Name: Messung des Abbaus von Hirnödem nach dem Schlaganfall, Infarktzone und Blut-Hirn-Barrierenabbau in einem einzigen Satz von Nagetier-Gehirnproben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: Erfahren Sie, wie Hirnödem, Infarktzone und Blut-Hirn-Schrankenabbau in Nagetiergehirnen gleichzeitig gemessen werden. Diese modifizierte Arterienokklusionsmethode ermöglicht effiziente Schlaganfallforschung mit nur einer Probe.

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Wir danken Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko und Evgenia Goncharyk von der Abteilung für Physiologie, Fakultät für Biologie, Ökologie und Medizin, Oles Honchar, Dnipro Universität, Dnipro, Ukraine für ihre Unterstützung und hilfreiche Beiträge zu unseren Diskussionen. Die gewonnenen Daten sind Teil der Dissertation von Ruslan Kuts.

Die folgenden Verfahren wurden gemäß den Empfehlungen der Erklärung von Helsinki und Tokio und der Leitlinien für die Verwendung von Versuchstieren der Europäischen Gemeinschaft durchgeführt. Die Experimente wurden auch vom Animal Care Committee an der Ben-Gurion Universität des Negev genehmigt.
1. Vorbereitung von Ratten auf das Experimentelle Verfahren
<ol><li>Wählen Sie erwachsene männliche Sprague-Dawley Ratten ohne unbedenkte Pathologie, die jeweils zwischen 300 und 350 g wiegen.</li>
	<li>Halten Sie alle Ratten bei Raumtemperatur bei 22 °C, mit 12 Stunden licht- und dunkler Zyklen vor dem Experiment.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass Nahrungsmittel und Wasser ad libitum verfügbar sind.</li>
	<li>Führen Sie alle Prozeduren zwischen 6:00 .m und 14:00 uhr .m durch.</li>
</ol>2. Vorbereitung von Ratten auf die Operation
<ol><li>Anästhesisieren Sie die Ratten 30 min mit Isofluran (4% für Induktion und 2% für die Wartung) und 24% Sauerstoff (1,5 l/min).<ol>
<li>Testen Sie das Niveau der Anästhesie bei den Ratten, indem Sie sicherstellen, dass sie keinen Pedalentzugsreflex haben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Setzen Sie den 24-Spur-Katheter in die Schwanzvene ein. HINWEIS: Die Schwänewämt für vasodilatation wird nicht durchgeführt.<ol>
<li>Legen Sie die Ratten auf den Tisch in einer supine Position. Verwenden Sie medizinisches Klebeband, um alle vier Gliedmaßen der Ratten anzubringen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die Sonde zur Temperaturmessung vor der Operation in das Rattenrektum.</li>
	<li>Während des Verfahrens eine Heizplatte pflegen, um eine Körpertemperatur von 37 °C zu unterstützen.</li>
	<li>Fügen Sie Salbe in beiden Augen der Ratte zum Schutz.</li>
	<li>Rasieren Sie den operationsischen Bereich und desinfizieren Sie mit drei Anwendungen von 10% Povidon-Jod gefolgt von 70% Isopropylalkohol.</li>
</ol>3. Rechte Seite mittlere Zerebrale Arterie Okklusion
HINWEIS: MCAO wird durch eine modifizierte Technik durchgeführt, wie zuvor beschrieben16,22,23, mit der Verwendung von Instrumenten beschrieben von McGarry et al.24 und Ulua et al.25.
<ol><li>Sezieren Sie die Haut und oberflächliche Faszien an der ventralen Mittellinie des Halses mit chirurgischer Pinzette und Schere mit gebogenen Klingen.</li>
	<li>Identifizieren Sie das Muskeldreieck, bestehend aus der ICA, der äußeren Halsschlagader (ECA) und der gemeinsamen Halsschlagader (CCA).</li>
	<li>Trennen Sie vorsichtig die richtige CCA und ICA vom Vagusnerv mit Mikrozangen für die Gefäßchirurgie.</li>
	<li>Stellen Sie die richtige CCA und die ICA zur Seite. Blockieren Sie den Blutfluss, der von der CCA zur ICA kommt, entweder mit Mikroclips oder speziellen Tourniquets für die Gefäßchirurgie. Machen Sie einen Schnitt (ca. 1 mm) auf der ICA mit Mikroschere für die Gefäßchirurgie.</li>
