Native Cell Membrane Nanoparticles System für Membran-Protein-Protein-Interaktionsanalyse

Dieses Protokoll wird Forschern helfen, den nativen oligomeren Zustand von Membranproteinen genauer zu bestimmen, indem es das native Zellmembran-Nanopartikelsystem in Verbindung mit Elektronenmikroskopie verwendet. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie genaue Strukturdaten von Membranproteinen in einer nativen zellmembranähnlichen Umgebung liefert und für zukünftige hochauflösende Strukturbestimmungen verwendet werden kann. Kyle Kroeck, ein Postdoktorand aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen.

Um native Zellmembran-Nanopartikel herzustellen, resuspendieren Sie ein Gramm des Membranpellets von Interesse in 10 Millilitern NCMN-Puffer A. Verwenden Sie einen Dounce-Homogenisator aus Glas, um die resuspendierte Zellmembranprobe bei 20 Grad Celsius zu homogenisieren, und überführen Sie die suspendierte Probe in ein 50-Milliliter-Polypropylenröhrchen. Geben Sie membranaktive Polymer-Stammlösung und zusätzlichen NCMN-Puffer A in die Probe bis zu einer Endkonzentration von 2,5 % membranaktivem Polymer und schütteln Sie die Lösung zwei Stunden lang bei 20 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation wird die Probe ultrazentrifugiert.

Während der Zentrifugation äquilibrieren Sie eine Fünf-Milliliter-Nickel-NTA-Säule mit 25 Millilitern NCMN-Puffer A.At Ende der Zentrifugation, übertragen Sie den Überstand auf die Säule und verwenden Sie eine Spritzenpumpe, die auf eine Durchflussrate von 0,5 Millilitern pro Minute eingestellt ist, um den Überstand bei 20 Grad Celsius auf die Säule zu laden. Waschen Sie die Leitungen der schnellen Proteinflüssigkeitschromatographie-Maschine mit genügend NCMN-Puffer B, um das System vollständig zu spülen und die Säule mit dem Chromatographiegerät zu verbinden. Waschen Sie die Säule mit 30 Millilitern NCMN Buffer B bei einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute und fangen Sie den Durchfluss auf.

Waschen Sie die Säule mit 30 Millilitern NCMN Buffer C bei einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute und fangen Sie den Durchfluss auf. Eluieren Sie das Protein mit 20 Millilitern NCMN-Puffer D bei einer Flussrate von 0,5 Millilitern pro Minute und verwenden Sie einen Fraktionssammler, um Ein-Milliliter-Fraktionen der Probe zu sammeln, und lagern Sie dann die Proteinproben bei vier Grad Celsius mit SDS-PAGE, um die Proben zu überprüfen, die den Peaks entsprechen, die auf dem schnellen Proteinflüssigkeitschromatographie-Elutionsdiagramm beobachtet wurden. Um negative Fleckengitter vorzubereiten, wickeln Sie einen Objektträger mit der Kohleseite nach oben mit Filterpapier ein und legen Sie die Gitter, die für die Probenvorbereitung verwendet werden sollen, auf den Objektträger.

Legen Sie den Objektträger mit den Elektronenmikroskopgittern in die Kammer eines Glimmentladungsträgers zwischen den beiden Elektroden und setzen Sie den Glasdeckel wieder auf, wobei Sie darauf achten, dass der Deckel zentriert und gut abgedichtet ist. Lassen Sie die Glühentladungsmaschine laufen und stellen Sie sicher, dass das vom Plasma erzeugte violette Licht sichtbar ist. Wenn die Maschine fertig läuft, warten Sie, bis die Kammer den atmosphärischen Druck erreicht hat, bevor Sie den Glasdeckel abnehmen und den Objektträger auf die Bank stellen.

Stellen Sie die Konzentration der gereinigten Proteinproben auf etwa 0,1 Milligramm pro Milliliter ein und laden Sie 3,5 Mikroliter der Proteinprobe auf das 10 Nanometer dicke Kohlenstoffgitter. Entfernen Sie nach einer Minute mit einem Stück Filterpapier die Flüssigkeit von der elektronenmikroskopischen Gitteroberfläche und waschen Sie die Gitteroberfläche dreimal mit einem drei Mikroliter Wassertropfen pro Waschgang. Waschen Sie die Gitteroberfläche nach der letzten Wasserwäsche noch zwei weitere Male mit drei Mikrolitern frisch gefiltertem 2%igem Uranacetat pro Waschgang.

Nach der letzten Uranacetat-Wäsche färben Sie das Gitter eine Minute lang mit einem drei Mikroliter tröpfchen, frisch gefiltertem 2%-Uranacetat. Verwenden Sie am Ende der Inkubation ein neues Stück Filterpapier, um das Tröpfchen zu entfernen, und trocknen Sie das Gitter mindestens eine Minute lang an der Luft, bevor Sie das Gitter für die spätere Verwendung in einer Gitterbox aufbewahren. Hier können negative Färbebilder betrachtet werden, die wie gezeigt mit der Transmissionselektronenmikroskopie aufgenommen wurden.

Das negative Färbebild für die mit Detergens gereinigte Wildtyp-Acraflavin-Resistenzkanalprotein-B-Probe zeigt eine homogene Lösung aus monodispergierten Partikeln, wobei das Protein eine gut definierte trimere quartäre Struktur aufweist. Diese trimeren Strukturen entsprechen dem beobachteten Größenausschlusschromatogramm nach der Reinigung. Im Vergleich dazu ist im negativen Färbebild für die ebenfalls mit Detergens gereinigte P223G-Mutante eine heterogene Lösung von polydispergierten Nanopartikeln mit einer Neigung zur Aggregation, aber ohne beobachtbare native Trimere zu beobachten.

Diese Ergebnisse werden auch durch die Größenausschlusschromatographie unterstützt. Ähnliche Ergebnisse wurden für Wildtyp- und mutierte Proteine nach der Aufreinigung mit dem membranaktiven Polymer NCMNP11 beobachtet. Die Verwendung des NCMNP52 Polymers ermöglicht die Erzeugung von nativen Zellmembran-Nanopartikeln in viel größeren Größen, so dass mehrere Acraflavin-Resistenzkanal-Protein-B-Trimere in einem einzigen nativen Zellmembranpartikel abgebildet werden können.

In der mutierten Probe werden jedoch keine Trimerpartikel beobachtet, selbst wenn man sich die großen nativen Zellmembran-Doppelschichtpflaster ansieht. Die SDS-PAGE-Analyse der gereinigten Proteinproben bestätigt das Vorhandensein von Acraflavin-Resistenz B in allen Proben mit einer Reinheit von mehr als 95 % beim vorhergesagten Molekulargewicht des Proteins. Bei der Modifikation dieses Protokolls für andere Proteine ist es wichtig, experimentell die geeignete Menge an Membranfraktion sowie die Länge, Zeit und Temperatur für den Solubilisierungsprozess zu bestimmen.

Wenn die Bilder Ihrer Probe eine homogene Lösung von monodispergierten Partikeln mit genau definierten Struktureinheiten zeigen, kann die Probe für die hochauflösende Strukturbestimmung mit der Kryo-Elektronenmikroskopie verwendet werden.