Eine Pipeline mit bilateraler Utero-Elektroporation zur Vernehmung genetischer Einflüsse auf das Nagetierverhalten

Mit dieser Methode kann entdeckt werden, wie bestimmte Veränderungen der Genexpression auf Pathologien zurückzuführen sind, die mit neurologischen Erkrankungen verbunden sind. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Notwendigkeit umgeht, genetische Tierlinien zu erzeugen oder zu kaufen, deren Erstellung und Validierung Jahre dauern kann. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Genen, die an neurologischen Störungen beteiligt sind.

Die Bestimmung, wie bestimmte Gene zur Pathologie beitragen, ist ein wichtiger Schritt bei der Entwicklung neuartiger Therapien. Der Vorteil dieses Protokolls besteht darin, dass man lernt, die Embryonen so zu manipulieren, dass der Experimentator den Schritt des Gentransfers durchführt, ohne die Überlebensraten zu verringern. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da die Embryonen sehr zerbrechlich sind, so dass es hilfreich ist, zu beobachten, wie ein erfahrener Experimentator sie während des Eingriffs manipuliert.

Bringen Sie trächtige Muttertiere mindestens 30 Minuten vor der Operation in den Operationsbereich. Sterilisieren Sie die gesamte Operationsstelle mit sterilisierten keimtötenden Tüchern und anschließend 70 % Ethanol. Sterilisieren Sie dann die Autoklavenwerkzeuge in einem Glasperlensterilisator.

Füllen Sie steriles PBS in konische 50-Milliliter-Röhrchen und legen Sie die Röhrchen in ein auf 38 bis 40 Grad Celsius erhitztes Wasserbad. Überprüfen Sie die Temperatur der sterilen Kochsalzlösung mit einem Thermometer. Schalten Sie die Warmwasserbereitungsumwälzpumpe so ein, dass sie auf 37 Grad Celsius erwärmt wird.

Schalten Sie dann den Druckinjektor und den Elektroporator ein und stellen Sie die ordnungsgemäße Funktion sicher. Schleudern Sie die Plasma-DNA-Lösung kurz auf einer Tischzentrifuge und legen Sie sie auf Eis. Ziehen Sie Glaspipetten an einem Pipettenabzieher, so dass die Spitze der gezogenen Glaspipette einen Durchmesser von etwa 50 Mikrometern hat.

Füllen Sie dann die Pipette mit 20 bis 40 Mikrolitern DNA-Lösung. Bereiten Sie alle notwendigen Gegenstände für die Operation vor, einschließlich Haarentfernungslotion, Jod, 70%Ethanol, Wattestäbchen, Augentropfen, Nähte und Gaze. Bereiten Sie ein OP-Blatt vor und füllen Sie die erforderlichen Informationen aus.

Wiegen Sie die Maus vor der Operation und notieren Sie das Gewicht. Verabreichen Sie nach der Betäubung der Maus präoperative Analgetika und entfernen Sie das Fell vom Bauch mit Haarentfernungscreme oder einem Rasierer. Sterilisieren Sie den Bauch, indem Sie ihn dreimal mit Povidon, Jod und 70% Ethanol abtupfen.

Schaffen Sie ein steriles Feld um den Bauch mit steriler Gaze und Abdeckung. Machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie in der Bauchhaut, während Sie die Haut mit einer Pinzette anheben, um einen Schnitt durch den Muskel zu vermeiden. Hebe dann den Muskel an und durchtrenne ihn, wobei du darauf achtest, dass keine lebenswichtigen Organe durchtrennt werden.

Ziehen Sie die Gebärmutterhörner vorsichtig mit einer Ringzange aus dem Damm und legen Sie sie vorsichtig auf das sterile Feld, wobei Sie darauf achten, dass sie mit Polstern gestützt sind und nicht zu weit vom Damm weg ziehen. Halten Sie das Gebärmutterhorn während des restlichen Eingriffs mit dem vorgewärmten sterilen PBS feucht. Positionieren Sie einen Embryo entweder mit einer Pinzette oder mit den Fingern, führen Sie dann die gezogene Glaspipette vorsichtig in die seitliche Vertikale ein und injizieren Sie zwei bis drei Mikroliter in jeden Ventrikel, indem Sie die Pipette in den einen und dann in den anderen Ventrikel einführen.

