Charakterisierung von Immunzellen und proinflammatorischen Mediatoren im pulmonalen Milieu

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Veränderungen in der Lungenumgebung nach einem ischämischen Schlaganfall zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von 13 Lungenimmunzelltypen und 13 verschiedenen Zytokinen und Chemokinen in ein und derselben Maus mittels durchflusszytometrischer Analyse. Diese Methode wurde verwendet, um Veränderungen in der Lungenumgebung nach einem ischämischen Schlaganfall zu beurteilen.

Es kann aber auch dazu dienen, Veränderungen bei allergischen Reaktionen oder Infektionen zu untersuchen. Um eine transkardiale Ganzkörperperfusion durchzuführen, bestätigen Sie bei einer anästhesierten Maus eine fehlende Reaktion auf die Pedalreflexion und befestigen Sie die Maus auf einer chirurgischen Plattform. Befeuchten Sie das Fell mit 70% Ethanol, um die Fellverteilung in der Körperhöhle zu reduzieren, und machen Sie einen vertikalen Hautschnitt in der Mittellinie, um das intakte Bauchfell freizulegen und den Schnitt zu stoppen, sobald die Brusthöhle erreicht ist.

Verwenden Sie eine feine Dissektionsschere, um einen Mittellinienschnitt des Peritoneums zu machen, der an der Brusthöhle endet, bevor Sie das distale Ende des Brustbeins mit einer Pinzette greifen. Verwende die Schere, um das Zwerchfell zu durchtrennen, ohne das Herz, die Lunge oder das Gefäßsystem zu beschädigen. Wenn das darunter liegende Gewebe sichtbar ist, machen Sie einen Schnitt durch den Brustkorb und sichern Sie die Seiten der Rippen, so dass Herz und Lunge vollständig freigelegt sind.

Machen Sie vorsichtig einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof in der Nähe des Aortenbogens, der als Abfluss für die Perfusion dient, und führen Sie schnell, aber vorsichtig eine 25-Gauge-Nadel in die distale obere Oberfläche des linken Ventrikels ein. Sobald die Nadel an Ort und Stelle ist, spülen Sie vorsichtig 10 Milliliter kaltes PBS in das Herz. Das Gewebe sollte beginnen, sich von Blut zu befreien.

Wenn das gesamte Volumen abgegeben wurde, perfundieren Sie ein zweites 10-Milliliter-Aliquot kaltes PBS, bis die Leber ein hellbraunes Aussehen aufweist und die Lunge von einer rötlich-rosa zu einer meist weißen Farbe übergegangen ist. Entfernen Sie mit einer Pinzette und einer feinen Präparierschere vorsichtig das gesamte umgebende Gewebe, bevor Sie die Lungenlappen trennen und in eine Petrischale mit ein bis zwei Millilitern kalter Lungenzelle, Medium auf Eis, legen. Um das Lungengewebe für Multiplex-Bead-Arrays vorzubereiten, geben Sie 200 Mikroliter Kalthomogenisierungspuffer in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen mit drei sterilen 2,3-Milliliter-Zirkonoxid/Silica-Kügelchen und wiegen Sie den gewünschten Lungenlappen.

Übertragen Sie 50 bis 100 Milligramm Lungengewebe in das vorgekühlte Röhrchen mit den Kügelchen und dem Homogenisierungspuffer und homogenisieren Sie den Lappen mit einem Homogenisator auf Bead-Basis bei 4.000 Umdrehungen pro Minute für mindestens zwei Minuten. Wenn das Gewebe vollständig homogenisiert ist, zentrifugieren Sie das Röhrchen, um das Gewebe zu sedimentieren, und überführen Sie den Überstand in ein vorgekühltes 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen auf Eis. Für die Dissoziation des Lungengewebes wird das Lungenzellmedium vorsichtig aus dem verbleibenden Lungenlappen dekantiert und eine 25-Gauge-Nadel in das Gewebe eingeführt.

