Name: Ein bakterieller oraler Fütterungstest mit antibiotikabehandelten Moskitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie einen bakteriellen oralen Fütterungstest mit antibiotikabehandelten Moskitos durchführen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Rolle einzelner Darmbakterien für die Physiologie des Wirtes.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81902094, 81600497) und dem Science and Technology Plan Project der Provinz Hunan (2019RS1036) unterstützt.

1. Midgut-Sektion und kultivierbare Bakterienisolierung
<ol><li>Bereiten Sie die Mücke für die Zerlegung vor.<ol>
<li>Sammeln Sie die Mücken 7-9 Tage nach der Entstehung mit einem Aspirator. Anästhesisieren Sie die gesammelten Mücken, indem Sie sie 3-5 min einer Temperatur von 4 °C unterziehen und die Mücken in einer eiskalten Petrischale bis zur Zerlegung anbesäufen.</li>
	</ol></li>
	<li>Sterilisieren Sie Laborinstrumente und die Mückenoberfläche.<ol>
<li>Sterilisieren Sie die Experimentierbank, sezieren Sie Mikroskop, Zange und Glasschlitten, indem Sie 75% Ethanol sprühen, um eine Kontamination durch Bakterien aus der Umwelt zu vermeiden.</li>
		<li>Bereiten Sie eine sterile Petrischale mit 75% Ethanol und zwei Petrischalen mit steriler 1x Phosphatgepufferte Saline (1x PBS) zu.</li>
		<li>Die Mücke durch Tauchen und Schütteln in 75% Ethanol für 3 min oberflächensterilisieren und zweimal mit 1x PBS-Puffer abspülen, falls das Ethanol die sezierte Darmflora beeinflusst.</li>
	</ol></li>
	<li>Sezieren Sie die Mücke Midgut.<ol>
<li>Übertragen Sie die oberflächensterilisierte Mücke mit einem Tropfen sterilem 1x PBS Puffer auf die Glasrutsche. Sezieren Sie unter dem Sezieren des Mikroskops.</li>
		<li>Entfernen Sie unter der unteren Vergrößerung des Sezierens mikroskops vorsichtig die Beine, Flügel und den Kopf der Mücke, um eine Flucht zu verhindern. Entfernen Sie die letzte Sobe der Mücke, indem Sie sie direkt schneiden, anstatt sie zu ziehen, um zu verhindern, dass der Verdauungstrakt bricht.</li>
		<li>Klemmen Sie den Thorax der Mücke und das Ende des Bauches mit Zange. Ziehen Sie vorsichtig den Verdauungstrakt der Mücke heraus. Der erworbene Verdauungstrakt enthält in der Regel die Ernte, Vorgut, Midgut, Hinterdarm, und die Malpighian Röhren.</li>
		<li>Stellen Sie das Sezieren des Mikroskops auf eine höhere Vergrößerung ein. Entfernen Sie die Ernte, Dasvorgut, Dasbauch, und die Malpighian Rohre aus dem sezierten Verdauungstrakt, um das Mittelgut der Mücke zu bekommen.</li>
		<li>Achten Sie beim Entfernen der Ernte darauf, da sich die Ernte aufbläht und dem Mittelgut ähnelt, nachdem die Mücke eine Zuckermahlzeit zu sich nimmt. Die Malpighian-Rohre, eine Gruppe von langen und dünnen Ausscheidungsrohren, befinden sich an der Grenze zwischen dem Mittelgut und dem Hintergut.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolieren Sie Darmbakterien.<ol>
<li>Übertragen Sie das sezierte Mittelgut in ein steriles 1,5 ml-Rohr mit 200 l sterilem 1x PBS-Puffer.</li>
		<li>Schleifen Sie das Midgut auf einer sterilen Bank gründlich mit einem sterilen Stößel, um eine vollständige Freisetzung von Darmbakterien in den Puffer zu ermöglichen.</li>
		<li>Das Homogenat wird seriell auf drei 10-fache Verdünnungen verdünnt. Fügen Sie 50 l jeder Verdünnung in die LB (Luria-Brühe) Agarplatte, und verteilen Sie es dann auf der Platte. Wenn das Mittelgut eine hohe Konzentration von Darmflora enthält, ist es wichtig, mehr serielle Verdünnungen zu machen, um einzelne Kolonien herauszupicken.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 1-2 Tage, bis einzelne Kolonien sichtbar sind.</li>
	</ol></li>
	<li>Artenidentifikation<ol>
<li>Wählen Sie einzelne Kolonien und impfen Sie sie jeweils in einen 150 ml kegelförmigen Kolben mit 50 ml LB-Brühemedium.</li>
		<li>Schütteln Sie die Bakterien bei 37 °C über Nacht.</li>
		<li>Extrahieren Sie die gesamte DNA durch bakterielle genomische DNA-Extraktionkit. Verstärken Sie 16S rDNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR). HINWEIS: Es gibt mehrere Segmente in 16S rDNA, die konserviert werden. Basierend auf diesen konservierten Regionen können universelle Primer für Bakterien entwickelt werden, um 16S rDNA-Fragmente aller Bakterien zu verstärken. Diese Primer sind spezifisch für Bakterien, und der Unterschied in der variablen Region von 16S rDNA kann verwendet werden, um verschiedene Bakterien zu unterscheiden. Daher ist 16S rDNA weit verbreitet für die bakterielle Identifizierung verwendet.</li>
		<li>Wiederherstellen und Reinigen von DNA-Fragmenten aus PCR-Produkten durch Agarose-Gel-Elektrophorese und ein kommerzielles Gel-Recovery-Kit.</li>