	<li>Legen Sie einen Monofilamentkatheter (4-0 Nylon) direkt durch die ICA, ca. 18,5-19 mm vom Bifurkationspunkt des rechten CCA in den Kreis von Willis, bis sie einen leichten Widerstand erreichen, um den MCA26zu verschließen.</li>
	<li>Ligate um die ICA über der Bifurkation von CCA.</li>
	<li>Führen Sie für die scheinbetriebene Steuerungsgruppe ein Einsetzen von Nylongewinde anstelle der Schritte 3.5 und 3.616,22.</li>
	<li>5 ml 0,9% Natriumchlorid durch intraperitoneale Injektion verabreichen.</li>
	<li>Schließen Sie die Wunde durch Naht und bringen Sie die Ratte in einen Erholungsbereich. HINWEIS: Wenige Minuten nach dem Ende der Anästhesie wacht die Ratte auf und bewegt sich selbstständig um den Käfig.</li>
	<li>Bei 23 h nach MCAO 2% Evans blau in Salin (4 ml/kg)23,26 in die Schwanzvene für beide operierten Gruppen über eine Kanüle27injizieren. HINWEIS: Dies wird als Blut -Hirn-Permeability-Tracer verwendet. 60 Minuten zirkulieren lassen.</li>
</ol>4. Bestimmung der Infarktzone
<ol><li>Messen Sie IZ bei 24 h nach MCAO, wie zuvor beschrieben9,15,18,19,26. HINWEIS: Ratten, die mehr als 20% ihres Gewichts verloren haben oder Anfälle oder Hemiplegie entwickelt haben, sind vom Experiment ausgeschlossen.</li>
	<li>Euthanisieren Sie die Ratte, indem Sie das inspirierte Gasgemisch durch 20% Sauerstoff und 80% Kohlendioxid ersetzen, bis die Ratte aufhört, spontan zu atmen.</li>
	<li>Öffnen Sie die Brust mit einem 5-6 cm seitlichen Schnitt durch die Bauchwand unter dem Rippenkäfig mit Schere und chirurgischen Zangen.</li>
	<li>Führen Sie einen Zwerchfellschnitt entlang der gesamten Länge des Rippenkäfigs mit Schere und chirurgischen Zangen durch.</li>
	<li>Sorgfältige Verdrängung der Lunge, durch schneiden Sie durch den Rippenkäfig bis zum Schlüsselbein auf der rechten und linken Seite28.</li>
	<li>Durchdieseln Sie mit 200 ml normaler Saline durch die linke Herzkammer.</li>
	<li>Punktieren oder Incise das rechte Vorhof des Herzens mit der Schere.</li>
	<li>Enthauptung mit einer Guillotine durchführen und Hirngewebe sammeln.</li>
	<li>Mit Irisschere, von der Foramen magnum bis zum distalen Rand der hinteren Schädeloberfläche auf beiden Seiten geschnitten.</li>
	<li>Trennen Sie die Riechbirnen, nervöse Verbindungen entlang der ventralen Oberfläche und dorsale Oberfläche des Schädels vom Gehirn.</li>
	<li>Entfernen Sie das Gehirn aus dem Kopf.</li>
	<li>Produzieren Sie 6 Gehirnscheiben, indem Sie 2 mm dicke horizontale Abschnitte mit einem .009" Edelstahl, unbeschichtet, einrandige Rasierklinge.</li>
	<li>30 min bei 37 °C in 0,05% TTC inkubieren.</li>
	<li>Legen Sie das Hirngewebe auf die Mikroskopdias und führen Sie ein optisches Scannen dieser 6 Gehirnscheiben mit einer Auflösung von 1600x1600 dpi durch (siehe z. B. Beilage 1).</li>
	<li>Fügen Sie einen blauen Filter mit einem Fotoeditor (z. B. Adobe Photoshop CS2) mit der Kanalmixer-Funktion (Bild &gt; Anpassungen &gt; Kanalmixer)hinzu und speichern Sie das Bild als JPEG-Dateiformat. HINWEIS: Nach dem Anwenden des blauen Filters wird das Bild grauskaliert angezeigt.</li>
	<li>Öffnen Sie das gespeicherte Bild in ImageJ 1.37v29,30. HINWEIS: Dieses Computerprogramm verwendet eine Schwellenwertfunktion, um die Pixel zu isolieren und zu berechnen, die entweder schwarz oder weiß sind (siehe Abbildung 1).</li>
	<li>Wählen Sie für jede der 6 Gehirnscheiben des Bildes jede Hemisphäre (rechtsverletzte ipsilaterale und unverletzte Kontralaterale) als separate Bilddatei mit dem Werkzeug "Polygonauswahl" aus dem Hauptmenü aus und speichern Sie sie.</li>
