Name: Untersuchung der Flagellen-getriebenen Motilität in Escherichia coli durch Anwendung von drei etablierten Techniken in einer Serie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die flagellengesteuerte Motilität von Escherichia coli mit drei etablierten Methoden systematisch charakterisieren. Diese Techniken ermöglichen die Analyse individueller und kollektiver Bewegungsmuster.

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Diese Arbeit wurde durch den National Institutes of Health Grant GM118085 und teilweise durch die Robert Welch Foundation (Grant F-1811 an R.M.H.) unterstützt.

1. Isolierung von Suppressormutanten in motilitätsarmen Stämmen
HINWEIS: Verwenden Sie diese Methode als umfassenden "Catch-All", um die allgemeine Art des Motilitätsdefekts zu identifizieren.
<ol><li>Soft-Agar-Plattenzubereitung HINWEIS: Weich-Agar, auch als Motilitäts- oder Schwimm-Agar bezeichnet, ist ein Agar mit niedrigem Prozentsatz (~ 0,2-0,35% w / v), das seit langem zur Untersuchung von Chemotaxis31,32verwendet wird.<ol>
<li>3 g Bacto-Agar (0,3% w/v) und 20 g LB in einen 2 L Rundkolben geben. 1 L ddH2O (doppelt destilliertes Wasser) in denKolbengeben und die Suspension mit einem Rührstab und einer magnetischen Rührplatte gleichmäßig mischen.</li>
		<li>Autoklav für 20 min bei 121 °C.</li>
		<li>Mit der Stange/Platte wie oben beschrieben mit sanftem Rühren abkühlen lassen. Wenn die Temperatur etwa 50 °C erreicht, gießen Sie 25 ml in sterile Petrischalen (100 mm x 15 mm) und lassen Sie das geschmolzene Agar mindestens 1 h lang mit Deckel einstellen, um es innerhalb von 16 h zu verwenden.</li>
	</ol></li>
	<li>Kulturvorbereitung, Impfung und Isolierung von Suppressormutanten HINWEIS: E. coli, die in der Mitte nährstoffreicher Medien geimpft sind, die mit weichem Agar verfestigt sind, verbrauchen Nährstoffe lokal und erzeugen einen Nährstoffgradienten, dem sie folgen. Wenn sie sich nach außen bewegen, erscheinen definierte "Ringe" (Abbildung 1A), die mit bestimmten Chemoattraktantien verwandt sind, auf die die Bakterien reagieren. Defekte im Chemotaxis-System oder in strukturellen Komponenten des Flagellenmotors können die Leistung in diesem Assay beeinträchtigen. Oft entstehen Mutanten mit einem Motilitätsvorteil während des Screenings und können von einzelnen oder von mehreren Punkten entlang der Peripherie des Rings gesehen werden, von wo aus sie "ausflackern"(Abbildung 1C). Man wird feststellen, dass der äußerste Rand der Schwimmfront leicht mit dem unbesiellten jungfräulichen weichen Agar kontrastiert.<ol>
<li>Über Nacht Kulturen des gewünschten motilitätsarmen Stammes in 5 ml Lennoxbrühe (LB; 10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt und 5 g/L NaCl, Materialtabelle)bei horizontalem Schütteln (220 U/a.m) züchten. Am folgenden Tag Subkultur (1:100 Verdünnung) in frischer LB, unter den gleichen Bedingungen bis zur exponentiellen Phase (OD600 von 0,6) wachsend.</li>
		<li>6 μL der Kultur werden mit einer Pipette in die Mitte einer Soft-Agar-Platte (1.1) geimpft und die beladene sterile Spitze in das Agar gedrückt, um den Inhalt vorsichtig auszustoßen. Übergabe auf 30 °C und Inkubation (Abbildung 1B), bis Motilitäts-"Fackeln" sichtbar sind, die vom Impfpunkt oder der Peripherie der Motilitätsringe ausgehen, typischerweise in 24-36 h (Abbildung 1C). HINWEIS: Bei Motilitätstests wird ein Wildtypstamm neben den mutierten Isolaten zum Vergleich geimpft. Dieser Wildtyp-Stamm zeigt die charakteristischen konzentrischen chemotaktischen Ringe (Abbildung 1A) und füllt die Platte innerhalb von 8-10 h.</li>