		<li>Führen Sie eine DNA-Sequenzierung der gereinigten DNA-Fragmente durch, um bakterielle Gensequenzen zu erhalten.</li>
		<li>Vergleichen Sie die 16S rRNA-Gensequenz mit der in GenBank verfügbaren bakteriellen Sequenz. Wählen Sie die Datenbank Bakterien und Archaea aus. ANMERKUNG: Die Identifizierung auf Artenebene wurde definiert als eine Ähnlichkeit mit der Sequenz ähnlichkeitsweise 99 % 16S rDNA mit dem nächsten GenBank-Eintrag. Das Isolat wurde der entsprechenden Gattung zugewiesen, als seine 16S-rDNA-Sequenzähnlichkeit <99% und 95% betrug.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Antibiotika-Behandlung und Wiedereinführung des Bakteriums
<ol><li>Bereiten Sie die Antibiotikum-Lösung vor.<ol>
<li>Wiegen Sie die erforderliche Menge an Saccharose, Penicillin und Streptomycin, um eine 10%ige Saccharoselösung mit 20 Einheiten Penicillin und 20 g Streptomycin pro ml vorzubereiten.</li>
	</ol></li>
	<li>Füttern Sie Mücken mit der Antibiotikalösung.<ol>
<li>Anästhesisieren Sie die Mücken in 4 °C für 3-5 min. Übertragen Sie die Mücken in eine Papiertasse. Bedecken Sie die Oberseite mit Gaze und wickeln Sie die Gaze mit Klebeband auf, um mückenverhindern zu entkommen.</li>
		<li>Tauchen Sie sterile Baumwollkugeln in die Antibiotikalösung und legen Sie sie vorsichtig auf die Mücke-Tasse. Drücken Sie die Baumwollkugeln vor dem Gebrauch, um zu verhindern, dass Mücken in den tropfenden Baumwollkugeln ertrinken.</li>
		<li>Bedecken Sie die Baumwollkugeln mit einer 10 cm Petrischale, um Feuchtigkeitsverdunstung zu verhindern. Ersetzen Sie die Baumwollkugeln zweimal täglich für drei aufeinanderfolgende Tage.</li>
	</ol></li>
	<li>Bestätigen Sie die Wirksamkeit der Antibiotika-Behandlung.<ol>
<li>Nach der oben genannten Methode, sezieren Sie das Mittelgut von antibiotikabehandelten Mücken.</li>
		<li>Übertragen Sie die sezierten Mittelguts in ein steriles 1,5 ml-Rohr mit 200 l sterilem 1x PBS-Puffer.</li>
		<li>Schleifen Midguts in einer sterilen Bank gründlich mit einem sterilen Stößel, um die vollständige Freisetzung von Darmbakterien in den Puffer zu ermöglichen.</li>
		<li>Extrahieren Sie die mikrobielle DNA des Darms durch bakterielle genomische DNA-Extraktionskit.</li>
		<li>Durchführung der bakteriellen Quantifizierung durch quantitative PcR (qPCR) in Echtzeit auf genomische DNA mit universellen Eubakterienprimern (16S rRNA F: TCCTACGGGAGGCAGCAGT und R: GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT).</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung der bakteriellen Suspension<ol>
<li>Messen Sie die bakterielle Lösung mit einem Spektralphotometer. Fügen Sie 1 OD (OD600) bakterielle Suspension in ein 1 ml Rohr. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 5.000 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
		<li>Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml sterilen 1x PBS-Puffer zu 1,5 ml Rohr für Suspensionsfällung hinzu.</li>
		<li>Zentrifuge bei 5.000 x g für 5 min bei 4 °C; den Überstand zu entsorgen.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.4.2 und 2.4.3.</li>
		<li>Fügen Sie dem bakteriellen Niederschlag 200 l sterilen 1x PBS-Puffer hinzu.</li>
		<li>Fügen Sie 600 l 10% Saccharoselösung, 200 l 10 mm ATP (die als Phagostimulans wirkt) und 200 l bakterielle Suspension in ein steriles 1,5 ml-Rohr geben. Mix durch Wirbel. Alternativ können Sie bakterielle Pellets in hitzeinaktiviertem Blut aussetzen.</li>
		<li>Zubereitung von wärmeinaktiviertem Blut<ol>
<li>Sammeln Sie frisches Blut mit einem gerinnungshemmenden Rohr.</li>
			<li>Nehmen Sie 2-3 ml frisches Blut. Zentrifuge bei 1.000 x g für 10 min bei 4 °C, um Plasma und Blutzellen zu trennen. Beachten Sie, dass das Blut während der Zentrifugation und Waschprozess verloren gehen; es ist notwendig, die Nutzung im Voraus zu berechnen.</li>
			<li>Das Plasma in ein neues 1,5 ml-Rohr einsammeln und bei 56 °C für 1 h wärmeinaktivieren.</li>
			<li>Fügen Sie 500 l sterilen 1x PBS-Puffer zu 1,5 ml Röhrchen für die Suspension von Blutzellen hinzu. Zentrifugieren Sie bei 1.000 x g für 10 min bei 4 °C und entsorgen Sie dann den Überstand.</li>
			<li>Wiederholen Sie Schritt 2.4.7.4 zweimal.</li>
			<li>Resuspend Blutzellen mit wärmeinaktiviertem Plasma, um wärmeinaktiviertes Blut zu erhalten.</li>
			<li>Befolgen Sie die Schritte 2.4.1 bis 2.4.4, um 1 OD-Bakteriengranat zu erhalten.</li>
			<li>Setzen Sie die mit 1 ml hitzeinaktiviertem Blut granulierten Bakterien wieder aus.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Füttern Sie die Mücke mit Bakteriensuspension.<ol>
<li>Verhungern Sie die Mücken für 24 h, so dass Antibiotika verstoffwechseln, bevor Bakterien zu füttern.</li>
		<li>Montieren Sie das Membran-Zuführsystem.</li>