	<li>Legen Sie den Cut-off für die Bestimmung von IZ fest, indem Sie eine automatische Schwellenwertfunktion aus dem Hauptmenü der ImageJ-Software verwenden, indem Sie Bild &gt; Anpassen &gt; Schwellenwertauswählen und die Anzahl der Pixel in jeder Hemisphäre eines einzelnen Gehirnsatzes messen. HINWEIS: Makros können für diesen Schritt in der ImageJ-Software verwendet werden (siehe Ergänzung 2 für den Code). Der Cut-off ist ein kritischer Parameter, um zu bestimmen, welche Pixel in Weiß konvertiert werden sollen und welche je nach Grautoninton in Schwarz konvertiert werden sollen (siehe Ergänzung 3 und Ergänzung 4 als Beispiele). ImageJ vergleicht dann weiße und schwarze Pixel, um IZ zu bestimmen. Basierend auf den Färbeprotokollen und Scannereinstellungen haben wir einen konstanten Cut-off-Wert von 0,220 verwendet.</li>
	<li>Führen Sie die Messung der IZ-Korrektur für Gewebeschwellungen mit den Verhältnissen der Ipsilateralen und Contralateralen Zerebralpwarten (RICH) Methode13,23 (siehe Beispiel in Supplement 5). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61309/61309equ01.jpg"> HINWEIS: Die Infarktgröße wird als Prozentsatz der kontralateralen Hemisphäre bewertet.</li>
</ol>5. Bestimmung von Hirnödem31
HINWEIS: Verwenden Sie ImageJ 1.37v für die Messung von BE32,33.
<ol><li>Messen Sie BE 24 h nach MCAO. Verwenden Sie für die Berechnung von BE die Daten aus dem volumen der linken und rechten Halbkugel (in Einheiten).</li>
	<li>Führen Sie optisches Scannen mit einer Auflösung von 1600x1600 dpi durch (siehe z. B. Beilage 1).</li>
	<li>Wählen Sie Gehirnhälften aus und setzen Sie den Cut-off zur Bestimmung von BE mit ImageJ 1.37v, wie oben in den Abschnitten 4.17-4.19 beschrieben.</li>
	<li>Geben Sie den BE-Bereich als Prozentsatz der Standardbereiche der nicht betroffenen kontralateralen Hemisphäre aus, berechnet nach der RICH-Methode unter Verwendung der folgenden Gleichung (siehe Beispiel in Beilage 5)23,34. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61309/61309equ02v2.jpg"> HINWEIS: Die Ausdehnung von BE wird als Prozentsatz der kontralateralen Hemisphäre bewertet.</li>
</ol>6. Bestimmung der BBB-Störung
<ol><li>Messen Sie BBB-Störung 24 h nach MCAO.</li>
	<li>Teilen Sie die rechte und linke Hemisphäre in sechs Scheiben und legen Sie jede in ein Mikrozentrifugenrohr.</li>
	<li>Homogenisieren Sie jede Scheibe des Hirngewebes in Trichloressigsäure, basierend auf der Berechnung von 1 g Hirngewebe in 4 ml 50% Trichloressigsäure.</li>
	<li>Zentrifuge bei 10.000 x g für 20 min.</li>
	<li>Verdünnt überstandflüssigkeit 1:3 mit 96% Ethanol.</li>
	<li>Durchführen von Lumineszenzspektrophotometrie durch den Einsatz von Spektrophotometrie-Software, die Installation der Platte und die Durchführung eines Probenmesswerts unter Verwendung der folgenden Parameter: Fluoreszenzintensitäts-Anregungswellenlänge von 620 nm (Bandbreite 10 nm) und eine Emissionswellenlänge von 680 nm (Bandbreite 10 nm)23,35 ; Mod-Top; Nummer Fleisch 25; Handbuch 100; Schütteln 1 Sek., 1 mm. HINWEIS: Verwenden Sie eine Anregungswellenlänge von 620 nm (Bandbreite 10 nm) und eine Emissionswellenlänge von 680 nm (Bandbreite 10 nm). 23,35
</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das Hauptziel des vorliegenden Protokolls bestand darin, konsistente Messungen von drei Hauptparametern ischämischer Verletzungen zu demonstrieren: IZ, BE und BBB-Permeabilität. Frühere Studien in diesem Bereich haben die Möglichkeit gezeigt, einen oder zwei dieser Parameter zusammen in derselben Stichprobe durchzuführen. Neben der Kostensenkung, die diese dreiteilige Methode bietet, bietet sie auch ein wünschenswerteres bioethisches Modell, das die Anzahl der Tiere begrenzt, die operiert und anschließend eingeschläfert ...