		<li>Verwenden Sie eine sterile Drahtschlaufe, um die Zellen aus der "Flare" -Region zu heben und einzelne Kolonien auf eine LB-Hartagarplatte zu reinigen (LB wie oben vorbereitet, erstarrt mit 15 g / L Bacto-Agar).</li>
		<li>Wählen Sie einzelne Kolonien mit einer sterilen Drahtschlaufe aus der Streifenplatte und reinigen Sie sie erneut, indem Sie für einzelne Kolonien streifen, um die Isolierung eines "reinen" Kolonieisolats zu gewährleisten.</li>
	</ol></li>
	<li>Bestätigung und Charakterisierung von Suppressormutanten
	<ol>
<li>Vergewissern Sie sich, dass die isolierte(n) Suppressormutante(n) die Motilität wiederhergestellt haben. Bereiten Sie Weichagarplatten (1.1) und Kulturen für interessante Stämme (wie in 1.2.1) vor, einschließlich Wildtyp und des beginnenden "Motilitätsmangel"-Stammes zum Vergleich.</li>
		<li>Die Platten impfen (wie in 1.2.2) und bei 30 °C für 8-10 h inkubieren.</li>
		<li>Zeichnen Sie den Durchmesser des äußersten Rings (Rand des Kreises) auf und vergleichen Sie, um festzustellen, welche der Isolate die Motilität im Wesentlichen wiederhergestellt haben. HINWEIS: Es wird empfohlen, Platten während des gesamten Zeitraums des Experiments zu fotografieren. Für beste Ergebnisse verwenden Sie ein "Eimer Licht" Gerät30, wo eine Digitalkamera über einer Lichtquelle für eine bessere Beleuchtung montiert ist, um den Durchmesser der Schwimmkolonie zu messen und sie von unkolonisiertem Agar zu unterscheiden.</li>
		<li>Die Probanden verifizierten Isolate für WGS nach Bedarf, was eine ausreichende "Sequenzabdeckung" ermöglicht, um die Mutationen, die die Wildtypfunktion wiederherstellten, positiv zu identifizieren.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Quantifizierung des motorischen Verhaltens von Flagellen durch Zellanbindeung
HINWEIS: Verwenden Sie diese Methode, wenn das normale Run-Tumble-Verhalten (Chemotaxis) beeinträchtigt zu sein scheint.
<ol><li>
Kulturvorbereitung und Flagellenscherung
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine exponentielle Phasenkultur des interessierenden Stammes vor, wie in Schritt 1.2.1 beschrieben.</li>
		<li>Pellet 10 mL Zellen durch Zentrifugation bei 2.000 x g für 3 min vor dem Wiederauffüllen in 10 mL filtersterilisiertem Motilitätspuffer (MB; 10 mM Kaliumphosphatpuffer [0,0935 MK2HPO4,0,0065 M KH2PO4, pH 7,0], 0,1 mM EDTA [pH 7,0], 10 mM NaCl, 75 mM KCl). HINWEIS: MB unterstützt die Motilität, aber nicht das Bakterienwachstum</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.1.2 noch zwei weitere Male, bevor Sie das endgültige Pellet in 1 ml MB erneut verwenden.</li>
		<li>Die Zellsuspension in eine 1-ml-Spritze überführen und am Ende eine 23G-Nadel befestigen. Stellen Sie eine identische Spritze / Nadelvorrichtung zusammen und befestigen Sie die beiden zusammen über 6 Zoll Polyethylenschlauch (Innendurchmesser von 0,58 mm), der fest über jeder Nadelspitze ummantelt ist.</li>
		<li>Scheren Sie die Flagellen (sie sind zerbrechlich und brechen leicht), indem Sie die Zellsuspension sanft von einer Spritze zur anderen 50x hin und her geben, mit 1 Min. Pausen zwischen 10 Durchgängen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die scherten Zellen bei 2.000 x g für 3 min und resuspendieren Sie in einem Endvolumen von 500 μL MB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diavorbereitung und Zellanbindeung