		<li>Versiegeln Sie die sterilisierte Feedereinheit mit einem Parafilm, alternativ einer Kollagenmembran.</li>
		<li>Setzen Sie einen Kunststoffring auf und fixieren Sie ihn mit Parafilm, um Reibungsbrüche während der Fütterung zu vermeiden.</li>
		<li>Fügen Sie die vorbereitete bakterielle Lösung langsam in die Feedereinheit ein. Beachten Sie, dass nur ein Brunnen der Zwei-Well-Feeder-Einheit mit der Lösung gefüllt werden kann und die Feedereinheit nur von der Reagenz-Abwurfseite abdeckt.</li>
		<li>Schließen Sie die Zuführeinheit an ein auf 37 °C vorgeheiztes Fütterungssystem an, das die menschliche Temperatur simuliert, um Mücken anzulocken. Legen Sie das Fütterungsgerät auf einen mit Mücken gefüllten Papierbecher und füttern Sie ihn 90 min.</li>
		<li>Nach der Fütterung die Mücken anästhesieren, indem Sie sie 3-5 min einer Temperatur von 4 °C unterziehen und die Mücken in einer eiskalten Petrischale anbesen.</li>
		<li>Wählen Sie die vollständig engorged Mücken für weitere Studien.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Tolle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito-borne+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Problems+in+Pediatric+and+Adolescent+Health+Care%22%5BJournal%5D)">Mosquito-borne diseases.</a> Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).</li>
<li>Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arbovirus+lifecycle+in+mosquito%3A+acquisition%2C+propagation+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Reviews+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission.</a> Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1(2019).</li>
<li>Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+gut+inhabitants+on+vectorial+capacity+of+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vector+Borne+Diseases%22%5BJournal%5D)">Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes.</a> Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69(2018).</li>
<li>Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insect+microbiome+modulates+vector+competence+for+arboviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses.</a> Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).</li>
<li>Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+culturable+bacteria+including+Pantoea+in+wild+mosquito+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 70(2013).</li>
<li>Chouaia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evidence+for+multiple+infections+as+revealed+by+typing+of+Asaia+bacterial+symbionts+of+four+mosquito+species%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).</li>
<li>Terenius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midgut+bacterial+dynamics+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti.</a> FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).</li>
<li>Bando, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-specific+diversity+of+Serratia+marcescens+in+Anopheles+mosquito+midgut+defines+Plasmodium+transmission+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity.</a> Scientific Reports. 3, 1641(2013).</li>
<li>Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenome+and+culture-based+methods+reveal+candidate+bacterial+mutualists+in+the+Southern+house+mosquito+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).</li>
<li>Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+gut+microbiome+across+life+history+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+in+Kenya%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya.</a> PloS One. 6 (9), (2011).</li>
<li>Xiao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mesh-Duox+pathway+regulates+homeostasis+in+the+insect+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut.</a> Nature Microbiology. 2 (5), 17020(2017).</li>
<li>Guégan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+impacts+of+anthropogenic+stressors+on+Aedes+albopictus+mosquito+vector+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota.</a> FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188(2018).</li>
<li>Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+transcription+factor+signaling+is+essential+for+larval+growth+of+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).</li>
<li>Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquitoes+rely+on+their+gut+microbiota+for+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Mosquitoes rely on their gut microbiota for development.</a> Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).</li>
<li>de O Gaio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+midgut+bacteria+to+blood+digestion+and+egg+production+in+Aedes+aegypti+%28diptera%3A+culicidae%29%28L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L).</a> Parasites & Vectors. 4 (1), 105(2011).</li>