Eine der häufigsten Ursachen für Morbidität und Sterblichkeit weltweit ist Schlaganfall. Weltweit macht ischämischer Schlaganfall 68% aller Schlaganfallfälle aus, während in den Vereinigten Staaten ischämischer Schlaganfall 87% der Schlaganfallfälle1,2ausmacht. Es wird geschätzt, dass die wirtschaftliche Belastung durch Schlaganfall in den Vereinigten Staaten34 Milliarden Dollar 2 und 45 Milliarden Euro in der Europäischen Union3erreicht. Tiermodelle des Schlaganfalls sind notwendig, um seine Pathophysiologie zu studieren, neue Methoden für die Bewertung zu entwickeln und neue therapeutische Optionen vorzuschlagen4.
Ischämischer Schlaganfall tritt mit Okklusion einer großen Zerebralparese auf, in der Regel die mittlere Hirnarterie oder einer seiner Zweige5. So haben Modelle des ischämischen Schlaganfalls historisch gesehen mittlere Zerebrale Arterienverschluss (MCAO)6,7,8,9,10,11,12. Nach MCAO wird eine neurologische Verletzung am häufigsten durch Messung der Infarktzone (IZ) mit einer 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Färbemethode13, Hirnödem (BE) mit Trocknung oder Berechnung hemisphärischer Volumina14,15,16, und Blut-Hirn-Schranke (BBB) Permeabilität durch eine Spektrometrie-Technik mit Evans blaue Färbung17,18,19.
Die traditionelle MCAO-Methode verwendet separate Sätze von Gehirnen für jede der drei Gehirnmessungen. Bei einem großen Stichprobenumfang führt dies zu einer erheblichen Anzahl eingeschläferter Tiere mit zusätzlichen ethischen und finanziellen Erwägungen. Eine alternative Methode zur Verringerung dieser Kosten würde Messungen aller drei Parameter in einem einzigen Satz von Post-MCAO Nagetiergehirnen beinhalten.
Frühere Versuche wurden unternommen, um Kombinationen von Parametern in derselben Gehirnprobe zu messen. Die gleichzeitigen immunfluoreszierenden Färbemethoden20 sowie andere molekulare und biochemische Analysen21 wurden nach TTC-Färbung in derselben Hirnprobe beschrieben. Wir haben zuvor Gehirnhälften berechnet, um Hirnödeme zu bewerten, und TTC-Färbung durchgeführt, um die Infarktzone im selben Gehirnsatz15zu berechnen.
Im vorliegenden Protokoll stellen wir eine modifizierte MCAO-Technik vor, die ischämische Hirnverletzungen misst, indem sie die Durchlässigkeit von IZ, BE und BBB in denselben Nagetierhirnen ermittelt. IZ wird durch TTC-Färbung gemessen, BE wird durch Berechnung des hemisphärischen Volumens bestimmt und BBB-Permeabilität wird durch Spektrometriemethoden19ermittelt. In diesem Protokoll verwendeten wir ein modifiziertes MCAO-Modell, das auf der direkten Insertion und Fixierung des Monofilamentkatheters in die innere Halsschlagader (ICA) und der weiteren Blockierung des Blutflusses zur mittleren Hirnarterie (MCA)22basiert. Diese modifizierte Methode zeigt eine verringerte Sterblichkeits- und Morbiditätsrate im Vergleich zur traditionellen MCAO-Methode16,22.
Dieser neue Ansatz bietet ein finanziell solides und ethisches Modell zur Messung neurologischer Verletzungen nach MCAO. Diese Bewertung der wichtigsten Parameter der ischämischen Hirnverletzung wird dazu beitragen, seine Pathophysiologie umfassend zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>2 mL Spritze</td><td>Braun</td><td>4606027V</td><td></td></tr><tr><td>2% Chlorhexidin in 70% Alkohol Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>500 cc</td><td>Bietet eine allgemeine Antisepsis der Haut im Operationsfeld</td></tr><tr><td>27 G Nadel mit Spritze</td><td>Braun</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>3-0 Seidennähte</td><td>Henry Schein</td><td>1007842</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Nylonnaht</td><td>4-00</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gehirn & Gewebematrizen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15013</td><td></td></tr><tr><td>Kanüle