Verdauung von Ganzmausaugen für multiparameterflow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagozyten

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um ganze Mausaugen in eine Einzelzellsuspension für die Multiparameter-Durchflusszytometrie von mononukleären Phagozyten zu verdauen, zu denen Makrophagen, Monozyten, Mikroglia und dendritische Zellen gehören. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, eine quantitative Analyse mit Fluorophorintensität zu verwenden, um eng verwandte Zelltypen anhand der Expression von Zelloberflächenmarkern zu unterscheiden. Unser Protokoll ist optimiert für die Analyse der Makrophagenheterogenität, einschließlich sowohl residenter als auch infiltrierender Populationen im laserinduzierten choroidalen Neovaskularisationsmodell.

Diese Konzepte und Techniken können jedoch auch auf andere Modelle wie diabetische Retinopathie, experimentelle autoimmune Uveitis sowie Manifestationen von Lupus angewendet werden. Wenn Sie dieses Protokoll ausprobieren, ist das Verständnis der Konfiguration Ihres Zytometers ein wichtiger Ausgangspunkt, da nicht alle Zytometer auf genau die gleiche Weise konfiguriert sind. Daher müssen möglicherweise Volumina fluoreszierend konjugierter Antikörper titriert und/oder Fluorophore angepasst werden, um das Protokoll basierend auf der Konfiguration Ihres Zytometers zu optimieren.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Verdauungspuffers gemäß den Anweisungen des Manuskripts. Entfernen Sie mit einem Präpariermikroskop und einer 10-fachen Gesamtvergrößerung die verbleibende Bindehaut und den Sehnerv aus den Augen. Bewegen Sie die sauberen Augen in eine trockene Präparierschale oder ein kleines Waagschiffchen und machen Sie dann zwei perforierende Wunden mit einem 90-Grad-Winkel zwischen ihnen durch die Sehachse.

Verwenden Sie eine Spritze mit einer 30-Gauge-Nadel, um 0,15 bis 0,2 Milliliter Verdauungspuffer in die Glaskörperhöhle jedes Auges zu injizieren. Zerkleinern Sie die Augen mit einer Federschere und einer feinen Pinzette und dissoziieren Sie dann das Linsengewebe mit stumpfen mechanischen Unterbrechungen, um ein Verstopfen der Pipettenspitzen in den nachfolgenden Schritten zu verhindern. Spülen Sie die Pinzette und die Schere mit 0,75 Millilitern Aufschlusspuffer und tauschen Sie die Schale für jede Probe aus.

Übertragen Sie den Inhalt der Schale mit einer P1000-Pipette in ein Dissoziationsröhrchen auf Eis und achten Sie darauf, dass kein Material verloren geht. Spülen Sie die Schale mit weiteren 1,5 Millilitern Aufschlusspuffer aus und geben Sie ihn in das Dissoziationsröhrchen, so dass das Gesamtvolumen zwischen 3,25 und 3,5 Milliliter liegt. Dissoziieren Sie das Gewebe auf einem elektronischen Dissoziator, wie im Textmanuskript beschrieben, und stellen Sie sicher, dass sich das gesamte Gewebe am Boden des umgekehrten Dissoziationsröhrchens befindet und mit dem Verdauungspuffer in Kontakt steht.

Dann inkubieren Sie das Dissoziationsröhrchen bei 37 Grad Celsius und 200 U/min für 30 Minuten. Wiederholen Sie die Dissoziation des Gewebes noch zwei weitere Male und inkubieren Sie die Probe zwischen den Dissoziationen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 200 U/min. Um die Reaktion zu stoppen, fügen Sie 10 Milliliter Kaltflusspuffer hinzu und stellen Sie die Probenröhrchen auf Eis.

Um eine Einzelzellsuspension herzustellen, seihen Sie die gestoppte Augenverdauungsreaktion durch einen 40-Mikrometer-Filter, der auf einem konischen 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen platziert ist. Verwenden Sie den Kolben einer 2,5-Milliliter-Spritze, um alle verbleibenden Stücke unverdauten Augengewebes durch den Filter zu drücken. Waschen Sie das Dissoziationsrohr mit 10 Millilitern Strömungspuffer und spülen Sie den Filter aus.

Verwenden Sie dann denselben Kolben, um die unverdauten Augengewebeteile erneut durch den Filter zu führen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit fünf Millilitern Fließpuffer. Waschen Sie dann das Dissoziationsrohr und den Filter mit abschließenden 10 Millilitern Strömungspuffer.

