Automatisiertes Sample-Multiplexing mit kombinierter Vorläufer-Isotop-Etikettierung und isobaischer Kennzeichnung (cPILOT)

Unser automatisiertes cPILOT-Protokoll erleichtert es Forschern, Proben mit hohem Durchsatz zu analysieren. Dies ist wichtig, weil es uns ermöglicht, zu biologischen Informationen über Krankheiten oder verschiedene Bedingungen viel schneller zu gelangen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie hilft, mehrere Samples parallel zu verarbeiten, wodurch umsetzbare Fehler bei Verwendung von Proben mit hohem Durchsatz reduziert werden.

Unser Labor interessiert sich für Anwendungen im Zusammenhang mit Alterung und Alzheimer-Krankheit. Diese Technik kann jedoch auch verwendet werden, um jede Krankheit oder Herausforderung zu untersuchen, wenn biologisches Gewebe beteiligt sind. Beginnen Sie mit dem Einschalten des Überdruckgeräts, des Heiz- und Kühlgeräts und der Vakuumpumpen.

Schließen Sie alle Zubehörteile mit dem Flüssigkeitshandler an, der ein blaues Licht anzeigt, sobald es mit dem Computer verbunden und betriebsbereit ist. Aliquot 300 Mikroliter der Leber homogenisieren in eine 500-Mikroliter-Röhre und legen Sie sie auf eine zwei Milliliter tiefe Brunnenplatte. Bewahren Sie die Probe bei vier Grad Celsius bis zum Beginn des Protokolls auf.

Öffnen Sie die Methode in der Software und platzieren Sie die erforderlichen Tipps und Labware in ihre Positionen. Überprüfen Sie dann das endgültige Decklayout und klicken Sie auf Weiter, um das Protokoll fortzusetzen. 230 Mikroliter-Spitzen laden und 90 Mikroliter von acht Molharnstoff aus dem Reservoir ansaugen.

Dann geben Sie es, um eine der schwarzen zwei Milliliter tiefen Brunnenplatte zu rudern. Entladen Sie die Spitzen von TL1 und wiederholen Sie diesen Schritt, bis Harnstoff in allen Brunnen hinzugefügt wurde. Nach Dem Hinzufügen des Denaturierungspuffers verwenden Sie 90 Mikroliter-Spitzen, um 10 Mikroliter Mausleber homogenat auf die Tiefe Brunnenplatte zu übertragen.

Entladen Sie die Spitzen, dann laden Sie eine Reihe von 90 Mikroliter Spitzen und aspirieren Sie drei Mikroliter DTT von Reagenzplatte eins. Geben Sie DTT auf die Reihen eins und zwei der tiefen Brunnenplatte. Versiegeln Sie die Probenplatte mit Aluminiumfolie und bebrüten Sie sie bei 37 Grad Celsius für 600 Sekunden, während Sie sich bei 300 Umdrehungen drehen.

Nach der Inkubation eine Reihe von 90 Mikroliterspitzen laden, sechs Mikroliter IAM von Reagenzplatte eins in Reihe drei ansaugen und für eine Reihe der Probenplatte abgeben. Versiegeln Sie die Probenplatte und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius, während Sie sich bei 300 Umdrehungen pro Minute auf dem Kühlgerät drehen. Dann die Probenplatte entsiegeln und eine Reihe von 90 Mikroliter-Spitzen laden.

Fünf Mikroliter Cystin aus Reagenzplatte eins in Reihe zwei aspirieren und in die Reihen eins und zwei der Probenplatte geben. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Führen Sie nach der Inkubation 30 Minuten lang einen Zeitshake von 1800 RPM durch.

Dann fügen Sie 800 Mikroliter 20 Millimolar Tris Puffer mit 10 Millimolar Calciumchlorid zu jedem Brunnen auf der Probenplatte, um die Harnstoffkonzentration auf zwei Molaren zu verdünnen. Fügen Sie 20 Mikroliter Trypsin in die erste Reihe einer 96-Well-Platte und legen Sie die Platte an einer bestimmten Stelle auf dem Deck. Nachdem Sie das Trypsin auf die Probenplatte gesetzt haben, versiegeln und bebrüten Sie es 15 Stunden bei 37 Grad Celsius und 600 Umdrehungen pro Minute auf dem Heiz- und Kühlgerät.

Stoppen Sie die Verdauung, indem Sie 150 Mikroliter 5%Ameisensäure aus Reihe drei der Ameisensäureplatte ansaugen und an die Probenplatte in den Zeilen eins und zwei abgeben. Fahren Sie fort, um die Peptide zu entsalzen. Verwenden Sie 1070 Mikroliter-Spitzen, um 600 Mikroliter Acetonitril zu aspirieren.

Geben Sie es dann in den Zeilen eins und zwei der Festphasenextraktion oder SPE-Platte aus, um C-18 zu aktivieren. Als nächstes laden Sie die verdaute Probe in zwei Durchgängen auf die SPE-Platte. Laden Sie zwei Reihen von Spitzen, aspirieren Sie 534 Mikroliter der verdauten Proben und geben Sie sie an die Reihen eins und zwei der SPE-Platte.

Drücken Sie auf die Platte und wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Proben geladen sind. Reinigen Sie die Peptide durch Waschen mit Wasser und verdünnen Sie die Peptide mit 60 bis 40 Acetonitril in 0,1% Ameisensäure. Legen Sie dann die Platte auf eine Sammelplatte, um die Peptide mit dem Positivdruckgerät zu entschärfen.