Venflon 22 G</td><td>KD-FIX</td><td></td><td></td></tr> 183603985447 <tr><td>Zentrifuge Sigma 2-16P</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Sigma 2-16P</td><td></td></tr><tr><td>Kompakt-Analysenwaagen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HR-AZ/HR-A</td><td></td></tr><tr><td>Digitale Waage</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Rs 4.000</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschere</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z265969</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Pipette</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z683884</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tube</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EP0030119460</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzdetektor</td><td>Tecan, M&auml; nnedorf Schweiz</td><td>Modell: Infinite 200 PRO Multimode-Lesegerät</td><td>Optional.</td></tr><tr><td>Fluoreszenzdetektor</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>VWR Kat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Basisinstrument</td><td>Optional.</td></tr><tr><td>Mullschwämme</td><td>Fisher</td><td>22-362-178</td><td></td></tr><tr><td>Heizung mit Thermometer</td><td>Heatingpad-1</td><td>Modell: HEATINGPAD-1/2</td><td></td></tr><tr><td>Hämostatische Mikroclips</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horizon-XL</td><td>Mennen Medical Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infusionsmanschette</td><td>ABN</td><td>IC-500</td><td></td></tr><tr><td>Mikropinzette</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroschere</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiset</td><td>Teva Medical</td><td>998702</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX 40</td><td>Mikroskop Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Operationszange</td><td>Sigma-Aldrich Operationsschere Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optischer Scanner</td><td>Canon</td><td>Cano Scan 4200F</td><td>Auflösung 3200 x 6400 dpi</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5606</td><td></td></tr><tr><td>Purina Chow</td><td>Purina</td><td>5001</td><td>Nagetier-Laborfutter für Ratten, Mäuse und Hamster ist eine Lebenszyklusnahrung, die seit über 5 Jahrzehnten in der biomedizinischen Forschung eingesetzt wird. In diesem Experiment Ratten ad libitum zur Verfügung gestellt.</td></tr><tr><td>Rattenkäfige</td><td>Techniplast</td><td>2000P</td><td>Konventionelles Gehäuse für Nagetiere. Käfige wurden während des gesamten Experiments zur Unterbringung von Ratten verwendet</td></tr><tr><td>Skalpellklingen #11</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2771</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS2 für Windows</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 1.37v</td><td>NIH</td><td></td><td>Der Quellcode ist frei verfügbar. Der Autor, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), ist an der Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA</td></tr><tr><td>SPSS Statistics 22</td><td>IBM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Office 365 ProPlus</td><td></td> <td>Microsoft-Microsoft</td> <td>Office Excel</td></tr><tr><td>Windows 10</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>298-96-4</td><td></td></tr><tr><td>50% Trichloressigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96 %</td><td>Romisch</td><td></td><td>Entzündliche Flüssigkeit</td></tr><tr><td>Evans Blau 2%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>314-13-6</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran, USP 100%</td><td>Piramamal Critical Care, Inc</td><td>NDC 66794-017</td><td></td></tr></tbody></table>