<li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota%2C+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561(2012).</li>
<li>Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entomopathogenic+fungus+Beauveria+bassiana+activate+toll+and+JAK-STAT+pathway-controlled+effector+genes+and+anti-dengue+activity+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).</li>
<li>Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Aedes+aegypti-associated+fungus+increases+susceptibility+to+dengue+virus+by+modulating+gut+trypsin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity.</a> Elife. 6, 28844(2017).</li>
<li>Wu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gut+commensal+bacterium+promotes+mosquito+permissiveness+to+arboviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses.</a> Cell Host & Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).</li>
<li>Möhlmann, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+gut+bacteria+on+the+infection+and+transmission+of+pathogenic+arboviruses+by+biting+midges+and+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes.</a> Microbial Ecology. , (2020).</li>
<li>Llorca, M., Gros, M., Rodríguez-Mozaz, S., Barceló, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preservation+for+the+analysis+of+antibiotics+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Sample preservation for the analysis of antibiotics in water.</a> Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).</li>
<li>Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+stability+of+antibiotics+in+matrix+and+reference+solutions+using+a+straightforward+procedure+applying+mass+spectrometric+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Additives+%26+Contaminants%3A+Part+A%2C+Chemistry%2C+Analysis%2C+Control%2C+Exposure+%26+Risk+Assessment%22%5BJournal%5D)">Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection.</a> Food Additives & Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).</li>
<li>Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+midgut+microflora+and+dengue+virus+impact+on+life+history+traits+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti.</a> Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).</li>
<li>Eng, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+functional+implications+of+an+endogenously+expressed+tRNA+fragment+in+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186(2018).</li>
<li>Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria%3A+A+novel+source+for+potent+mosquito+feeding-deterrents%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents.</a> Science Advances. 5 (1), 6141(2019).</li>
<li>Gonçalves, G. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+MALDI-TOF+MS+to+identify+the+culturable+midgut+microbiota+of+laboratory+and+wild+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes.</a> Acta Tropica. 200, 105174(2019).</li>
<li>Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuss%2C+SK+%22Science%22">Science</a>. 334 (6053), New York, N.Y. 249-252 (2011).</li>
<li>Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+diversity+analysis+of+larvae+and+adult+midgut+microflora+using+culture-dependent+and+culture-independent+methods+in+lab-reared+and+field-collected+Anopheles+stephensi-an+Asian+malarial+vector%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector.</a> BMC Microbiology. 9 (1), (2009).</li>
<li>Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serratia+odorifera+a+midgut+inhabitant+of+Aedes+aegypti+mosquito+enhances+its+susceptibility+to+dengue-2+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus.</a> PLoS One. 7 (7), 40401(2012).</li>
<li>Behura, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+microbiota+and+metagenomics%2C+and+its+relevance+to+disease+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission.</a> Nature. 436, 257-260 (2013).</li>
<li>Dickson, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+laboratory+colonies+of+Aedes+aegypti+harbor+the+same+adult+midgut+bacterial+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome.</a> Parasites & Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Untersuchungen an Wirt-Mikroben-Wechselwirkungen haben ergeben, dass verschiedene Darmmikroben ihre Wirtsphysiologie über divergierende Mechanismen beeinflussen. Dieser Artikel stellt die Methode vor, um die jeweilige Rolle der Moskito-Darm-Mikrobe zu untersuchen, einschließlich der Sezieren von Mückenmittelgut, Kultivieren von kultivierbaren Darmbakterien, Antibiotika-Behandlung, und Wiedereinführung der Bakterien von Interesse.
Für eine erfolgreiche Antibiotikabehandlung müssen bei der Durch...