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine Zellfixierkammer vor, indem Sie einen 18 mm x 18 mm abdeckungsartigen Abdeckr über einen 3 Zoll x 1 Zoll x 1 mm Glasmikroskopobjektträger stapeln, der durch doppelseitiges Klebeband getrennt ist (Abbildung S1).</li>
		<li>Spülen Sie die Kammer mit 0,01% (w/v) Polylysinlösung, indem Sie sie auf die Oberseite der Kammer auftragen. Neigen Sie den unteren Rand (den Abdeckrbündchen bündig mit dem Objektträger) auf einen Taskwischer (Seidenpapier), um die Lösung durch die Kammer zu ziehen (Abbildung S1). Dann bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Kammer dreimal mit 40 μL MB wie in Schritt 2.2.2 beschrieben</li>
		<li>40 μL der scherten Zellsuspension (oben vorbereitet) an die Oberseite der Kammer geben und bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubieren, damit sich die Zellen am Abdeckr anheften können.</li>
		<li>Spülen Sie die Kammer vorsichtig mit 40 μL MB wie in 2.2.3, um nicht befestigte Zellen zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aufzeichnung und Quantifizierung der Zellrotation
	<ol>
<li>Übertragen Sie den mit angebundenen Zellen beladenen Objektträger in den Mikroskopstand.</li>
		<li>Scannen Sie die Population mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie und eines 100-fachen Objektivs nach Zellen, die an Ort und Stelle fixiert sind und sich um eine einzige Achse drehen, d. H. Glatte Rotationen an einem festen Punkt, anstatt sich in einem Winkel zu präsentieren, in dem sich die Zelle in und aus dem Fokus bewegt (Video 1).</li>
		<li>Verwenden Sie ein handelsübliches Mikroskop und die zugehörige Kamera. Öffnen Sie die zugehörige Software, stellen Sie sicher, dass die interessierendsten Zellen im Fokus sind, und klicken Sie auf die Videoaufnahme, um die Zellrotation für eine Minute (bei 10 Bildern pro Sekunde oder höher) aufzuzeichnen.</li>
		<li>Quantifizieren Sie bei der Videowiedergabe die Anzahl der vollständigen Umdrehungen pro Minute und die Häufigkeit, mit der die Zelle die Richtung ändert (Schaltfrequenz). HINWEIS: Rotationsgeschwindigkeiten und Schaltfrequenzen können zu schnell sein, um mit dem Auge gemessen zu werden, daher wird empfohlen, Videosoftware zu verwenden, die eine langsame / feine Wiedergabe bietet, oder ein automatisiertes Softwaresystem zur Quantifizierung von Rotationsmusternverwendet 33. Eine Alternative wäre, die Viskosität des MB mit Methylcellulose (oder einem ähnlichen Mittel) zu erhöhen, um die Rotation schnellerer Bakterien zu verlangsamen und aufzulösen oder zu kompensieren, wenn Kameras mit niedrigen Bildraten verwendet werden.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.3.2 mit biologischen Replikaten, um eine Darstellung der interessierenden Population zu erstellen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Vorbereitung von Schwärmen in einem grenzüberschreitenden Assay
HINWEIS: Verwenden Sie diese Methode, um die Auswirkungen einer Mutation oder eines Zustands auf die Gruppenmotilität zu bewerten. Schwarm-Agar bezieht sich auf Agar, bei dem der Prozentsatz typischerweise höher ist als der von Weichem Agar. Bei weichem Agar (0,3 %) schwimmen die Zellen einzeln im Inneren des Agars. Bei Schwarmagar (0,5% und mehr) bewegen sich Zellen als Gruppe auf der Oberfläche. Während Schwarmplatten wie hier beschrieben verwendet werden müssen, haben Schwimmplatten eine längere Haltbarkeit und können mehrere Tage verwendet werden. Unsere persönliche Präferenz ist es, in 1-2 Tagen zu verwenden.
