Proteolytisch abgebaute Alginat-Hydrogele und hydrophobe Mikrobioreaktoren zur Poren-Oozyten-Verkapselung

Dieses Protokoll zur Verkapselung von Schweineeioozyten ermöglicht die Aufrechterhaltung der sphärischen Organisation von COCs. Dies verhindert ihre Abflachung und daraus resultierende Störung der Spaltverbindungen zwischen der Eizelle und den umgebenden Follikelzellen. Die Hauptvorteile der beiden beschriebenen Protokolle sind, dass sie benutzerfreundlich sind und eine effektive Kontrolle des Überlebens der Eizelle und der Chemozellen ermöglichen.

Beide Kultursysteme sind wertvolle Werkzeuge für die Grundlagenforschung in der Reproduktionsbiologie und können klinische Relevanz für eine verbesserte Behandlung von Unfruchtbarkeit haben. Sie können auch für die Entwicklung neuartiger biotechnologischer Methoden und für die Verbesserung der Tierhaltung eingesetzt werden. Nach dem Spülen der Eierstöcke, übertragen Sie sie auf einen Becher mit HM Medium gefüllt und speichern Sie sie in einem Inkubator bei 38 Grad Celsius während aller nachfolgenden Manipulationen.

Die Follikelflüssigkeit von großen Schweinefollikel ansaugen und bei 100-fachem G 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrieren. Filtern Sie dann den Überstand mit einer sterilen Spritze, die an einem 0,2-Mikrometer-Membranporenfilter befestigt ist, und fangen Sie ihn bei negativen 80 Grad Celsius ein. Um die COCs von mittelgroßen Follikel zu isolieren, übertragen Sie zwei bis drei Eierstöcke auf eine sterile 10-Zentimeter-Petrischale, die mit HM gefüllt ist. Schneiden Sie die Oberfläche der hervorstehenden Eierstockfollikel vorsichtig mit einer sterilen chirurgischen Klinge der Nummer 15, wodurch die Follikelflüssigkeit und die COCs in die Petrischale abfließen.

Den Follikelinhalt mit einer 28-Meter-Nadel, die an einer Einwegspritze befestigt ist, ansaugen und in eine andere Petrischale übertragen. Um die IVF Petri-Gerichte zuzubereiten, fügen Sie einen Milliliter HM in die zentralen Brunnen und legen Sie drei bis vier Tropfen HM in die äußeren Ringe. Verwenden Sie dann eine Polycarbonat-Mikropipette, um die unbeschädigten COCs zu HM-Tropfen in den äußeren Ringen zu bewegen, und spülen Sie sie kurz drei- bis viermal ab.

Wenn sie fertig sind, übertragen Sie sie einzeln in den zentralen Brunnen. Bewahren Sie die IVF-Platten im Inkubator auf. Bereiten Sie Thrombin- und Fibrinogenlösungen vor, wie im Textmanuskript beschrieben.

Am Tag des Eingriffs die Fibrinogenlösung langsam auf Eis auftauen und direkt vor Gebrauch auf Raumtemperatur bringen. Mischen Sie 0,5%Alginat-Lösung und die Fibrinogen-Lösung im Verhältnis eins zu eins für ein Endvolumen von zwei Millilitern und wirbeln Sie die Mischung sanft aus. Reparieren Sie Inkubationskammern, indem Sie dünne Streifen Paraffinfolie auf Glasmikroskopdias auftragen.

Pipette 7,5 Mikroliter Tropfen der FA-Mischung auf die Paraffinfilmglasrutsche mit trennenden Abstandshaltern, platzierung acht bis zehn Tropfen in zwei Reihen angeordnet. Verwenden Sie eine Mikropipette, um drei bis fünf COCs in die Mitte des FA-Tropfens zu übertragen, zusammen mit einem minimalen Volumen des Reifungsmediums. Fügen Sie 7,5 Mikroliter Thrombin-Lösung auf jedem FA-Tropfen hinzu, um ihn zu bedecken.

