herstellung eines papierbasierten Geräts namens XO Pad, das für die effektive Anreicherung in Isolation von extrazellulären Vesikeln entwickelt wurde. Das XO Pad ist ein einfaches Gerät, das extrazelluläre Vesikel ohne den Einsatz von Chemikalien oder Arbeitsmaschinen vorkonzentrieren und isolieren kann, während es höhere Rückgewinnungsraten als herkömmliche Methoden zeigt. Definieren Sie zunächst den Bereich, der mit Druckersoftware gedruckt werden soll.
Das Design sollte 12 wachsgemusterte Schichten haben, in denen sich die Durchmesser der kreisförmigen Probenbereiche allmählich von fünf auf zwei Millimeter verengen. Drucken Sie dann hydrophobes Wachs auf die ausgewiesenen Bereiche auf beiden Seiten des Zellulosepapiers. Legen Sie das wachsbedruckte Papier für 80 Sekunden bei 120 Grad Celsius in einen Laborofen und schneiden Sie dann das Wachsgedruckte Papier mit einem Fräser, um einzelne XO Pad-Geräte herzustellen.
Lassen Sie eine selektive Permmembran mit fünf und zwei Mikrolitern auf die Probenbereiche in den links- bzw. rechten Schichten fallen. Legen Sie die mit der perm selektiven Membran kodierenden Schichten 30 Minuten lang bei 70 Grad Celsius auf einer Kochplatte, um das Lösungsmittel zu verdampfen. Versiegeln Sie dann die äußerste Oberfläche der beschichteten Schicht mit Blick auf die Pufferlösung mit druckempfindlichem Klebeband und hinterlassen Sie ein kleines Loch.
Falten Sie das XO Pad Gerät entlang der weißen Linien hin und her, um alle Probenbereiche konvergieren danieren danieren zu können. 15 Mikroliter der Mikrovesikund- und Exosomenprobe in den konvergenten Probenbereichen pipette und einige Sekunden warten, um eine vollständige Benetzung zu gewährleisten. Legen Sie zwei Acrylkammern an beiden Enden des XO Pads und klemmen Sie es sicher mit kleinen Bindemittelclips, um eine Entfaltung zu verhindern.
Füllen Sie die Kammern mit 110 Mikroliter0,1X PBS und setzen Sie zwei Silberelektroden ein. Verwenden Sie dann ein Stromspannungsquellenmesssystem, um 30 Volt für 20 Minuten auf die Elektroden aufzutragen. Um die angereicherten Mikrovesiken und Exosomen zu isolieren, trennen Sie das gefaltete XO Pad von den Acrylkammern und entfalten Sie das Gerät, um die angereicherten Partikel von den anderen Schichten zu isolieren.
Punch out die Probenbereiche in den Schichten acht und neun, wo die Mikrovesiken und Exosomen für die nachgelagerte Analyse angereichert werden. Um die Betriebszeit für eine maximale Rückgewinnung der angereicherten Partikel zu optimieren, wurde ein Zeitraffer-Migrationstest von fluoreszierend markierten Mikrovesikeln und Exosomen durchgeführt. Die Fluoreszenzintensitäten in allen Probenbereichen wurden mit der ImageJ-Software quantifiziert.
Vor dem Anreicherungsprozess wurden Mikrovesiken und Exosomen in allen Probenbereichen mit einer allmählichen Abnahme der Intensität dispergiert. Nach 10 Minuten Verarbeitung migrierten die Partikel elektrokinetisch und ein sofortiger Vorkonzentrationsstecker erschien auf Schicht sieben. Als die Zeit 20 Minuten erreichte, konzentrierten sich Mikrovesiken und Exosomen stark auf die Schichten acht und neun und wurden auf der Grundlage der Fluoreszenzintensitäten um das Fünffache angereichert.
Die Integrität der angereicherten Mikrovesikle und Exosomen in Schicht 8 wurde mit SEM untersucht. Deutlich mehr nicht geschädigte Partikel wurden nach dem Anreicherungsprozess beobachtet. Die Größenverteilung der angereicherten Mikrovesiken und Exosomen wurde ebenfalls analysiert.
Anschließend wurde die tatsächliche Konzentration der angereicherten Mikrovesikeln und Exosomen auf den Probenbereichen in den Schichten sechs, acht und 10 analysiert. In Schicht acht wurden die Mikrovesiken und Exosomen um den Faktor 5,58 vorkonzentriert, in den anderen Schichten wurde jedoch keine spürbare Vorkonzentration beobachtet. Um die Reproduzierbarkeit dieses Verfahrens zu gewährleisten, befolgten Sie genau das Protokoll für Ofeninkubationszeit und -temperatur während der Geräteüberprüfung und Der Gerätebetriebszeit, da dies die optimierten Bedingungen sind.