Das konische Röhrchen bei 400 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand dekantieren, ohne das Küvettenpellet zu stören. Brechen Sie das Kügelchen auf, indem Sie das Rohr gegen ein anderes Rohr schnippen. Fügen Sie dann einen Milliliter Lysinglösung hinzu und schwenken Sie das Röhrchen 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur, um die roten Blutkörperchen zu lysieren.

Stoppen Sie die Reaktion mit 20 Millilitern Fließpuffer und zentrifugieren Sie das konische Röhrchen bei 400 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Dekantieren Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören. Schnippe das Rohr gegen ein anderes Rohr.

Fügen Sie dann fünf Milliliter kaltes HBSS hinzu. Wiederholen Sie die Zentrifugation und entfernen Sie den Überstand. Geben Sie mit einer P1000-Pipette 0,5 Milliliter Lebendfleck in jede Probe und achten Sie darauf, dass das Pellet vollständig dissoziiert wird.

Füllen Sie die Proben in 1,2-Milliliter-Mikrotiterröhrchen und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang im Dunkeln. Zählen Sie in der Zwischenzeit ein 10-Mikroliter-Aliquot der Probe mit Trypanblau und einem Hämozytometer. Waschen Sie nach der Inkubation jede Probe, indem Sie 400 Mikroliter Kaltflusspuffer hinzufügen.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen in einem Mikrotiter-Röhrchengestell bei 400-fachem G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und saugen Sie den Überstand an, ohne das Zellpellet zu stören. Resuspendieren Sie die Zellen vollständig in 500 Mikrolitern Kaltflusspuffer. Wiederholen Sie dann die Zentrifugation und entfernen Sie den Überstand.

Blockieren Sie bis zu fünf Millionen lebende Zellen in 50 Mikrolitern FC-Block. Dissoziieren Sie das Zellpellet vollständig und inkubieren Sie es 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Geben Sie dann 50 Mikroliter Antikörper-Färbelösung zu jeder Probe.

Mischen Sie es vollständig und inkubieren Sie es weitere 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Hier werden die Eigenschaften des Vorwärtsstreubereichs im Vergleich zum Seitenstreubereich für alle analysierten Ereignisse von zwei Augen einer einzelnen Maus angezeigt. Die Bead-Zählungen wurden bereinigt und bestätigt, indem PE über APC-Cy7 aufgetragen wurde, wodurch ein enger Cluster von PE-positiven und APC-Cy7-negativen Ereignissen entstand.

Als nächstes wurden Einzellinge in lebenden Zellen aus allen Ereignissen identifiziert. Singuletts waren positiv in der Vorwärtsstreuhöhe mit der Vorwärtsstreufläche korreliert, während Dublett- und Triplettzellen eine größere Vorwärtsstreufläche als eine Vorwärtsstreuhöhe aufwiesen. Lebende Zellen sind positiv im Vorwärtsstreubereich und negativ im Lebendfleck.

Die erste Gating-Strategie zur Abgrenzung von mononukleären Phagozyten aus lebenden Singulettzellen wird hier gezeigt. Lebende Einzelgewichte wurden mit einem CD45 versus CD11b-Plot visualisiert. Das Fehlen von CD45-positiven Zellen im CD45-FMO bestätigte die Gate-Selektion.

Als nächstes wurden Neutrophile, Eosinophile, B-Zellen und K-Zellen sowie T-Zellen ausgeschlossen, indem CD45-positive lebende Einzelzellen mit Lineage-Gate gegen CD11b aufgetragen wurden. CD45-dim-Zellen wurden von CD45-hohen Zellen unterschieden. Makrophagen-Untergruppen wurden ebenfalls identifiziert.

Mikroglia wurden in den CD45-dim Zellen mit CD64-positiver MHC2-niedriger Färbung abgegrenzt. MHC2-negative Makrophagen wurden als CD64-positive MHC2-negative identifiziert. CD11c-negative und CD11c-positive Makrophagen wurden als CD64-positive CD11c-negative nachgewiesen.

und CD64-positives CD11c-positives in den MHC2-positiven Zellen. Es zeigte sich, dass die Laserbehandlung die Anzahl der MHC2-negativen, CD11c-negativen und CD11c-positiven Makrophagen erhöhte. Die Anzahl der dendritischen Zellen wurde durch die Laserbehandlung ebenfalls hochreguliert, während die Anzahl der Mikroglia und Monozyten nicht beeinflusst wurde.

Die systemische Perfusion hatte keinen Einfluss auf die Anzahl der Makrophagen. Nach diesem Verfahren ermöglicht die Floreszenz-aktivierte Zellsortierung anstelle der alleinigen Analyse die Charakterisierung der Makrophagenheterogenität und ihrer Auswirkungen auf die Funktion durch transkriptomische oder proteomische Studien.