Injizieren Sie 200 bis 250 Mikroliter Volumen Dissoziationspuffer in jeden Lungenlappen, um die Lunge aufzublasen, bis jeder der Lappen zwei- bis dreimal injiziert wurde. Nach einer zweiminütigen Inkubation bei Raumtemperatur die Lunge mit einer feinen Präparierschere in kleine Stücke zerkleinern und die Gewebelösung in ein 15-Milliliter-Chronikröhrchen überführen. Geben Sie sechs Milliliter zusätzlichen Dissoziationspuffer in die Probe und wirbeln Sie sie eine Minute lang kräftig ein

Als nächstes inkubieren Sie die Gewebestücke 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und wirbeln sie alle sieben bis acht Minuten. Am Ende der Inkubation wirbeln Sie die Probe eine Minute lang kräftig und führen Sie die Probe durch ein 100-Mikron-Zellsieb, um unerwünschtes Binde- und Interstitielles Gewebe zu entfernen. Sammeln Sie das Gewebe durch Zentrifugation und resuspendieren Sie es mit fünf Millilitern kaltem Lungenmedium zum Pellet.

Zentrifugieren Sie die Probe erneut und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter kaltem Lungenmedium unter sanftem Vortexen. Filtern Sie dann die Zellen durch ein 100-Mikron-Sieb, bevor Sie sie zählen. Um die Immunzellpopulationen innerhalb des isolierten Lungengewebes zu bewerten, säen Sie ein- bis zweimal 10 bis sechste Power-Zellen-Antikörper in die entsprechende Anzahl von Vertiefungen mit einer runden 96-Well-Bodenplatte und disponieren Sie die Zellen durch Zentrifugation am Boden der Platte.

Geben Sie 25 Mikroliter des entsprechenden Antikörpercocktails in kaltem FACS-Puffer in jede Vertiefung und mischen Sie es mit sanftem Pipe-Petting. Nach 20 Minuten resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern kaltem FACS-Puffer pro Vertiefung und überführen Sie die Proben in einzelne fünf Milliliter Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit 150 Mikrolitern zusätzlichem FACS-Puffer pro Röhrchen. Analysieren Sie dann sofort die Proben auf einem Durchflusszytometer gemäß den standardmäßigen durchflusszytometrischen Analyseprotokollen.

In dieser repräsentativen Analyse wurden 13 verschiedene Populationen von Immunzellen in der Lunge mit drei Sätzen von fünf bis sieben Antikörperkombinationen identifiziert. Tote Zellen wurden anhand einer Lebendfärbung ausgeschlossen und die verschiedenen Immunzelltypen anhand der in der Tabelle aufgeführten Antikörper und Marker unterschieden. Alveoläre und interstitielle Makrophagen, CD103-positive und CD11B-positive dendritische Zellen und Eosinophile wurden im ersten Set identifiziert.

Proinflammatorische Monozyten und Neutrophile wurden im zweiten Set identifiziert und CD4- und CD8-positive T-Zellen, B-Zellen, plasmazytoide dendritische Zellen, NK-Zellen und NKT-Zellen im dritten Set identifiziert. Die Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen, der Prozentsatz der CD45-positiven Zellen und die Gesamtzahl der erhaltenen CD45-positiven Zellen waren zwischen Zellpopulationen, die wie gezeigt isoliert wurden, und Zellpopulationen, die unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Gewebedissoziators isoliert wurden, ähnlich. Darüber hinaus betrug der Prozentsatz des Zelltods bei CD45-positiven Zellen bei beiden Protokollen weniger als 10 %, was darauf hindeutet, dass das demonstrierte Protokoll eine hohe Ausbeute und eine hohe Zellqualität ohne die Hilfe eines automatisierten Gewebedissoziators ermöglicht.

Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines kommerziell erhältlichen Multiplex-Assays, gekoppelt mit einer durchflusszytometrischen Analyse, die Bestimmung der Konzentration von Chemokin in jeder Probe pro Milligramm Gewebe. Die Kollagenase D-Konzentration, die Inkubationszeit und die Temperatur, die während der Einzelzellisolierung verwendet werden, wirken sich entscheidend auf die Regeneration der Immunzellen aus.