<ol><li>
Zubereitung von Schwarmagar
	<ol>
<li>5 g Eiken-Agar (0,5 % w/v) und 20 g LB in einen 2-L-Rundkolben geben. 1 L ddH 2 O in denKolbengeben und die Suspension mit Rührstab und magnetischer Rührplatte gleichmäßig mischen.</li>
		<li>Autoklav für 20 min bei 121 °C.</li>
		<li>Mit sanftem Rühren abkühlen lassen, um Luftblasen mit der Stange / Platte wie oben beschrieben zu vermeiden. Bei ca. 50 °C filtersterilisierte Glukose für eine Endkonzentration von 0,5 % hinzufügen.</li>
		<li>25 ml in sterile Petrischalen (100 mm x 15 mm) gießen und mindestens 14 h und nicht mehr als 20 h auf Raumtemperatur einstellen lassen. Nicht für die zukünftige Verwendung aufbewahren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Impfung und Inkubation von Schwarmplatten
	<ol>
<li>Impfen Sie 6 μL einer mittel exponentiellen Kultur (vorbereitet wie in 1.2), indem Sie auf dem Agar aufflecken.</li>
		<li>Lassen Sie den Deckel für 5-10 min ab und ersetzen Sie ihn, wenn das Inokum in die Agaroberfläche getrocknet ist.</li>
		<li>Bei 30 °C für 8 h inkubieren. Vermeiden Sie die Versuchung, den Schwarmfortschritt zu überprüfen, indem Sie den Deckel entfernen, da dies zum Trocknen des Agars beiträgt und das Schwärmen beeinträchtigt. HINWEIS: Die Inkubationszeit kann je nach Stammphänotyp variieren. Einige isolierte Mutationen können die Schwarmfähigkeit beeinträchtigen und erfordern einen reduzierten Prozentsatz an Agar oder eine längere Inkubationszeit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Erstellung von grenzüberschreitenden Assay-Platten HINWEIS: Dieser Assay verwendet eine modifizierte Petrischale, bei der eine Kunststoffscheide (Grenze) zwei Kammern anstelle einer erzeugt(Abbildung 2A). Jede Kammer kann unabhängig von der anderen vorbereitet werden und bietet unterschiedliche Bedingungen für das Schwärmen, bevor die beiden "verbunden" werden. Je nach experimentellem Design kann die erste Kammer (links bezeichnet) entweder mit Schwimmagar (0,3% w/v) oder Schwarmagar (0,5% w/v) vorbereitet werden, von wo aus die Bakterien über die Grenze in die rechte Kammer wandern können, die Schwarmagar +/- jede erforderliche Ergänzung oder Herausforderung (z. B. Antibiotika) enthält. Die Migration auf beiden Agaren wird typischerweise gemessen / verglichen, indem der breiteste Durchmesser der Bakterienbesiedlung (von Rand zu Rand) vom ursprünglichen Impfpunkt aufgezeichnet wird.<ol>
<li>Bereiten Sie bei Bedarf Schwimmagar wie in 1.1 beschrieben vor.</li>
		<li>Bereiten Sie Schwarmagar wie in 3.1 beschrieben vor.</li>
		<li>Gießen Sie ~ 30 ml Schwarmagar (bei Bedarf mit gewünschter Ergänzung) in die rechte Kammer einer Petrischale mit zwei Fächern (100 mm x 15 mm), bis zu dem Punkt, an dem sie mit dem Kunststoffteiler zwischen den Kammern gleich ist, aber nicht in die linke überläuft (Abbildung 2B).</li>
		<li>Nachdem das Agar ausgehärtet ist, füllen Sie die linke Kammer mit ~ 30 ml Schwimm- oder Schwarmagar, wieder bis zur Kontaktstelle mit der Kunststoffscheide (Abbildung 2C). Bevor es sich festzieht, ziehen Sie das Agar vorsichtig über den Rand, um die beiden Seiten mit einer ~ 1 mm hohen Agarbrücke zu verbinden, die sich über die gesamte Länge der Trennlinie erstreckt (Abbildung 2D).</li>
		<li>Die Platte bei Raumtemperatur (3.1) trocknen lassen. HINWEIS: Eine alternative Methode zur Herstellung einer Brücke besteht darin, das linke Kammeragar trocknen zu lassen und dann langsam ~ 100 μL geschmolzenes Schwarmagar entlang des Kunststoffteilers zu pipetetten, um die beiden Kammern zu überbrücken (3.4). Impfen Sie die Platten in der linken Kammer wie oben beschrieben für Schwimm- (1.2.2) oder Schwarm-Agar (3.2), bevor Sie bei 30 °C für 12-16 h inkubieren oder bis die Schwärme über der rechten Kammer ausreichende Fortschritte gemacht haben, um Vergleiche zwischen interessierenden Stämmen zu ermöglichen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Die Isolierung und Charakterisierung von Suppressormutationen hat erfolgreich dazu beigetragen, Schlüsselkomponenten des Chemotaxis-Systems35,36,37sowie der Motormaschinen selbst zu identifizieren38,39,40. Bei der Verwendung von Protokoll 1 ist es wichtig, mehrere unabhängige Replikate einzubeziehen, um die Isolierung eines großen Spekt...