messung des abbaus von hirnödem nach dem schlaganfall, infarktzone und blut-hirn-barrierenabbau in einem einzigen satz von nagetier-gehirnproben

Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

Eine der häufigsten Ursachen für Morbidität und Mortalität weltweit ist ischämischer Schlaganfall. Historisch gesehen beinhaltet ein Tiermodell, das zur Stimulierung des ischämischen Schlaganfalls verwendet wird, die mittlere Hirnarterienverschluss (MCAO). Infarktzone, Hirnödem und Blut-Hirn-Schranke (BBB) Abbau werden als Parameter gemessen, die das Ausmaß der Hirnverletzung nach MCAO widerspiegeln. Eine wesentliche Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass diese Messungen normalerweise in verschiedenen Hirnproben von Ratten durchgeführt werden, was aufgrund der großen Anzahl von Ratten, die für eine angemessene Stichprobengröße eingeschläfert werden müssen, zu ethischen und finanziellen Belastungen führt. Hier stellen wir eine Methode zur genauen Beurteilung von Hirnverletzungen nach MCAO vor, indem wir Infarktzonen, Hirnödeme und BBB-Permeabilität in den gleichen Rattengehirnen messen. Diese neuartige Technik bietet eine effizientere Möglichkeit, die Pathophysiologie des Schlaganfalls zu bewerten.

Infarktzonenmessung
Ein t-Test mit unabhängiger Stichprobe ergab, dass 19 Ratten, die dauerhaften MCAO unterzogen wurden, eine signifikante Zunahme des Hirninfarktvolumens im Vergleich zu den 16 scheinbetriebenen Ratten zeigten (MCAO=7,49% ± 3,57 vs. Schein = 0,31% ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p &lt; 0,01 (siehe Abbildung 2A)). Die Daten werden als mittlerer Prozentsatz der kontralateralen Hemisphäre ± SD ausgedrückt.
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Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Technik zur Messung der drei wichtigsten Parameter ischämischer Hirnverletzungen an demselben Satz von Nagetier-Gehirnproben. Die Verwendung von nur einer Hirnprobe ist in Bezug auf ethische und wirtschaftliche Kosten sehr vorteilhaft.

Messung des Abbaus von Hirnödem nach dem Schlaganfall, Infarktzone und Blut-Hirn-Barrierenabbau in einem einzigen Satz von Nagetier-Gehirnproben

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke ...

Im vorliegenden Protokoll stellen wir eine modifizierte Verschlusstechnik der mittleren Hirnarterie vor, die die ischämische Hirnverletzung zur Bestimmung einer Infarktzone, des Hirnödems und der BHS-Permeabilität in derselben Gruppe von Nagetiergehirnen misst. In Bezug auf ethische und wirtschaftliche Kosten besteht der Hauptvorteil dieser Technik darin, dass für alle drei Messungen nur eine Gehirnprobe benötigt wird. Diese Abklärung der Hauptparameter der ischämischen Hirnschädigung wird dazu beitragen, die Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfalls umfassend zu untersuchen.Entfernen Sie zunächst das Rattengehirn und schneiden Sie 2 Millimeter dicke horizontale Abschnitte mit einer 0,009 Zoll großen, unbeschichteten, einschneidigen Rasierklinge aus Edelstahl. Platzieren Sie die Schnitte in 0,005 % TTC und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, platzieren Sie dann das Hirngewebe auf den Objektträgern und führen Sie eine optische Abtastung der sechs Gehirnschnitte mit einer Auflösung von 1600 x 1600 DPI durch. Verwenden Sie ein Bildbearbeitungsprogramm, um den Bildern einen Blaufilter hinzuzufügen.Gehen Sie nach dem Öffnen der Software zu Bild, Anpassungen und Kanalmixer. Wählen Sie Blau als Ausgabekanal aus, aktivieren Sie Monochrom und klicken Sie dann auf OK. Speichern Sie das Bild im JPEG-Dateiformat.Verwenden Sie das Polygonauswahlwerkzeug in ImageJ Version 1.37, um jede Hemisphäre jedes der sechs Gehirnschnitte auszuwählen und als separate Bilddatei zu speichern. Um das Infarktvolumen und das Hirnödem zu berechnen, verwenden Sie ein Makro, um die Pixel im Bild basierend auf einem Schwellenwert in Weiß oder Schwarz umzuwandeln. Schließen Sie dann alle Dateien und verwenden Sie ein zweites Makro, um die Anzahl der weißen und schwarzen Pixel zu vergleichen, um das Infarktvolumen und das Hirnödem zu bestimmen.Kopieren Sie die Rohdaten in eine Tabelle. Bei der Berechnung des Infarktvolumens ist die Schwellung des Gewebes zu korrigieren, indem das Verhältnis der ipsilateralen und kontralateralen Gehirnhälften verwendet wird. Exprimieren Sie die Hirnödembereiche als Prozentsatz der Standardbereiche der nicht betroffenen kontralateralen Hemisphäre.Bestimmen Sie die Störung der Blut-Hirn-Schranke 24 Stunden nach dem Verschluss. Teilen Sie die rechte und linke Halbkugel in sechs Scheiben und geben Sie jede Scheibe in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Homogenisieren Sie jede Scheibe des Gehirngewebes in Trichloressigsäure unter Verwendung von 4 Millilitern 50%iger Trichloressigsäure pro Gramm Hirngewebe.Zentrifugieren Sie die Proben 20 Minuten lang bei 10.000 mal G, geben Sie dann den Überstand in ein frisches Röhrchen und verdünnen Sie ihn 1:3 mit 96 % Ethanol. Führen Sie Lumineszenzspektrophotometrie mit einem Plattenlesegerät durch. Ein unabhängiger Stichproben-t-Test zeigte, dass 19 Ratten, die sich einem dauerhaften Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCAO) unterzogen, eine signifikante Zunahme des Hirninfarktvolumens im Vergleich zu den 16 scheinoperierten Ratten zeigten.Die Ratten, die sich einer dauerhaften MCAO unterzogen, zeigten nach 24 Stunden im Vergleich zu den scheinoperierten Tieren auch einen signifikanten Anstieg des Ausmaßes des Hirnödems und des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke. Bei diesem Verfahren ist es wichtig sicherzustellen, dass die chemische Konzentration dem Protokoll entspricht. Dieses Protokoll ermöglicht es, alle drei Parameter der ischämischen Schädigung in einer Probe des Gehirns zu bewerten.

