Fokussierte ultraschallinduzierte Öffnung der Blut-Hirn-Schranke zur gezielten Behandlung von Hirnstrukturen und zur Beurteilung der chemogenetischen Neuromodulation

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die für die Genabgabe durch fokussierte Ultraschallöffnung der Blut-Hirn-Schranke (BHS), die Bewertung der resultierenden Genexpression und die Messung der Neuromodulationsaktivität chemogenetischer Rezeptoren durch histologische Tests erforderlich sind.

Unser Protokoll ermöglicht die submillimetergenaue Ausrichtung von fokussiertem Ultraschall bei Mäusen. Es ermöglicht uns, Ultraschall mit kostengünstigen 3D-gedruckten Teilen zu verwenden, ohne dass chirurgische oder MRT-kompatible Ultraschallgeräte verwendet werden müssen. Die Öffnung der Blut-Hirn-Schranke mit fokussiertem Ultraschall kann anfangs recht knifflig sein.

Es ist wichtig, dass der Schallkopf mit entgastem Gel oder Wasser ordnungsgemäß mit dem Tier gekoppelt ist und dass die Mikroblasen während der Injektion nicht kollabieren. Das Verfahren wird von Richard Li, einem Doktoranden am Caltech, vorgeführt. Nachdem Sie bestätigt haben, dass bei einer anästhesierten Maus keine Reaktion auf den Pedalreflex vorliegt, verwenden Sie 10 Einheiten pro Milliliter heparinisierte Kochsalzlösung, um einen sauberen Katheter mit 25 bis 35 Gauge zu waschen, und verwenden Sie ein Ethanol-Pad, um den Schwanz des Tieres zu desinfizieren.

Führen Sie den Katheter in eine seitliche Schwanzvene ein und verwenden Sie Gewebekleber, um den Katheter an Ort und Stelle zu halten. Wenn die Nadel richtig platziert wurde, ist ein Rückfluss von Blut im Katheter zu beobachten. Wenn der Kleber getrocknet ist, entfernen Sie die Haare auf dem Kopf des Tieres mit Enthaarungscreme und setzen Sie die Maus in einen 3D-gedruckten MRT-Wagen, indem Sie die Vorderzähne auf einer Beißstange montieren, wobei sich der Kopf in einem Nasenkegel befindet.

Befestigen Sie die abgestumpften Stangen mit einem sicheren Druck am Schädel und beobachten Sie die Atmung 30 Sekunden lang, um zu bestätigen, dass das Tier mit einer Geschwindigkeit von einem Atemzug pro Sekunde frei atmet. Verbinden Sie die Zielführung mit den Ohrbügeln und kontrollieren Sie die Atmung erneut. Setzen Sie den MRT-Schlitten in eine MRT-Halterung ein und platzieren Sie die Halterung in der Bohrung eines Magneten.

Nehmen Sie dann eine MRT-Sequenz auf, um die Maus im Scanner zu lokalisieren, und verwenden Sie die schnelle 3D-Aufnahmesequenz aus dem niedrigen Winkel, um das gesamte Gehirn abzubilden. Um eine MRT-gesteuerte Zielerfassung durchzuführen, platzieren Sie den Schlitten in einem stereotaktischen Instrument und verwenden Sie einen Metallblock mit doppelseitigem Klebeband, um den Block an zwei Stützpfosten des stereotaktischen Instruments zu befestigen. Übertragen Sie die MRT-Bilder auf einen Computer, auf dem eine Software zur gezielten Ultraschallführung läuft, und öffnen Sie die Bilder.

Wenn alle Bilder geladen wurden, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und klicken Sie auf Neuformatieren, um das Bild in drei Achsen neu zu formatieren. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um den Schallkopf in der zirkulären Zielhilfe zu lokalisieren. Passen Sie in der sagittalen Ansicht die vertikale Position des virtuellen Wandlers an, um die Dicke des Wasserbades und des Wandlergehäuses zu berücksichtigen.

Geben Sie die zu erreichenden Bereiche im Trajektorienplaner an und notieren Sie die Koordinaten in einer Tabelle. Wählen Sie die gewünschte Zieltiefe und notieren Sie sich die Koordinaten, wie zuvor gezeigt. Klicken Sie dann auf Trajektorie senden und ausführen, um die einzelnen Punkte als Ziel zu verwenden.