Mücken gelten als die wichtigsten Vektoren menschlicher pathogener Krankheiten, die über hundert Krankheitserreger übertragen, darunter das Zika-Virus, das Dengue-Virus und die Plasmodium-Parasiten 1. Wenn Mücken eine Blutmahlzeit nehmen, um Nährstoffe für die Oviposition zu erhalten, können sie versehentlich Krankheitserreger von einem infizierten Wirt über den Verdauungstrakt2aufnehmen. Wichtig ist, dass das Mückenmittelgut, das sowohl bei der Blutmahlzeit als auch beim Eintritt von Krankheitserregern eine zentrale Rolle spielt, ein hochdynamisches Mikrobiom3beherbergt.
Mehrere Studien haben labor- und feldgesammelte Mückenmikrobiota entweder mit einer kulturabhängigen Methode oder einem Bakteriensequenzierungstest4,5,6charakterisiert. Arten wie Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingiaund Enterococcus sind häufig von Mücken in verschiedenen Studienisoliert 5,7,8,9. Interessanterweise schwankt die Moskitodarmmikrobiota dynamisch sowohl in der Vielfalt der Gemeinschaft als auch in der Menge der Bakterienarten, die von der Entwicklungsphase, der Art, der geografischen Herkunft und dem Fütterungsverhalten betroffen sind4. Studien zeigen, dass die Blutfütterung die gesamte bakterielle Belastung mit einer schnellen Ausdehnung der Arten von Enterobacteriaceae und einer Verringerung der Gesamtvielfalt10,11dramatisch erhöht. Darüber hinaus wird Mückendarmmikrobiota des Larvenstadiums in der Regel ausgerottet, wenn das Insekt während der Pupation und Scheidung einer Metamorphose unterzogen wird; Daher müssen neu entstandene erwachsene Mücken ihre Mikrobiota4wieder bevölkern.
Gut mikrobiota moduliert Insektenphysiologie in verschiedenen Aspekten, einschließlich Nährstoffaufnahme, Immunität, Entwicklung, Reproduktion und Vektorkompetenz12. Axenic Mückenlarven nicht über den ersten Instar entwickeln, während ein Bakterium orale Versorgung rettet Entwicklung, was darauf hindeutet, dass die Mücke Darm Mikrobe ist wichtig für die Larvenentwicklung13,14. Außerdem, Erschöpfung der Darmbakterien verzögert Blutmehl Verdauung und Nährstoffaufnahme, wirkt sich auf die Oozytenreifung, und verringert oviposition15. Darüber hinaus lösen Mücken mit Darmmikroflora höhere Immunantworten im Vergleich zu antibiotikabehandelten Mücken aus, mit ständig erhöhter antimikrobieller Peptidexpression gegen andere Krankheitserreger, um16zu infizieren. Antibiotika werden in der Regel oral verabreicht, um Pan-Darm-Bakterien in diesen Studien zu entfernen, und dann werden Experimente durchgeführt, um den Unterschied zwischen axtischen Mücken und Mücken mit commenalen Mikroben zu vergleichen. Allerdings beherbergt die Mücke Midgut eine vielfältige Gemeinschaft von Mikroben, und jede Bakterienart könnte eine deutliche Wirkung auf die Wirtphysiologie ausüben.
Mückenmikrobiota reguliert Vektorkompetenz mit divergierenden Effekten. Die Kolonisation durch Proteus, isoliert von feldabgeleiteten Mücken von Dengue-endemischen Gebieten, verleiht eine hochregulierte antimikrobielle Peptidexpression und Resistenz gegen Dengue-Virusinfektionen16. Der entomopathogene Pilz Beauveria bassiana aktiviert den Toll- und JAK-STAT-Immunweg gegen eine Arbovirus-Infektion17. Im Gegensatz dazu erleichtert der aus Aedes aegypti midgut isolierte Pilz Talaromyces die Infektion des Dengue-Virus, indem er die Darmtrypsin-Aktivitätmoduliert 18. Darüber hinaus fördert Serratia marcescens die Arbovirus-Übertragung durch ein sekretorisches Protein namens SmEnhancin, das die Mucin-Schicht auf dem Darmepithel von Mückenverdaut 19.
Dieses Verfahren bietet eine systematische und intuitive Methode zur Zerlegung des Mückenmittelguts, zur Isolierung von kulturierbaren Bakterienkolonien, zur Identifizierung der Bakterienarten und zur Wiedereinführung durch orale Fütterung. Es liefert repräsentative Ergebnisse der Blutfütterung mit einem commensal Bakterium, Chryseobacterium Meningosepticum, auf Mücken EierstockEntwicklung und Oviposition.

