Kontinuierliches Video-Elektroenzephalogramm während Hypoxie-Ischämie bei neonatalen Mäusen

Die hypoxische ischämische Enzephalopathie ist die häufigste Ursache für neonatale Anfälle. Dieses Mausmodell für hypoxische ischämische Anfälle und die kontinuierliche Video-Elektroenzephalographie (EEG) können dazu beitragen, unser Verständnis und unsere Charakterisierung von neonatalen Anfällen zu verbessern. Diese Technik erleichtert die Aufnahme von qualitativ hochwertigen Video-Elektroenzephalographie-Aufzeichnungen in einem neonatalen Verletzungsmodell und kann bei zukünftigen Studien der Mechanismen von neonatalen Anfällen, Ergebnissen und therapeutischen Tests hilfreich sein.

Das Verfahren wird von Pravin Wagley vorgeführt. Ein Laborspezialist aus meinem Labor. Für die Elektrodenimplantationschirurgie.

Nachdem Sie bestätigt haben, dass bei einer anästhesierten Maus nach der Geburt am neunten Tag kein Ansprechen auf den Schmerzreflex vorliegt, platzieren Sie die Maus in einem stereotaktischen Stadium mit einem Nasenkonus und verwenden Sie die Rückseite des Ohrbügels, um den Kopf ruhig zu halten. Sterilisieren Sie den Inzisionsbereich am Schädel mit drei abwechselnden Betain- und 70%Ethanol-Peelings und verwenden Sie ein gefenstertes Tuch, um die Maus abzudecken, während der Inzisionsbereich sichtbar bleibt. Öffnen Sie die Kopfhaut vorder-posterior leicht über den Augen und ziehen Sie etwa einen halben Zentimeter der Haut zurück.

Positionieren Sie den Kopf wieder auf der stereotaktischen Bühne, so dass die Haut nach außen zieht, um den Schädel freizulegen, und tragen Sie mit einem Wattestäbchen Wasserstoffperoxid auf. Kratzen Sie den Schädel mit einer Skalpellklinge vorsichtig sauber. Und tragen Sie einen ca. 50 Mikroliter großen Tropfen Kleber auf den Knochen auf.

Verteilen Sie den Kleber mit dem Applikator auf dem Schädel und halten Sie ihn 40 Sekunden lang unter ultraviolettes Licht. Wenn der Kleber ausgehärtet ist, messen Sie die Koordinaten anhand des freiliegenden Bregmas als Referenz. Und verwenden Sie eine 32-Gauge-Nadel, um Elektrodenlöcher bilateral in der CA1-Region des Hippocampus, bilateral in der parietalen Hirnrinde und im Kleinhirn zu erzeugen.

Reinigen Sie das Blut von der Oberfläche des Schädels und verwenden Sie den stereotaktischen Arm, um die Elektroden, die an der Steckdose befestigt sind, in das Gehirn abzusenken. Implantieren Sie jede Elektrode in das Gehirn und fixieren Sie die Elektroden mit Zahnacryl. Kleben Sie den Steuersatz mit zusätzlichem Dentalacryl auf den Schädel.

Injizieren Sie subkutan fünf Milligramm pro Kilogramm Ketoprofen in jeden Welpen. Wenn alle Elektroden in mindestens der Hälfte des Wurfes befestigt sind, geben Sie die Welpen der Mutter zurück. 24 Stunden nach der Elektrodenimplantation legen Sie jedes Tier für die EEG-Aufzeichnung in eine 37 Grad Celsius heiße Plexiglaskammer und verwenden Sie ein flexibles, speziell angefertigtes Operationsverstärkerkabel, um die Welpen an ein Video-EEG-Überwachungssystem anzuschließen.

Verwenden Sie einen mehrkanaligen Differenzverstärker, um die EEG-Daten bei 1000 Hertz mit einer Verstärkung von einem Kilo zu digitalisieren und das EEG-Signal in einer entsprechenden Analysesoftware zu überprüfen. Nehmen Sie dann 30 Minuten lang ein EEG vor der Verletzung auf, bevor Sie die Tiere für das Rechtsverfahren wegen der Halsschlagader vom Netz trennen. Nach der Aufzeichnung der EEG-Ausgangsdaten wird die Haut zwischen dem Unterkiefer und dem Schlüsselbein auf der linken Seite des Halses wie gezeigt mit Betain und Ethanol sterilisiert.

Und machen Sie einen etwa einen Zentimeter großen Schnitt auf der linken Seite des Halses. Legen Sie den Welpen unter ein Präpariermikroskop und ziehen Sie das Unterhautgewebe und die Haut vorsichtig zurück, um die Halsschlagader freizulegen. Legen Sie ein fünf Zentimeter langes Stück sterile Seidennaht unter die Arterie.