Das XO Pad kann auch verwendet werden, um extrazelluläre Vesikel von proteinreichen Proben wie Serum oder Plasma zu trennen und zu isolieren, indem Carbonatpuffer verwendet werden. Dieses Protokoll kann ein effizientes, einfaches Vorbereitungswerkzeug mit seinen vorkonzentrierenden und isolierenden Fähigkeiten bieten, die für die klinische Forschung erforderlich sind, wie Diagnose, Arzneimittelabgabe, Immuntherapie und andere Therapeutika.
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Übersicht
Dieser Artikel präsentiert ein Protokoll zur Herstellung eines papierbasierten Geräts namens XO Pad, das für die effektive Anreicherung und Isolierung von extrazellulären Vesikeln entwickelt wurde. Das XO Pad ermöglicht eine Vorkonzentration und Isolierung ohne den Einsatz von Chemikalien oder Maschinen und zeigt dabei höhere Rückgewinnungsraten als herkömmliche Methoden.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Biotechnologie
- Extrazelluläre Vesikel
Hintergrund
- Extrazelluläre Vesikel spielen eine entscheidende Rolle in der Zellkommunikation.
- Herkömmliche Methoden zur Isolierung dieser Vesikel beinhalten oft komplexe Verfahren.
- Das XO Pad bietet eine einfachere Alternative für Forscher.
- Höhere Rückgewinnungsraten können die Untersuchung von extrazellulären Vesikeln verbessern.
Zweck der Studie
- Eine unkomplizierte Methode zur Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen bereitzustellen.
- Die Rückgewinnungsraten im Vergleich zu bestehenden Techniken zu verbessern.
- Die Forschung in der Biologie der extrazellulären Vesikel zu erleichtern.
Verwendete Methoden
- Entwurf des XO Pads mit 12 Wachsmuster-Schichten.
- Druck von hydrophobem Wachs auf Zellulosepapier.
- Erhitzen des bedruckten Papiers in einem Laborofen.
- Zuschneiden des wachsbedruckten Papiers zu einzelnen XO Pad-Geräten.
Hauptergebnisse
- Das XO Pad bereichert und isoliert effektiv extrazelluläre Vesikel.
- Höhere Rückgewinnungsraten als herkömmliche Methoden demonstriert.
- Einfacher Herstellungsprozess ohne den Bedarf an Chemikalien.
- Potenzial für eine breite Anwendung in der Forschung.
Schlussfolgerungen
- Das XO Pad ist ein wertvolles Werkzeug für Forscher, die extrazelluläre Vesikel untersuchen.
- Es vereinfacht den Isolierungsprozess und verbessert gleichzeitig die Effizienz.
- Diese Methode kann das Verständnis der Funktionen extrazellulärer Vesikel vorantreiben.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Isolation of extracellular vesicles remains a bottleneck in biomarker discovery due to low yield and sample damage from conventional methods. The paper-based Exo-PAD enables chemical-free, fivefold enrichment of microvesicles and exosomes, improving recovery while preserving vesicle integrity. This supports early-stage target validation and assay development by providing a scalable, reproducible workflow for downstream omics and functional analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through enriched vesicle cargo analysis.
- Operational Value: Reduces sample loss and damage compared to ultracentrifugation, increasing usable material for target de-risking.
- Predictive Value: Fivefold enrichment improves signal detection in low-abundance biomarkers, supporting portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, concentrated vesicle preparations suitable for assay standardization.
- Operational Value: Eliminates need for centrifuges or chemicals, simplifying workflow and reducing operational complexity.
- Scalability: Paper-based design allows parallel processing and platform reuse across multiple sample types.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enriched vesicles maintain integrity for downstream functional assays and biomarker profiling.
- Disease-Relevant Systems: Compatible with biofluids like serum or plasma when used with carbonate buffer, supporting clinical relevance.
- Mechanistic De-risking: Reliable isolation enables consistent evaluation of vesicle-mediated mechanisms in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The Exo-PAD fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, enabling reliable vesicle preparation for analytical and functional downstream applications.
- Discovery Biology: Supports functional target validation by providing intact vesicles for cargo analysis and pathway interrogation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs essential for assay readiness and compound screening campaigns.
- Analytics: Enables fluorescence-based quantification and size distribution analysis for comparative condition evaluation.
- Translational Research: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation through preserved vesicle structure and function.
- Enterprise Reuse: Simple fabrication and operation allow adoption as a reusable platform across teams and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence through higher recovery and intact vesicle isolation.
- Operational Value: Standardizes enrichment process, reduces reagent waste, and eliminates equipment dependency.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision quality by reducing false negatives in biomarker detection.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement through reliable, scalable vesicle preparation for diagnostic and therapeutic applications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in wax patterning and ion concentration polarization principles for device fabrication.
- Needs access to laboratory oven, hot plate, cutter, and voltage source for operation.
- Demands standardization of sample volume, buffer composition, and processing time across users.
- Adaptation to viscous biofluids may require buffer optimization, such as carbonate serum/plasma compatibility.
- Practical limitation: Enrichment is layer-specific (layers 8–9), requiring precise puning for downstream analysis.