Um die Koordinaten eines MRT mit dem stereotaktischen Rahmen zu korrelieren, platzieren Sie den speziell montierten Schallkopf über einer Zielschablone und verschieben Sie, bis jeder der drei Zielbolzen sowohl durch den Schallkopfhalter als auch durch die Zielführung gehen kann. Vergewissern Sie sich, dass die Schrauben nicht unter Zug oder Neigung stehen, und verschieben Sie den Schallkopf 10,56 Millimeter nach vorne in anterior-posteriorer Richtung, bis sich der Schallkopf an der Stelle befindet, an der die Mitte einer Zielschablone auf dem MRT erscheint. Bestimmen Sie dann den Abstand von der Mitte des virtuellen Schallkopfs zum Zielbereich und verwenden Sie den Rahmen, um den Schallkopf auf diese Koordinaten zu bewegen.

Zur Herstellung der Injektionslösung 800 Mikroliter Kochsalzlösung und 100 Mikroliter MRT-Kontrastmittel in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen füllen und mischen. Bringen Sie anschließend eine nicht aktivierte Mikroblasenlösung auf Raumtemperatur, bevor Sie die Mikroblasen 45 Sekunden lang in einem Mikroblasen-Aktivierungsgerät aktivieren. Nach der Aktivierung werden langsam 100 Mikroliter Mikroblasen aus der Mitte der Lösung in eine Ein-Milliliter-Tuberkulinspritze gegeben, die mit einer 21-Gauge-Nadel ausgerüstet ist, und 80 Mikroliter der Mikroblasen in die Kontrastmittellösung gegeben.

Mischen Sie die vorbereitete Lösung, indem Sie das 1,5-Milliliter-Röhrchen 15 Sekunden lang vorsichtig umdrehen, um eine Flotation zu vermeiden. Am Ende des Mischens 200 Mikroliter der Mikroblasenlösung ohne Nadel in eine Spritze füllen und die Spritze umdrehen. Drücken Sie den Kolben zum Mischen und ziehen Sie ihn zurück und befestigen Sie eine 30-Gauge-Nadel an der Spritze, während sie noch invertiert ist.

Drücken Sie dann die Mikroblasenlösung langsam heraus, bis Tröpfchen am Ende der Nadel erscheinen. Sobald die Mikroblasen fertig sind, stellen Sie die Impulsdauer für die Insonation auf 10 Millisekunden ein, mit 120 Wiederholungen pro Sekunde, mit 0,3 bis 0,45 Megapascal Druck am Schädel. Entfernen Sie die Zielführung und tragen Sie entgastes Ultraschallgel auf den Mauskopf auf, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blasen entstehen.

Senken Sie den Schallkopf ab, bis er direkt auf dem flachen Teil des Ohrbügelhalters platziert ist, und stellen Sie die Koordinaten in die stereotaktischen Instrumente ein. Verdünnen Sie das interessierende Adeno-assoziierte Virus auf eine Konzentration von 0,5 bis 2 mal 10 bis 10 Viruspartikeln pro Gramm Körpergewicht und laden Sie die Viruspartikel in eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 30-Gauge-Nadel ausgestattet ist. Injizieren Sie die Lösung in den Schwanzvenenkatheter und injizieren Sie 80 Mikroliter der Mikroblasenlösung in die Maus.

Um die Öffnung der Blut-Hirn-Schranke mittels MRT zu beurteilen, nehmen Sie eine schnelle Schusssequenz aus niedrigem Winkel auf, wie gezeigt. Für die DREADD-Stimulation lösen Sie Clozapin-N-Oxid in steriler Kochsalzlösung in einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter auf und injizieren Sie es intraperitoneal. Beginnen Sie 15 bis 45 Minuten nach der Entbindung mit der Aufzeichnung der Verhaltensaktivität des Tieres.

Verwenden Sie für die Analyse der neuronalen Aktivierung Hirngewebe. Folgt man dem gezeigten Protokoll, kann eine T1-Signalverstärkung in der Hippocampusregion und in anderen Teilen des Gehirns erreicht werden. Wie bereits erwähnt, führt die Immunfärbung gegen mCherry zu einem zuverlässigeren Nachweis der DREADD-Expression. Bei diesem Verfahren ist darauf zu achten, die Mikroblasen schonend zu behandeln und sicherzustellen, dass das Tier während der MRT-Bildgebung und der Insonation stabil bleibt.