<table><tbody><tr><td>Adenosin 5&prime;-triphosphat Dinatriumsalzhydrat</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td>Adenosin 5&prime;-triphosphat Dinatriumsalzhydrat wurde zur Herstellung von Adenosintriphosphat (ATP) Standardlösungen verwendet</td></tr><tr><td>Aedes aegypti</td><td></td><td></td><td>Weibliche Mücken</td></tr><tr><td>Antikoagulanzienröhrchen</td><td>BD Vacutainer</td><td>363095</td><td>Frisches Blut sammeln</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen</td><td>Sangon Biotech</td><td>F601620-0010</td><td>1,5 ml, natürlich, graduiert, steril</td></tr><tr><td>Wattebällchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Taschentuchschleifstößel</td><td>Sangon Biotech</td><td>F619072-0001</td><td>70 mm lang, konisch, blau, steril</td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>Paini</td><td></td><td>Verdünnen Sie es auf 75%</td></tr><tr><td>Ethanol Pinzette</td><td>RWD</td><td>F11029</td><td>Dissektion</td></tr><tr><td>Hemotek Membran Zuführung System</td><td>Hemotek</td><td></td><td>Komponenten des Fütterungssystems, einschließlich&nbsp; Hemotek Temperaturregler, Dosierer-Gehäuse-Baugruppe, Metall-Dosierer montiert.</td></tr><tr><td>Inkubatorschüttler</td><td></td><td>ZQZY-78AN</td><td></td></tr><tr><td>Impfösen</td><td>Sangon Biotech</td><td>F619312-0001</td><td>10 &mu; l, Gelbes</td></tr><tr><td>LB Agar Pulver</td><td>Sangon Biotech</td><td>A507003</td><td>Trypton 10,0 g, Hefeextrakt 5,0 g, NaCl 10,0 g, Agar 15,0 g.</td></tr><tr><td>LB Bouillon Pulver</td><td>Sangon Biotech</td><td>A507002</td><td>Trypton 10,0 g, Hefeextrakt 5,0 g, NaCl 10,0 g.</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi508</td><td></td></tr><tr><td>Pappbecher</td><td></td><td></td><td>Place Moskito</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sangon Biotech</td><td>F104002</td><td>4 inx 125 ft</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Sangon Biotech</td><td>F611203</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G Procainsalz hydrat</td><td>Sangon Biotech</td><td>A606248</td><td>Weißes Pulver. Löslich in Wasser, löslich in Methanol, schwer löslich in Wasser, Ethanol</td></tr><tr><td>Single Channal Pipettier</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptomycinsulfat</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610494</td><td>Streptomycinsulfat ist ein Glucosamin-Antibiotikum, das die Synthese von prokaryotischen Proteinen stört.</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sangon Biotech</td><td>A502792</td><td>Löslich in Wasser, Ethanol und Methanol, schwer löslich in Glycerin und Pyridin.</td></tr><tr><td>TIANamp Bakterien DNA Kit</td><td>TIANGEN</td><td>DP302</td><td>Extrakt DNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Utility Fabric-Moskitonetz Weißer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Mischer</td><td>Scintic Industries</td><td>S1-0246</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml EP-Tube</td><td>Sangon Biotech</td><td>F600620</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS-Puffer</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607016</td><td>Dieses Produkt ist eine 10-fache Lösung. Bitte vor Gebrauch 10 Mal verdünnen. Der pH-Wert liegt bei 7,4.</td></tr></tbody></table>

