Untersuchung der Flagellen-getriebenen Motilität in Escherichia coli durch Anwendung von drei etablierten Techniken in einer Serie
10. Mai 2020
Viele Bakterien verwenden Flagellen-getriebene Motilität, um ihre Umgebung zu navigieren und eine günstige Umgebung sowohl einzeln als auch als Kollektiv zu besiedeln. Demonstriert wird hier die Verwendung von drei etablierten Methoden, die Die Motilität als Selektionswerkzeug nutzen, um Komponenten / Pfade zu identifizieren, die zur Schwimm- und Schwarmmotilität beitragen.
Die in diesem Video demonstrierten Protokolle können in jedem Labor der Welt reproduziert werden. In Kombination stellen sie einen systematischen und leistungsfähigen Ansatz zur Charakterisierung der bakteriellen Flagellummotilität dar. Motilität ist ein entscheidender Aspekt der bakteriellen Verbreitung und des Überlebens, und diese drei Methoden sind nützliche und leistungsstarke Werkzeuge für die Analyse sowohl der individuellen als auch der kollektiven Motilität.
Die hier beschriebenen Techniken können ohne weiteres angewendet werden, um eine Reihe von Bakterien zu untersuchen, einschließlich solcher, die in der Natur als pathogen eingestuft werden. Wenn Sie dieses Verfahren zum ersten Mal versuchen, denken Sie daran, dass bei falscher Vorbereitung der Schwarmplatten inkonsistentes Verhalten oder Muster beobachtet werden können, die die kollektive Bewegung nachahmen, aber nicht wirklich widerspiegeln. Über Nacht Kulturen des gewünschten motilitätsarmen Stammes in fünf Millilitern Lennox-Brühe bei 30 Grad Celsius mit horizontalem Schütteln züchten, dann Subkultur in frischem LB unter den gleichen Bedingungen bis zur exponentiellen Phase.
Impfen Sie sechs Mikroliter der Kultur in die Mitte einer weichen Agarplatte und schieben Sie die geladene Pipettenspitze in den Agar, um den Inhalt vorsichtig auszustoßen. Inkubieren Sie die Platte bei 30 Grad Celsius, bis Motilitätsfackeln sichtbar sind, die vom Impfpunkt oder der Peripherie der Motilitätsringe ausgehen. Verwenden Sie eine sterile Drahtschlaufe, um die Zellen aus dem Flare-Bereich zu heben, und streifen Sie sie auf eine LB-Hartagarplatte, um einzelne Kolonien zu reinigen.
Um zu bestätigen, dass die isolierten Suppressormutanten ihre Beweglichkeit wiederhergestellt haben, kultivieren Sie sie auf weichen Agarplatten für interessante Stämme. Beziehen Sie den Wildtyp und den Ausgangsstamm mit Motilitätsmangel zum Vergleich ein. Nachdem Sie die Kulturplatten acht bis 10 Stunden lang bei 30 Grad Celsius inkubiert haben, erfassen Sie den Durchmesser des äußersten Rings, um festzustellen, welche der Isolate die Motilität im Wesentlichen wiederhergestellt haben.
Bereiten Sie eine Exponentialphasenkultur des interessierenden Stammes vor. Pelletieren Sie dann 10 Milliliter Zellen durch Zentrifugation bei 2000 mal G für drei Minuten und resuspendieren Sie sie in 10 Millilitern filtersterilisiertem Motilitätspuffer (MB). Waschen Sie die Zellen noch zwei Mal in MB und suspendieren Sie sie nach der abschließenden Zentrifugation in einem Milliliter MB. Übertragen Sie die Zellsuspension in eine Ein-Milliliter-Spritze und befestigen Sie eine 23-Gauge-Nadel am Ende.
Montieren Sie eine identische Spritze und ein identisches Nadelgerät und befestigen Sie die beiden über einen sechs Zoll langen Polyethylenschlauch, der über jeder Nadelspitze fest ummantelt ist. Scheren Sie die Flagellen, indem Sie die Zellsuspension vorsichtig 50 Mal von einer Spritze zur anderen hin- und herschieben, wobei zwischen allen 10 Durchgängen eine Minute Pause eingelegt wird. Zentrifugieren Sie dann die gescherten Zellen drei Minuten lang bei 2000 mal G und resuspendieren sie in 500 Mikrolitern MB.To bereiten Sie eine Zellfixierungskammer vor, stapeln Sie einen 18 x 18 Millimeter großen Deckglas über einen Glasobjektträger, der durch doppelseitiges Klebeband getrennt ist.