Zeichnen Sie den Durchfluss herunter und richten Sie die erforderlichen Tipps und Labware in der Software ein, kreuzen Sie die Seite mit dem Decklayout ab, und klicken Sie auf Weiter, um das Protokoll für die Dimethylierung fortzusetzen. Die Peptide in 1%essigsäure rekonstituieren. Zur Durchführung der Dimethylierungskennzeichnung 90 Mikroliter-Spitzen laden und 16 Mikroliter 60 Millimolar-Lichtformaldehyd aus der zweiten Reihe der Reagenzplatte zwei absaugen.

Geben Sie es, um eine der Probenplatte zu rudern, dann entladen Sie die Spitzen. Laden Sie eine Reihe von 90 Mikroliter-Spitzen und aspirieren Sie 16 Mikroliter 60 Millimolar schweres Formaldehyd aus Reihe drei der Reagenzplatte zwei. Geben Sie es Zeile zwei der Probenplatte und entladen Sie die Spitzen.

Laden Sie zwei Reihen von 90 Mikroliter-Spitzen und aspirieren Sie 16 Mikroliter 24 Millimolar Natriumcyanoborohydrid und 24 Millimolar Natriumcyanoborodeuterid aus den Reihen eins und zwei der Reagenzplatte drei, dann geben Sie die Reagenzien an die Reihen eins und zwei der Probenplatte, um die Dimethylierungsreaktion zu starten. Entladen Sie die Spitzen und verwenden Sie den Orbital-Shaker, um einen zeitgetisten Shake für 15 Minuten bei 1800 RPM durchzuführen. Dann zwei Reihen von 90 Mikroliter Spitzen laden und 32 Mikroliter 1%Ammoniak aus den Reihen drei und vier der Reagenzplatte drei aspirieren.

Geben Sie es in die Reihen eins und zwei der Probenplatte zwei, um die Reaktion zu stoppen. Kombinieren Sie gleiche Mengen an leichten und schweren dimethylierten Peptiden in einer neuen zwei Milliliter tiefen Brunnenplatte zum Entsalzen. Nach dem Entsalzen der kombinierten leichten und schweren Peptide trocknen Sie die Peptide aus und führen Sie isobaric Tagging durch.

Rekonstituieren Sie die Peptide mit 100 Mikrolitern 100 Millimolar Triethylmonium BicarbonatPuffer auf einem Orbitalshaker. Dann verwenden Sie 90 Mikroliter-Spitzen, um 25 Mikroliter der kombinierten dimethylierten Peptide zu aspirieren und in die erste Reihe der TMT-Verarbeitungsplatte zu geben. Laden Sie eine Reihe von 90 Mikroliter-Spitzen und aspirieren Sie 10 Mikroliter TMT.

Geben Sie es in der ersten Reihe der TMT-Verarbeitungsplatte, entladen Sie die Spitzen, und führen Sie dann einen zeitgezeitigten Shake für eine Stunde bei 1800 RPM durch. Acht Mikroliter Hydroxylamin aus Reihe zwei der TEAB-Platte ansaugen und für eine der TMT-Verarbeitungsplatten abgeben. Nach einem 15-minütigen Schütteln bei 1800 U/min 30,5 Mikroliter der TMT-markierten Peptide in ein 1,5-Milliliter-Rohr übertragen.

Fahren Sie dann mit der Datenerfassung und -analyse gemäß den Manuskriptrichtungen fort. Repräsentative MS-Daten eines Peptids, das in allen 22 Reporterionenkanälen aus einem 22 Plex kombinierten Vorläufer-Isotop-Etikettierung und einem isobarischen Tagging-Experiment identifiziert wurde, werden hier gezeigt. Die Sequenz des Peptids entspricht Betain-Homocystein-S-Methyltransferase.

Die intensivsten Fragmentionen sowohl für die leichten als auch für die schweren dimethylierten Spitzen wurden für die MS3-Fragmentierung weiter isoliert. Die Ionenintensitäten des Reporters stehen in direktem Verhältnis zur Peptidfülle in der Probe. Insgesamt reduzierte dieses kombinierte Vorläufer-Isotop-Etikettierungs- und isobarische Tagging-Experiment die Probenverarbeitungszeiten und ermöglichte es, die Proteinexpression über mehrere Kanäle oder Bedingungen hinweg zu visualisieren.

Das Box-Plot von Log 10 Fülle im Vergleich zu gesamt Reporterionenintensitäten auf allen 22 Kanälen zeigt eine geringere Inter-Well- oder Inter-Sample-Variabilität. Die Bewertung der Gesamtautomatisierung erfolgte durch die Untersuchung des Fehlers in der Reporterionenfülle über jedes Protein in den 22 Proben. Die Probenverarbeitung mit der Roboterplattform führte zu sehr niedrigen Variationskoeffizienten.

Über die 3098 Peptide hinweg betrug der durchschnittliche Variationskoeffizient in der Reporterionenfülle 12,36 bzw. 15,03 % bei leichten und schweren dimethylierten Peptiden. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig zu bedenken, dass isotopen- und isobarische Ebenen in einem einzigen Experiment verwendet werden. Daher muss sorgfältig geplant werden, um jede Probe mit den Tags zu bestimmen, die für das Experiment verwendet werden sollen.

Diese Methode kann leicht in andere Robotersysteme integriert werden, und es kann auf eine Vielzahl von Geweben angewendet werden, wie Gewebe oder Zelllysate und andere Biofluide.