ein bakterieller oraler fütterungstest mit antibiotikabehandelten moskitos

A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

Die Mücke Midgut beherbergt ein hochdynamisches Mikrobiom, das den Wirtsstoffwechsel, die Fortpflanzung, die Fitness und die Vektorkompetenz beeinflusst. Es wurden Studien durchgeführt, um die Wirkung von Darmmikroben als Ganzes zu untersuchen; jedoch könnten verschiedene Mikroben unterschiedliche Auswirkungen auf den Wirt ausüben. Dieser Artikel enthält die Methodik, um die Wirkung jeder spezifischen Mückendarmmikrobe und den potenziellen Mechanismus zu untersuchen.
Dieses Protokoll besteht aus zwei Teilen. Der erste Teil stellt vor, wie man das Mückenmittelgut seziert, kultivierbare Bakterienkolonien isoliert und Bakterienarten identifiziert. Der zweite Teil sieht das Verfahren zur Erzeugung von antibiotikabehandelten Mücken und zur Wiedereinführung einer bestimmten Bakterienart vor.

Die Mittelguts von Mücken, die mit Antibiotika und ohne Antibiotika behandelt wurden, wurden zur DNA-Extraktion herausgenommen, und qPCR wurde mit universellen bakteriellen Primern durchgeführt. Abbildung 1 zeigt die Expression von bakteriellen 16S rRNA in der Kontrollgruppe und der Antibiotika-Behandlungsgruppe. Die Ergebnisse zeigen, dass etwa 98% der Darmbakterien entfernt wurden, und die Darmsterilisation von Penicillin und Streptomycin war erfolgreich.
Mit den beschrieben...

Dieser Artikel stellt ein Protokoll vor, um die Wirkung einzelner Mückendarmbakterien zu untersuchen, einschließlich Isolierung und Identifizierung von Mücken-Mittelgut-anbaufähigen Mikroben, Antibiotika-Erschöpfung von Mückendarmbakterien und Wiedereinführung einer bestimmten Bakterienart.

Ein bakterieller oraler Fütterungstest mit antibiotikabehandelten Moskitos

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...

Mosquito Midgut beherbergt eine komplexe Gemeinschaft von Mikroben, die den Wirtsstoffwechsel, Die Fortpflanzung, Fitness und Tierarztkompetenz beeinflussen. Mit jeder Darmmikrobe ist ein anderer Effekt. Dieses Video stellt das Verfahren vor, um die jeweilige Rolle jedes Bakterienstamms oder der Wirtsphysiologie zu untersuchen.Um eine Kultur der Darmbakterienkolonien zu erwerben, sezieren Sie die Mücke Midgut unter sterilem Zustand. Erden Sie das Sezieren midgut, serotologinate, und über die Agarplatte verteilt. Wählen Sie einzelne Kolonien von der Platte und identifizieren Sie die Bakterienarten über ihre 16 SRNA-Gensequenz.Füttern Sie die Mücken mit COD-Emboss, die Antibiotika für aufeinander folgende von drei Tagen enthalten, um Darmmikrobiota zu entfernen. Die Wirksamkeit der Antibiotika-Behandlung kann durch Sezieren des Mittelguts der aseptischen Mücke für Kolonien bildenden Einheit Assay vor den nachfolgenden Extremisten bestätigt werden. Dann wieder bestimmte Bakterienarten, die zuvor aus Demmückendarm durch orale Fütterung Assay isoliert.Die Wirkung von Bakterien auf die Wirtsphysiologie könnte durch den Vergleich der unbehandelten Mücken, antibiotikabehandelten Mücken und

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Quelle: Liu, X. et al. Ein bakterielles orales Fütterungsverfahren mit antibiotikabehandelten Mücken. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video zeigt die Zerlegung des Mückenmitteldarms zur Isolierung von Darmbakterien. Der Mitteldarm wird aus dem Verdauungstrakt extrahiert, homogenisiert, um die Bakterien freizusetzen, und auf Nährstoffagar versetzt, um Bakterienkolonien zu kultivieren.

Isolierung von Bakterien aus dem Mücken-Mitteldarm

Quelle: Liu, X. et al. Ein bakterielles orales Fütterungsverfahren mit antibiotikabehandelten Mücken. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video zeigt die Erschöpfung der natürlichen Darmmikrobiota bei Mücken mit einer antibiotikahaltigen Saccharoselösung. Darauf folgt eine kontrollierte Rekolonisierung mit einer bakteriellen Suspension, die über ein Membranfütterungssystem geliefert wird, um eine definierte Bakterienpopulation im Mückendarm zu etablieren.

Etablierung einer definierten Darmbakterienpopulation bei erwachsenen Mücken

Dieses Video zeigt einen Blutfütterungsassay zur Bewertung der Mortalität und Fruchtbarkeit von Testverbindungen mit neuartigen Wirkungsweisen an weiblichen Mücken. Diese Technik hilft beim Screening neuer Klassen von Insektiziden, um die resistente Population von Mücken abzutöten und die Ausbreitung der Krankheit zu kontrollieren.