measuring-post-stroke-cerebral-edema-infarct-zone-blood-brain-barrier

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Chirurgische Induktion der ischämischen Hirnschädigung in der Ratte ist ein weit verbreitetes Modell für Schlaganfall-Forschung. Hier zeigen wir die Induktion fokaler zerebraler Ischämie durch Verschluss der mittleren Hirnarterie. Visualisierung der resultierenden Infarkt durch histologischer Färbung und Magnetresonanz-Tomographie wird ebenfalls angezeigt.

Fokaler zerebraler Ischämie-Modell von Endovascular Suture Verschluss der mittleren Hirnarterie im Rat

Dieses Video zeigt die Beurteilung der Infarktzone und des Hirnödems in Hirnschnitten von Ratten, die einem Verschluss der mittleren Hirnarterie ausgesetzt waren. Die Identifizierung von Infarktgebieten erfolgt mittels Redoxfärbung, während ein Blaufilter und eine Schwellenwertfunktion in der Bildanalysesoftware die Infarktzone und das Ödem in der betroffenen Hemisphäre quantifizieren.

Messung der Infarktzone und des Hirnödems in einem Rattengehirn nach einem Verschluss der mittleren Hirnarterie

Quelle: Zeynalov, E. et. al., Continuous IV Infusion is the Choice Treatment Route for Arginin-Vasopressin Receptor Blocker Conivaptan in Mäusen zur Untersuchung von Schlaganfall-evozierten Hirnödemen. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die intravenöse Verabreichung eines Arginin-Vasopressin (AVP)-Rezeptor-Antagonisten in einem Mausmodell. Ein vorübergehender Verschluss der mittleren Hirnarterie führt zu Hirnödemen. Ein AVP-Rezeptor-Antagonist wird über einen Katheter in die linke Halsvene...

Intravenöse Verabreichung von Rezeptorblockern zur Verringerung von Hirnödemen in einem Mausmodell

Bilaterale Carotisokklusion mit systemischer Hypotonie gekoppelt produziert globales Gehirn Ischämie bei der Ratte, was zu einer Beschädigung des Hippocampus mit reproduzierbaren Schwere. Tier Probanden mit vorhersagbaren Mustern der Hirnschädigung beeinträchtigt sind, erholen sie zweckmäßig und Mortalitätsraten sind vergleichsweise gering.

