Quantifizierung der Zufuhr von Makronährstoffen in einem thermogenetischen neuronalen Bildschirm mit Drosophila Larven

Unser Protokoll ermöglicht die Identifizierung von neuronalen Larvenpopulationen, die für Ernährungsentscheidungen im Zusammenhang mit der Kontrolle der Aufnahmemengen von zwei wichtigen Makronährstoffen, Proteinen und Kohlenhydraten, kodieren. Die Einfachheit und der relativ hohe Durchsatz unserer Methode ermöglichen die Quantifizierung der Nahrungsaufnahme für mehrere Genotypen, die unterschiedlichen Ernährungsbedingungen ausgesetzt sind. Um die Elternlinien genetisch zu überqueren, stellen Sie 60 Millimeter große Embryo-Entnahmekäfige mit L3-Aufzuchtfutterplatten auf, die mit etwas aktiver Hefepaste ergänzt werden.

Übertragen Sie die erwachsenen weiblichen TripA1-Jungfrauen und die Janelia GAL4-Rüden im Alter von fünf bis acht Tagen in die Embryoentnahmekäfige und lassen Sie die Paarung 24 bis 48 Stunden lang bei 25 Grad Celsius mit 60 % Luftfeuchtigkeit und einem 12-, 12-hellen Dunkelzyklus stattfinden. Nach der Paarungszeit setzen Sie die begatteten adulten Fliegen auf frische L3-Aufzuchtfutterplatten um und lassen Sie die Eiablage drei bis vier Stunden bei 25 Grad Celsius erfolgen. Stellen Sie sicher, dass alle Platten mit dem Genotyp und dem Datum der Eiablage beschriftet sind.

Wenn die Eiablage beendet ist, nehmen Sie die Platten aus den Käfigen und schätzen Sie die Anzahl der Eier pro Platte, indem Sie die Anzahl der Embryonen in einem Viertel der Platte zählen. Halten Sie die Larvendichte auf maximal 200 Embryonen pro Platte und decken Sie die Platten mit Plastikdeckeln ab. Inkubieren Sie die L3-Aufzuchtplatten neun Tage lang bei 18 Grad Celsius, 60 % Luftfeuchtigkeit und einem 12-, 12-hellen Dunkelzyklus.

Nach der Inkubation werden drei Gruppen von 10 L3 von jedem der zu testenden Genotypen sowie eine Gruppe von 10 L3 für die Null-Farbstoff-Lebensmittelkontrolle gesammelt. Verwenden Sie eine Pinzette Nummer fünf oder eine federleichte Pinzette und führen Sie die Larvenentnahme so schonend wie möglich durch. Setzen Sie die gesammelten Larven in Plastikschalen-Hantelschiffchen um, die einen Milliliter Wasser enthalten.

Richten Sie einen 30-Grad-Inkubator ein und halten Sie die Luftfeuchtigkeit hoch, indem Sie eine mit Wasser gefüllte Schale hinzufügen, um eine Dehydrierung der Larven während des Assays zu vermeiden. Gleichen Sie die Temperatur der Assay-Platten aus, indem Sie sie vor dem Start auf 30 Grad Celsius erwärmen. Stellen Sie sicher, dass alle Platten mit dem Genotyp und dem Protein-Kohlenhydrat-Verhältnis der Ernährung beschriftet sind.

Versetzen Sie die Versuchslarven zwei Minuten lang in einen Hitzeschock, indem Sie die Plastikschiffchen mit den Tieren direkt in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad setzen. Stellen Sie die erforderliche Anzahl von Timern auf eine Stunde ein, lassen Sie dann vorsichtig das Wasser aus den Plastikbooten ab und übertragen Sie die L3-Gruppen von den Booten in die Mitte der Asset-Platten. Decken Sie die Platten ab und starten Sie den Timer.

Lassen Sie die Larven eine Stunde lang bei 30 Grad Celsius im Dunkeln fressen. Stoppen Sie den Fütterungstest, indem Sie die Platten in ein Eisbad geben. Bereiten Sie für jede getestete L3-Gruppe zwei Milliliter-Mikroröhrchen vor, die genügend 0,5 Millimeter Glasperlen enthalten, um den unteren Teil des Mikroröhrchens zu füllen, und 300 Mikroliter eiskaltes Methanol.

Verwenden Sie einen Tischkühler, um die Mikroröhrchen kalt zu halten. Die L3-Gruppen werden vorsichtig aus den Fütterungsplatten entnommen und mit etwas Wasser auf die Deckel der Platten übertragen. Spülen Sie die Larven ab, um Speisereste von ihrem Körper zu entfernen, und achten Sie darauf, Verletzungen zu vermeiden.

Übertragen Sie die Larven in die vorbereiteten Mikroröhrchen und lysieren Sie sie mit einem Gewebelyser, um den Lebensmittelfarbstoff aus den Eingeweiden zu extrahieren. Übertragen Sie die Extrakte in saubere 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen, indem Sie die beiden Milliliter-Mikroröhrchen direkt auf die neuen Röhrchen umdrehen. Tun Sie dies vorsichtig, damit die meisten Glasperlen am Boden der Zwei-Milliliter-Tube bleiben.

Beseitigen Sie die Zelltrümmer, indem Sie die Extrakte 10 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit und vier Grad Celsius zentrifugieren und dann die Überstände in saubere 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Um eine kalorimetrische Quantifizierung des Lebensmittelverbrauchs durchzuführen, stellen Sie Standardlösungen des blauen Farbstoffs her, indem Sie ihn seriell ein bis zwei Mal in Methanol verdünnen. Übertragen Sie 100 Mikroliter der experimentellen Proben, Standards und Blindproben in die Vertiefungen einer 96-Well-Mikroplatte und messen Sie die Absorption bei 600 Nanometern.

Dieses Protokoll wurde verwendet, um die relativen Mengen an Makronährstoffen zu quantifizieren, die bei Tieren unter thermogenetischer Aktivierung spezifischer neuronaler Populationen im larvalen Nervensystem konsumiert wurden. Die Aktivierung unterschiedlicher Neuronenpopulationen beeinflusste signifikant den Makronährstoffausgleich bei Larven im dritten Stadium. Das für die Kontrolllinie beobachtete Fütterungsmuster, hier in grauer Farbe dargestellt, zeigt eine erwartete Abnahme der Nahrungsaufnahme bei Diäten mit höherem Protein-Kohlenhydrat-Verhältnis, was die Wirksamkeit der Methode demonstriert.

Die fünf phänotypischen Klassen, die für die Versuchstiere etabliert wurden, waren: viel essen und die Proteinverdünnung durch übermäßiges Essen kompensieren, viel essen, aber nicht kompensieren, wenig essen, aber kompensieren, wenig essen und nicht kompensieren und abweichend essen. Für jede dieser phänotypischen Klassen und Genotypen werden die GFP-Muster im Zentralnervensystem von Larven des dritten Stadiums gezeigt. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, entwicklungssynchronisierte frühe Larven des dritten Stadiums zu erzeugen, um die mit dem Verhalten der Tiere verbundenen Variationen zu minimieren.

Nach diesem Protokoll würde die Funkkennzeichnung der Lebensmittel die Bestätigung und weitere Zerlegung der mit diesen Methoden gefundenen Treffer ermöglichen.