Bakterien verwenden viele Anhängsel zur Bewegung und Ausbreitung in ihren ökologischenNischen 1. Flagellengetriebene Motilität ist die schnellste von diesen, fördert die Besiedlung günstiger Orte als Reaktion auf Umweltsignale und trägt wesentlich zur pathogenen Fähigkeit einiger Artenbei 2,3. Gegeißelte Bakterien können einzeln in flüssiger Schüttung schwimmen oder als Kollektiv über eine halbfeste Oberflächeschwärmen 4. Extrazelluläre Flagellen haften an und werden von in die Membran eingebetteten Rotationsmotoren angetrieben, die die Kraft der Ionengradienten nutzen, um ein Drehmoment zu erzeugen, das eine Rotation1,2,4,5,6,7,8verursacht . Bei E. coli, deren Motoren mit einem konstanten Drehmoment9laufen , kann die Motorleistung in Bezug auf Drehzahl und Umschaltung des Rotors zwischen gegen den Uhrzeigersinn (CCW) und im Uhrzeigersinn (CW) kategorisiert werden. Die CCW-Rotation fördert die Bildung eines kohärenten Flagellenbündels, das die Zelle vorwärts treibt (Run), während ein transienter Schalter in Rotationsrichtung (CW) dazu führt, dass sich das Bündel entweder teilweise oder vollständig10zerlegt und die Zelle ihre Schwimmrichtung neu ausspricht (Tumble). E. coli laufen typischerweise für eine Sekunde und taumeln für eine Zehntelsekunde. Die Schaltfrequenz des Rotors oder "Tumble Bias" wird durch das Chemotaxis-Signalsystem gesteuert, wobei Transmembran-Chemorezeptoren externe chemische Signale erkennen und über Phosphorelay an den Flagellenmotor übertragen, um Läufe als Reaktion auf Lockstoffe zu verlängern oder sie als Reaktion auf toxische Chemikalien zu unterdrücken11,12. Die Schwimmmotilität wird in 0,3% weichem Agar untersucht.
Während des Schwärmens navigieren Bakterien auf einer halbfesten Oberfläche als dichtes Kollektiv, wo Bakterienpackungen in einer kontinuierlichen Wirbelbewegungströmen 2,13,14,15. E. coli-Schwärme zeigen eine veränderte chemosensorische Physiologie (niedrigere Tumble-Bias), höhere Geschwindigkeiten und eine höhere Toleranz gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen über Zellen, die in flüssiger Schüttung schwimmen16,17. Schwärme unterscheiden sich in der Anwendung einer Vielzahl von Strategien, die die Bewegung unterstützen, einschließlich Tensidproduktion, Hyperflagellation und Zelldehnung2. Schwärmen bietet Bakterien einen Wettbewerbsvorteil sowohl im ökologischen als auch im klinischen Umfeld18,19,20. Es gibt zwei Kategorien von Schwarmbakterien: gemäßigte Schwärme, die nur auf Medien schwärmen können, die mit 0,5-0,8% Agar erstarrt sind, und robuste Schwärmer, die über höhere Agarkonzentrationen navigieren können21.