2-Gefäßverschluss / Hypotonie: Eine Ratte Modell der globalen Hirnischämie

Zerebrale Perfusion Überwachung wurde gezeigt, dass die Genauigkeit des ischämischen Schlaganfalls Modelle zu verbessern. Technische Schwierigkeiten oft die Begrenzung der Verwendung dieses unverzichtbares Werkzeug für zerebrovaskuläre Forschung. In diesem Video wird ein optimiertes System gezeigt, dass eine Einzel-oder Multi-Site hämodynamische Monitoring bei intraluminalen Mitte Zerebralarterie bei Ratten zu erhalten.

Optimierte System for Cerebral Perfusion Überwachung im Rat Stroke Modell Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

Gehirn Myeloidzellen Charakterisierung nach Schlaganfall kann durch Stereologie unter Verwendung des optischen Fraktionator Verfahren durchgeführt werden, oder durch eine durchflusszytometrische Analyse von Gehirn Leukozyten Suspensionen. Beide sind nützliche Techniken, um eine genaue phänotypische Unterscheidung der Haupt myeloischen Zellen-Untergruppen in der ischämischen Gehirn führen.

Stereo und Durchflusszytometrie Charakterisierung von Leukozyten-Subpopulationen in Models der vorübergehend oder bleibend zerebrale Ischämie

Dieses Protokoll beschreibt die wiederholte hypoxische Präkonditionierung oder kurze Exposition gegenüber systemischer Hypoxie, die das Infarktvolumen und die Störung der Blut-Hirn-Schranke nach einem vorübergehenden Verschluss der mittleren Hirnarterie bei Mäusen reduziert. Es wird auch die duale Quantifizierung des Infarktvolumens und der Störung der Blut-Hirn-Schranke nach einem Schlaganfall beschrieben, um die Wirksamkeit des neurovaskulären Schutzes zu bewerten.

Die Quantifizierung der neurovaskulären Schutz Nach Repetitive hypoxische Präkonditionierung und Transient mittleren Hirnarterie Occlusion in Mice

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine hoch reproduzierbare Technik für in Vivo Beurteilung der Blut - Hirn-Schranke Störung in Ratte-Modelle des ischämischen Schlaganfalls liefern.

Eine In-Vivo -Bewertung der Störung der Blut - Hirn-Schranke in einem Rattenmodell des ischämischen Schlaganfalls

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Depressionen bei Ratten nach dem Schlaganfall zu induzieren, indem wir die mittlere zerebrale Arterie über die innere Carotid-Arterie ausschließen. Wir verwenden den Porsolt-erzwungenen Schwimmtest und den Saccharose-Präferenztest, um induzierte depressive Stimmungen zu bestätigen und zu bewerten.

Eine mittelzerebrale Arterienokklusionstechnik zur induzierung einer Depression im Raten nach dem Schlaganfall

Diese Methode beschreibt, wie zu isolieren und zu verewigen mikrovaskulären Endothelzellen von der Maus Gehirn. Wir beschreiben ein Schritt-für-Schritt-Protokoll ausgehend von der Homogenisierung von Hirngewebe, Verdauungsschritten, Aussaat und Immortalisierung der Zellen. Normalerweise dauert es etwa fünf Wochen, um eine homogene, verewigt mikrovaskuläre Endothelzellen Zelllinie zu erhalten.

Erzeugung eines Immortalisierte Murine Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen Zelllinie als<em&gt; In Vitro</em&gt; Blut-Hirn-Barriere Modell

Erfahren Sie, wie Hirnödem, Infarktzone und Blut-Hirn-Schrankenabbau in Nagetiergehirnen gleichzeitig gemessen werden. Diese modifizierte Arterienokklusionsmethode ermöglicht effiziente Schlaganfallforschung mit nur einer Probe.

Messung des Abbaus von Hirnödem nach dem Schlaganfall, Infarktzone und Blut-Hirn-Barrierenabbau in einem einzigen Satz von Nagetier-Gehirnproben (Video) | JoVE Journal

Messung des Abbaus von Hirnödem nach dem Schlaganfall, Infarktzone und Blut-Hirn-Barrierenabbau in einem einzigen Satz von Nagetier-Gehirnproben

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