Geben Sie 0,01%ige Polylysinlösung auf den oberen Rand der Kammer, um sie zu spülen. Kippen Sie die untere Kante auf ein Tuch, um die Lösung durch die Kammer zu ziehen, und lassen Sie sie dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen. Waschen Sie die Kammer dreimal mit 40 Mikrolitern MB und geben Sie 40 Mikroliter Scherzellsuspension auf den oberen Rand der Kammer.
Lassen Sie die Zellen 10 Minuten lang an dem Deckglas haften und spülen Sie dann die Kammer vorsichtig mit 40 Mikrolitern MB aus, um nicht angeschlossene Zellen zu entfernen. Übertragen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch und verwenden Sie Phasenkontrastmikroskopie und ein 100X-Objektiv, um die Population nach Zellen zu durchsuchen, die an Ort und Stelle fixiert sind und sich auf einer einzigen Achse drehen. Öffnen Sie die Mikroskopsoftware, stellen Sie sicher, dass die Zellen scharf sind, und beginnen Sie mit der Videoaufnahme, um die Zellrotation eine Minute lang aufzuzeichnen.
Quantifizieren Sie bei der Videowiedergabe die Anzahl der vollständigen Umdrehungen pro Minute und die Häufigkeit, mit der die Zelle die Richtung ändert. Beimpfen Sie sechs Mikroliter einer Kultur mit mittlerer Exponentialzeit, indem Sie sie auf den Agar setzen. Lassen Sie den Deckel fünf bis 10 Minuten lang offen und setzen Sie ihn wieder auf, wenn das Inokulum in der Agaroberfläche getrocknet ist.
Dann inkubieren Sie die Platte acht Stunden lang bei 30 Grad Celsius. Gießen Sie etwa 30 Milliliter Schwarmagar in die rechte Kammer einer Petrischale mit zwei Kammern und stellen Sie sicher, dass sie auf gleicher Höhe mit der Kunststofftrennwand zwischen den Kammern ist, aber nicht in die linke überläuft. Nachdem das Agar ausgehärtet ist, füllen Sie die linke Kammer mit etwa 30 Millilitern Schwimm- oder Schwarmagar
.Bevor es fest wird, verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze, um den Agar vorsichtig über den Rand zu treiben und verbinden Sie die beiden Seiten mit einer einen Millimeter hohen Agarbrücke, die sich über die gesamte Länge der Teilung erstreckt. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur trocknen. Achten Sie beim Eingießen des Agars auf seine Tiefe.
Ist er zu hoch, läuft er über. Ist sie zu niedrig, können Sie die beiden Kammern nicht überbrücken. Dieses Protokoll wurde verwendet, um pseudo-revertante Schübe in einem doppelmutierten E.coli-Stamm mit eingeschränkter Motilität zu isolieren.
Einer dieser Revertanten zeigte eine Motilität nahe dem Wildtyp. Als Kontrollen wurden der doppelmutierte Elternteil und der isogene Wildtyp-Stamm verwendet. Die Videoaufnahmen wurden analysiert, um die Umdrehungen pro Minute und den Anteil der Zeit, die sich Motoren im Uhrzeigersinn drehen, zu berechnen.
Die yhjH-Mutante zeigte erwartungsgemäß einige Umdrehungen pro Minute und einen geringeren Tumble-Bias im Vergleich zu Wildtyp-E.coli. Sowohl die Doppelmutante als auch ihr Suppressor zeigten ein motorisches Verhalten, das dem Wildtyp ähnelt. Der Grenzübertrittsassay wurde verwendet, um die Fähigkeiten des Wildtyps und des Suppressorisolats zu vergleichen, zu schwärmen und sich dann über die Grenze zu bewegen und auf mit Kanamycin ergänztem Agar zu schwärmen.