Identifizieren Sie den Vagusnerv und trennen Sie den Nerv vorsichtig von der Arterie und ziehen Sie ihn zurück. Manövrieren Sie die Naht so, dass sie sich nur unter der Arterie befindet. Nachdem Sie den Vagusnerv identifiziert haben, trennen und ziehen Sie den Nerv vorsichtig von der Arterie zurück und fädeln Sie mit einer Mikrozange ein fünf Zentimeter langes Stück sterile Seidennaht unter die Arterie.

Binden Sie eine doppelt verknotete Naht um die Arterie, um den Fluss zu verschließen und die überschüssige Naht zu durchtrennen. Ersetzen Sie das Unterhautgewebe und die Haut über der freiliegenden Arterie und verwenden Sie Vetbond, um den Schnitt zu versiegeln. Setzen Sie dann das Tier wieder auf eine kontinuierliche EEG-Überwachung in eine Kammer bei Raumtemperatur, die auf eine wärmende Matratze gestellt wird, und führen Sie stichprobenartige Infrarot-Temperaturkontrollen der Kerntemperatur des Welpen durch, um ein Öffnen der Kammer zu vermeiden.

Nachdem Sie die Welpen eine Stunde lang mit kontinuierlicher Überwachung des eingeatmeten Sauerstoffs erholt haben, spülen Sie die Kammer mit 60 Litern 100 % Stickstoff pro Minute und 0,415 Litern 100 % Sauerstoff pro Minute. Sobald die Sauerstoffsättigung in der Kammer 12% erreicht, verringern Sie den Stickstofffluss auf 10 Liter pro Minute, während der Sauerstofffluss unverändert bleibt. Nehmen Sie bei Bedarf kleine Anpassungen vor und halten Sie den Anteil des eingeatmeten Sauerstoffs 45 Minuten lang bei 8 %.

Nach 45 Minuten Hypoxie-Exposition wird der Anteil des eingeatmeten Sauerstoffs wieder auf 21 % gebracht und die Welpen können sich in der Kammer mit EEG-Überwachung zwei Stunden lang erholen. Trennen Sie die Mäuse am Ende des Aufzeichnungszeitraums vom EEG-System und geben Sie die Jungen an die Mutter zurück. Video-EEG-Aufzeichnungen ermöglichen es, elektrografische Befunde mit dem Verhalten auf Video zu korrelieren.

Die Mehrzahl der in diesem Modell beobachteten Ereignisse beinhaltet fokale einseitige oder gemischte Verhaltensweisen. Während der hypoxischen Periode zeigt eine Untergruppe von Mäusen typischerweise eine nicht zwanghafte Anfallsaktivität, während der die Jungtiere unbeweglich sind und eine anhaltende Anfallsaktivität im EEG aufweisen. In dieser Analyse war die Ausgangsaktivität ähnlich wie der zuvor beschriebene Hintergrund bei P 10 Maus-Welpen.

Nach einem Rechtsstreit und vor Beginn der Hypoxie zeigte eine Untergruppe von Mäusen krampfhafte Anfälle. Nach der Hypoxie-Induktion war die Hintergrundamplitude im EEG reduziert. Und es wurden intermittierende Ausbrüche von Spike-Wellen-Entladungen gezeigt, gefolgt von einer Unterdrückung.

Die Mäuse zeigten elektrographische Anfälle, die aus einem unterdrückten Hintergrund als rhythmische Spike-Wellen-Entladungen hervortraten, die mit Polys-Spike-Wellen komplexer und häufiger wurden. Während der Hypoxie zeichnet sich die Leistungsspektrogrammanalyse durch Asymmetrien zwischen der ischämischen und der kontralateralen Hemisphäre aus. Die ischämische Hemisphäre weist ein Burst-Suppressionsmuster auf, und die kontralaterale Hemisphäre weist einen unterdrückten Hintergrund auf.

Während der Reoxygenierung und Genesung hat eine Untergruppe von Mäusen für den Rest des Aufzeichnungszeitraums weiterhin Anfälle. Der EEG-Hintergrund ist im Vergleich zum Ausgangswert nach einer Hypoxie unterdrückt, wobei eine allmähliche Erholung während der Aufzeichnung nach der Hypoxie beobachtet wird. Bei der Arbeit mit neugeborenen Welpen ist Präzision der Schlüssel.

Darüber hinaus sollte besonders darauf geachtet werden, die Welpen nach den chirurgischen Eingriffen in Gruppen wieder bei der Mutter unterzubringen. Die Video-Elektroenzephalographie kann bei Neugeborenen in Verbindung mit Histopathologie, Bildgebung und Verhalten eingesetzt werden, um die Auswirkungen von neonatalen Anfällen auf Verletzungsoperationen und Verhaltensergebnisse zu untersuchen.