Der Ventrikel wurde erfolgreich anvisiert, wenn nach der Injektion eine sichelförmige Form vorhanden ist. Um Zellen in der frontalen Hirnrinde bilateral zu transfizieren, positionieren Sie die beiden negativen Elektroden an den Seiten des Embryokopfes knapp lateral und leicht kaudal zu den lateralen Ventrikeln und positionieren Sie die positive Elektrode zwischen den Augen direkt vor der sich entwickelnden Schnauze. Stellen Sie sicher, dass der Embryo großzügig befeuchtet wird, und geben Sie vier Quadratimpulse.

Injizieren und elektroporieren Sie alle Embryonen, einen nach dem anderen, so dass jeder Embryo unmittelbar nach der Injektion der DNA-Lösung elektroporiert wird. Sobald alle Embryonen elektroporiert wurden, führen Sie die Gebärmutterhörner vorsichtig wieder in die Bauchhöhle ein. Beschichten Sie die Bauchhöhle mit sterilem PBS, um die Platzierung des Gebärmutterhorns zu erleichtern.

Füllen Sie die Bauchhöhle mit sterilem PBS, so dass nach Abschluss der Naht keine Lufteinschlüsse zurückbleiben. Nähen Sie den Muskel mit resorbierbaren Nähten und die Haut mit nicht resorbierbaren Seidennähten. Lassen Sie den Damm mindestens eine Stunde lang in einer beheizten Kammer vollständig erholen.

Überprüfen Sie die Dämme regelmäßig in den nächsten 48 Stunden. Wenn sich der Damm von der Narkose erholt und das Bewusstsein wiedererlangt, beginnt er sich zu bewegen und zu schlagen. Diese Methode wurde verwendet, um etwa 5.000 Pyramidenneuronen der Schicht 2/3 mit dem pCAG-GFP-Plasmid zu transfizieren.

Die meisten dieser Zellen waren in den frontalen kortikalen Regionen lokalisiert. Ein repräsentatives Beispiel zeigt die rostrale kaudale Verteilung von transfizierten Neuronen in einer adulten Kontrollmaus, was die Fähigkeit bilateraler IUEs bestätigt, große Populationen von Pyramidenneuronen im frontalen Kortex anzuvisieren und genetisch zu markieren. Der erste Teil der maternalen Interaktionsaufgabe testet die Fähigkeit von Kontroll-P18-transfizierten Mäusen, Nestbett zu finden.

Kontrollmäuse verbrachten mehr Zeit damit, ihre Nestbett zu erkunden als frische Einstreu, was darauf hindeutet, dass sie über intakte sensomotorische Fähigkeiten und Erkundungsverhalten verfügen. Der zweite Teil der Aufgabe macht sich die Tendenz von Mäusen zunutze, motiviert zu sein, mit ihrer Mutter zu interagieren. Bei dieser Aufgabe verbrachten die Welpen die meiste Zeit in der Nähe ihrer Mutter, während sie deutlich weniger Zeit damit verbrachten, den leeren Becher oder die Nestbett zu erkunden.

Erwachsene Kontrollmäuse verbrachten etwa 35 % der Zeit mit der Erkundung eines neuen Objekts. Wenn erwachsene Mäuse mit einem neuen und einem vertrauten Objekt konfrontiert wurden, verbrachten sie mehr Zeit damit, das neuartige Objekt zu erkunden. In der Geselligkeitsaufgabe verbrachten erwachsene Kontrollmäuse ähnlich viel Zeit damit, eine neuartige Maus und einen leeren Becher zu erkunden.

Dieses Verhalten wurde automatisch mit der DeepLabCut-Software verfolgt, indem verschiedene Punkte auf einer Maus beschriftet wurden, darunter die Gliedmaßen, der Schwerpunkt, der Kopf und die Ohren. Die Software wurde auch verwendet, um zu bestimmen, wann sich Mäuse aufziehen, indem die Länge des Körpers der Maus untersucht wurde, da dieser Abstand kürzer wird, wenn sich die Maus aufbäumt. Nach diesem Verfahren können viele zelluläre molekulare Fragen beantwortet werden, indem das Gewebe untersucht und verschiedene Messungen wie die Dichte der Wirbelsäule oder die Expressionsniveaus verschiedener Proteine untersucht werden.