Beide Stämme zeigten ähnliche Schwarmraten von einem identischen Impfpunkt, aber der Übergang des Schwarms zur Antibiotikakammer war beim Wildtyp durchweg größer als beim Suppressor. Der Unterschied zwischen den beiden Stämmen war bei höheren Kanamycin-Konzentrationen ausgeprägter. Die Einrichtung der Schwarm-Assays kann schwierig sein.
Möglicherweise müssen Sie einige Zeit damit verbringen, die Ziehbedingungen zu optimieren, um sie an die für Sie gewünschten Bakterien sowie an Ihre Laborbedingungen während der Medienvorbereitung anzupassen. Die Techniken in diesem Protokoll wurden auf eine Reihe von geißelierten Bakterien angewendet und können wahrscheinlich auf eine Vielzahl ungetesteter Spezies angewendet werden.
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Übersicht
Diese Studie untersucht die bakterielle Motilität unter besonderer Berücksichtigung der durch Flagellen angetriebenen Bewegung als Mittel zur Orientierung in der Umwelt und zur Besiedlung. Unter Verwendung etablierter Methoden identifiziert die Forschung zentrale Komponenten und Signalwege, die an individuellen und kollektiven Motilitätsverhalten beteiligt sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Bakterielle Motilität
- Flagellenmechanik
- Kollektives Verhalten bei Bakterien
Hintergrund
- Die Motilität ist entscheidend für das Überleben und die Ausbreitung von Bakterien.
- Die Studie umfasst die Analyse sowohl der individuellen als auch der kollektiven Motilität.
- Die Protokolle können auf verschiedene Bakterien, einschließlich Krankheitserreger, angewendet werden.
Verwendete Methoden
- Nutzung der Motilität als Selektionsinstrument
- Verwendung von Weichagarplatten und Schwarmassays
- Phasenkontrastmikroskopie zur Zellbeobachtung
Hauptergebnisse
- Isolierte Suppressormutanten zeigten eine wiederhergestellte Motilität.
- Der Vergleich der Schwärmfähigkeit zwischen Wildtyp und Mutanten zeigte signifikante Unterschiede in der Reaktion auf Antibiotika.
- Die quantifizierten Motorrotationen lieferten Einblicke in die Motilitätsmuster.
Schlussfolgerungen
- Die Studie zeigt die Wirksamkeit mehrstufiger Protokolle zur Charakterisierung der bakteriellen Motilität.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis des pathogenen Verhaltens und der Mechanik der Beweglichkeit bei.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Verständnis bakterieller Beweglichkeitsmechanismen liefert entscheidende Erkenntnisse über die Virulenz von Krankheitserregern und deren Strategien zur Besiedlung des Wirts und unterstützt die Validierung von Zielstrukturen für die Entwicklung von Antiinfektiva. Die kombinierte Anwendung von Beweglichkeitsassays ermöglicht eine systematische Absicherung therapeutischer Hypothesen, indem genetische Störungen mit funktionellen Phänotypen sowohl bei individueller als auch kollektiver Bewegung verknüpft werden. Dieser Ansatz unterstützt frühe Entdeckungsarbeitsabläufe, indem er quantitative, reproduzierbare Daten liefert, die das Vorhersagevertrauen bei der Priorisierung von Zielstrukturen und der mechanistischen Weiterverfolgung erhöhen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem die Wiederherstellung der Motilität mit Suppressor-Mutationen verknüpft wird, was zur Klärung der Genfunktion bei der Flagellenbildung und Signalübertragung beiträgt.
- Operativer Wert: Bietet ein starkes Selektionssystem zur Isolierung von Gain-of-function-Mutationen und beschleunigt so die Identifizierung kompensatorischer Signalwege in motilitätsbeeinträchtigten Stämmen.
- Prognostischer Wert: Unterstützt die phänotypische Bildschirmanalyse durch Quantifizierung der Motilitätsrückgewinnung und hilft so bei der Bewertung genetischer Modifikatoren und Wechselwirkungen zwischen Signalwegen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Die Zell-Anheftungstechnik ermöglicht eine präzise Messung der Motorgeschwindigkeit und des Richtungswechsels und erlaubt so die mechanistische Absicherung von Zielstrukturen, die an Ionenfluss oder Signalmodulation beteiligt sind.