Es gibt keine Notwendigkeit, sie zu mischen, weil das Gel fast sofort bildet. Bedecken Sie die Inkubationskammer mit einer zuvor vorbereiteten Glasrutsche, drehen Sie die Kammer dann auf den Kopf und legen Sie sie in eine 100-Millimeter-Petrischale, die mit feuchtem Filterpapier ausgekleidet ist. Die Petrischale in den 5% Kohlendioxid bei 38 Grad Celsius Inkubator für fünf bis sieben Minuten geben.

Nach der Inkubation jede FA-Kapsel in einen Brunnen einer 96-Well-Platte mit 100 Mikroliter Reifungsmedium übertragen. Ersetzen Sie alle zwei Tage die Hälfte des Mediums durch ein frisches vorausgeglichenes Reifungsmedium. Bild COC verwendet ein invertiertes Lichtmikroskop bei 10-facher Vergrößerung.

Nach viertägiger Kultivierung der COCs entfernen Sie das Reifungsmedium aus den Brunnen und fügen Sie 100 Mikroliter mit 10 internationalen Einheiten pro Milliliter Algenatlysat in DMEM hinzu. Lassen Sie die Kulturplatte 25 bis 30 Minuten im Brutkasten. Entfernen Sie die COCs aus den gelösten Kapseln.

Waschen Sie sie mehrmals in DMEM und übertragen Sie sie dann in den Innenring einer IVF-Schale, die PBS enthält. Machen Sie ein Bett von fünf Gramm FEP-Pulver in einer 30-Millimeter-Petrischale. Verteilen Sie ein einzelnes Tröpfchen reifungsmedium mit drei bis fünf COCs auf das FEP-Pulver.

Drehen Sie die Platte sanft in einer kreisförmigen Bewegung, um sicherzustellen, dass die Partikel vollständig die Oberfläche des flüssigkeitstropfenden abdeckenund und flüssige Murmeln bilden, oder LMs. Bereiten Sie mehrere 60-Millimeter-IVF-Petrischalen vor und fügen Sie drei bis vier Milliliter steriles Wasser zu den äußeren Ringen hinzu, um eine Feuchtigkeitskammer zu schaffen. Nehmen Sie den geformten LM mit einer 1000-Mikroliter-Pipette auf und legen Sie ihn in den zentralen Brunnen.

Die Murmeln vier Tage lang bei 38 Grad Celsius in einem fünfprozentigen Kohlendioxid-Inkubator bebrüten. Um das Medium zu ändern, wenden Sie 30 Mikroliter Reifungsmedium auf jeden LM auf, wodurch es sich ausbreitet. Wenn sich der Marmorinhalt auflöst, übertragen Sie die aus dem Bioreaktor freigesetzten COCs in einen Tropfen frisches Reifungsmedium in der Petrischale.

Nach drei bis vier Waschungen im Reifungsmedium die COCs zusammen mit 30 Mikrolitern frischem Medium auf das FEP-Pulverbett übertragen. Drehen Sie die Platte vorsichtig in einer kreisförmigen Bewegung, um sicherzustellen, dass die Pulverpartikel die Oberfläche des Flüssigkeitstropfens vollständig abdecken und einen neuen LM bilden. Dann übertragen Sie das LM auf die IVF Petrischale. Beide In-vitro-Reifungssysteme produzierten COCs mit Granulosezellen, die fest aneinander hafteten, und intakten Schichten von Cumuluszellen.

Die COC-Lebensfähigkeitsanalyse bestätigte, dass in beiden Verkapselungssystemen optimale Wachstumsbedingungen erreicht wurden. In beiden Gruppen wurden nur hochlebensfähige Eizellen beobachtet. Die Eizellen wurden mit Transmissionselektronenmikroskopie abgebildet.

Die Mitochondrien waren gleichmäßig verteilt und hatten eine muschelartige Form. Nur wenige von ihnen waren ländisch und ihre Clusterbildung wurde sporadisch beobachtet. Endoplasmatisches Retikulum wurde entweder mit Mitochondrien assoziiert oder frei im Oozyten-Zytoplasma.

Flüssige Tröpfchen erschienen als kleine, dunkle, runde Strukturen, und Golgi-Apparate wurden mit erweiterten Zisternen entstanden. Es ist wichtig, präzise und vorsichtig zu sein, wenn FA-Kapseln von der Inkubationskammer in Kulturplatten übertragen und das Format LM in die IVF Petrischale aufgenommen und übertragen werden.