Mückenfütterungstest: Eine Methode zur Bewertung der Auswirkungen von Testverbindungen auf die Mortalität und Fruchtbarkeit erwachsener weiblicher Mücken

Aufgrund der auffälligen Ähnlichkeiten des Lebenszyklus und der Biologie von Nagetier-Malariaparasiten mit menschlichen Malariaparasiten sind Nagetier-Malariamodelle für die Malariaforschung unverzichtbar geworden. Hierbei haben wir einige der wichtigsten Techniken standardisiert, die bei der phänotypischen Analyse von wildflebenden und transgenen Nagetier-Malaria-Arten verwendet werden.

Phänotypische Analyse von Nagetier Malaria Parasiten Asexual und Sexuelle Blutstadien und Mückenstadien

Protokolle sind für die Bewertung der Toxizität von Chemikalien zu unreif und Erwachsene Mücken für Entwicklung als neue Klassen von Larviziden, Adulticides und Endectocides beschrieben. Die Protokolle ermöglichen Hochdurchsatz-Prüfung von mehreren Chemikalien bei Einzelpunkt-Dosis und anschließende Auswertung über Dosis-Antwort-Assay Toxizität auf Kontakt zu bestimmen oder Verschlucken.

Protokolle für die Prüfung der Toxizität von neuartigen Insektizide Chemikalien, Mücken

Für die effiziente Steuerung der Moskito Virusübertragung zu tragen ist die Kenntnis der Vektor Potential der jeweiligen Mücken von besonderem Interesse. Wir beschreiben erzwungene Speichelfluss als Methode zur vektorkompetenz von Aedes Albopictus und drei verschiedenen Culex Taxa für die Übertragung der Zika-Virus zu analysieren.

Gezwungen Speichelfluss als Methode zur Vektorkompetenz von Stechmücken Analyse

Ein Protokoll wird für die Formulierung einer blutfreien künstlichen Ernährung zur Fütterung von Anopheles-Mücken in Gefangenschaft vorgelegt. Diese Diät hat eine ähnliche Leistung wie Wirbeltierblut und löst Oogenese und Eireifung aus und produziert lebensfähige Erwachsene Nachkommen.

Eine blutfreie Diät, um Anopheline-Mücken zu hinterziehen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, tierische und künstliche Blutmahlzeiten an Aedes aegypti Mücken durch einen künstlichen Membran-Feeder zu liefern und das Volumen der aufgenommenen Mahlzeit genau zu quantifizieren.

Fütterung und Quantifizierung von Tierblut und künstlichen Mahlzeiten in Aedes aegypti Mosquitoes

Die orale Verabreichung von dsRNA, die von Bakterien produziert wird, eine Verabreichungsmethode für RNA-Interferenz (RNAi), die routinemäßig bei Caenorhabditis elegans angewendet wird, wurde hier erfolgreich auf erwachsene Moskitos angewendet. Unsere Methode ermöglicht robuste Studien zur Umkehrgenetik und übertragungsblockierende Vektorstudien ohne den Einsatz von Injektionen.

Effektive orale RNA-Interferenz (RNAi) Verabreichung an erwachsene Anopheles gambiae-Mücken

Der Standard Membrane Feeding Assay (SMFA) gilt als Goldstandard für die Bewertung und Identifizierung potenzieller Malariamittel. Dieses künstliche Fütterungssystem wird verwendet, um Moskitos zu infizieren, um die Auswirkungen solcher Verbindungen auf die Intensität und Prävalenz des Parasiten Plasmodium falciparum weiter zu bewerten.

Standard-Membran-Fütterungstest zum Nachweis von Plasmodium falciparum-Infektionen in Anopheles-Mückenvektoren

Diese Methodik, die orale Ernährung und intrathorakale Injektionsinfektionen umfasste, konnte den Einfluss von Mitteldarm- und/oder Speicheldrüsenbarrieren auf die Arbovirusinfektion effektiv bewerten.

Experimentelle Virusinfektion bei adulten Stechmücken durch orale Fütterung und Mikroinjektion

Erfahren Sie, wie Sie einen bakteriellen oralen Fütterungstest mit antibiotikabehandelten Moskitos durchführen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Rolle einzelner Darmbakterien für die Physiologie des Wirtes.

Ein bakterieller oraler Fütterungstest mit antibiotikabehandelten Moskitos

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