- Operationaler Wert: Die standardisierte Herstellung von geschnittenen Zellen und Fixierkammern gewährleistet eine reproduzierbare Anheftung und Sichtbarmachung im Phasenkontrastmikroskop.
- Eignung für Assays: Erzeugt quantifizierbare Ausgabewerte wie Umdrehungen pro Minute und Tumble-Bias, wodurch der Vergleich zwischen Stämmen und Bedingungen für Screening-Anwendungen erleichtert wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Der Grenzüberquerungs-Assay verknüpft individuelle Motilität mit kollektivem Schwarmverhalten und modelliert, wie Pathogene unter Stress von der Verbreitung zur Oberflächenbesiedlung übergehen.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Bewertung der Anpassung an Umweltbedingungen, beispielsweise den Einfluss von Antibiotikaresistenz auf die Schwarmwanderung, und liefert Hinweise auf die translative Relevanz von Biomarkern.
- Vorhersagegenauigkeit: Zeigt auf, wie Suppressor-Mutationen den Übergang zwischen Schwarmverhalten und Antibiotikawirkung verändern, und bietet ein Modell zur Untersuchung adaptiver Resistenzmechanismen in präklinischen Szenarien.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in die frühe Entdeckung, indem genetische Bildschirmverfahren mit funktionellen Motilitätsphänotypen verknüpft werden und somit die Weiterentwicklung von der Ziel-ID-Validierung bis zur mechanistischen Ent-Risikobewertung vor der Lead-Identifizierung unterstützt.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem quantifiziert wird, wie genetische Veränderungen die Funktion des Geißelmotors und die Schwarmfähigkeit beeinflussen, wodurch Unsicherheiten bei der Zielvalidierung verringert werden.
- Screening: Bietet standardisierte, quantitative Messgrößen (Rotationsraten, Richtungspräferenz, Schwarmdurchmesser), die einen zuverlässigen Vergleich zwischen Mutantenbibliotheken oder chemischen Störungen ermöglichen.
- Analysen: Erzeugt messbare Ergebnisse wie Tumble-Präferenz und Expansionsraten des Schwarms, anhand derer Teams Genotyp und phänotypisches Risiko in pathogenen Modellen korrelieren können.
- Translationale Forschung: Verbindet individuelles Motorenverhalten mit kollektiver Bewegung unter selektivem Druck und modelliert dabei phänotypische Anpassungen, die für Infektionsdynamiken relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Die drei Techniken bilden eine modulare, anpassungsfähige Plattform, die auf verschiedene flagellierte Pathogene anwendbar ist und somit eine Standardisierung über Projekte hinweg sowie den Austausch von Reagenzien fördert.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem die Beweglichkeit in die Komponenten Motorenfunktion, Richtungswechsel und kollektives Verhalten zerlegt wird.
- Operativer Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Protokolle für die Inokulation in weichem Agar, Zellscherung und Kammerpräparation und minimiert so die Variabilität zwischen verschiedenen Laboren.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch die Verknüpfung der Zielmodulation mit messbaren Veränderungen in beweglichkeitsassoziierten Virulenzeigenschaften.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf ihrer Rolle bei der beweglichkeitsgetriebenen Ausbreitung und Persistenz im Wirt.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in bakteriellen Kultivierungstechniken, Mikroskopie und aseptischem Umgang, um konsistente Motilitätsassays sicherzustellen.
- Hängt vom Zugang zu Phasenkontrastmikroskopie, Mikromanipulationswerkzeugen und kontrollierten Inkubationsumgebungen für Schwarm- und Weichagar-Assays ab.
- Erfordert die Standardisierung der Agarkonzentration, der Platten-Trocknungszeiten und der Inokulationsvolumina, um Artefakte in Schwarmrand-Überquerungsassays zu vermeiden.
- Erfordert eine Anpassung der Pufferzusammensetzung und Scherparameter, wenn die Zellfixierungsmethode auf verschiedene bakterielle Spezies oder mutante Hintergründe angewendet wird.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Empfindlichkeit gegenüber der Tiefe des Schwarmagars und der Brückentechnik, die optimiert werden müssen, um falsch-negative oder irreführende Ergebnisse bei kollektiven Bewegungsmessungen zu vermeiden.