Es gibt eine Vielzahl von Assays, um die Schwimmmotilität und ihre Regulierung zu untersuchen. Wenn sie durch Mutationen oder Umweltbedingungen beeinträchtigt wird, bietet die Motilität selbst eine starke Auswahl für die Identifizierung von Gain-of-Function-Suppressor-Mutationen. Diese Suppressoren können echte Revertanten der ursprünglichen Mutation oder Pseudo-Revertanten sein, bei denen eine zweite Mutation die Funktionalität wiederherstellt. Solche Mutanten können durch Whole Genome Sequencing (WGS) identifiziert werden. Eine Alternative zur unvoreingenommenen Suppressorauswahl ist eine verzerrte gezielte Mutagenesestrategie (z. B. PCR-Mutagenese). Diese Methoden beleuchten oft die Funktion oder Umweltregulation des Motilitätsapparates. Wenn das Ziel darin besteht, die motorische Funktion zu untersuchen, bedeutet die Wiederherstellung der Wildtyp-Motilität, wie sie in weichem Agar gemessen wird, nicht unbedingt auf die Wiederherstellung der Wildtyp-Motorleistung. Der Cell-Tethering-Assay, bei dem Zellen durch ein einzelnes Flagellum an einer Glasoberfläche befestigt werden und anschließend die Rotation des Zellkörpers überwacht wird, kann der erste Assay der Wahl zur Beurteilung des motorischen Verhaltens sein. Obwohl heute ausgefeiltere Methoden zur Überwachung der Motoreigenschaften zur Verfügung stehen, begrenzen die erforderliche Einrichtung von Hochgeschwindigkeitskameras und die Anwendung von Softwarepaketen für die Bewegungsanalyse ihre weit verbreitete Verwendung22,23,24,25. Der Zell-Tethering-Assay erfordert nur, dass die Flagellen geschert werden, so dass die kurzen Filamente an einem Glasobjektträger anhaften, gefolgt von einer Videoaufzeichnung der Rotation des Zellkörpers. Obwohl die aufgezeichneten Motordrehzahlen in diesem Assay aufgrund der hohen Belastung, die der Zellkörper auf das Flagellum ausübt, niedrig sind, hat dieser Assay dennoch zu wertvollen Erkenntnissen über chemotaktische Reaktionen26,27,28,29beigetragen und bleibt ein gültiges Untersuchungsinstrument, wie unten beschrieben.
Die Schwarmmotilität stellt Forscher vor andere Herausforderungen. Die Auswahl von Gain-of-Function-Suppressoren funktioniert nur in Schwärmen, die reichlich Tenside produzieren und leichtschwärmen 13. Tensid-Nichtproduzenten wie E. coli sind anspruchsvoll in Bezug auf die Wahl des Agars, die Medienzusammensetzung und die Feuchtigkeit der Umgebung2,13,14,21. Sobald die Schwarmbedingungen festgelegt sind, ist der Grenzübergangsassay17 eine nützliche Methode, um die Fähigkeit eines Schwarms zu untersuchen, sich unter neuen/rauen Bedingungen zurechtzufinden. Obwohl sich die unten vorgestellten Protokolle auf E. colibeziehen, können sie leicht für die Anwendung bei anderen Arten angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto Dehydratisierter Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-15-4</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Dinatriumsalz, Dihydrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-002-786</td><td></td></tr><tr><td>Eiken-Agar</td><td>Eiken Chemical Co. Japan</td><td>E-MJ00</td><td>Essentiell für E. coli-Schwärmen</td></tr><tr><td>Glukose D (+)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>410955000</tr><tr><td>LB (Lennox) Bouillon</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin-Lösung (0,1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-605-496</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat zweibasisch (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Materialien und Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellSense Mikroskop-Bildgebungssoftware (V. 1.6)</td><td>Olympus</td><td></td><td>Oder gleichwertige Software für das verwendete Mikroskop</td></tr><tr><td>Elektronenmikroskopie Sciences Scotch 666 Doppelseitiges Klebeband</td><td>Fisher</td><td>50-285-28</td><td></td></tr><tr><td>Mattierte Objektträger 3x1x1mm</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX53 Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td>Jedes aufrechte oder inverse Phasenmikroskop kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Petrischalen (100 mm Durchmesser)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>Für Soft-Agar-Assays</td></tr><tr><td>Polyethylen-Vernebler Kapillarschlauch (0,58 mm x 99 mm 3,0 m)</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td>9908265</tr><tr><td>Runde Petrischale mit 2 Fächern</td><td>VWR</td><td>89200-944</td><td>Für grenzüberschreitende Assays</td></tr><tr><td>Sicherheits-Injektionsnadeln (23G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826A</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Spritze - 1 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>14-955-450</td><td></td></tr><tr><td>Aufgaben-/Gewebetücher</td><td>Fisher scientific</td><td>06-666</td><td>Oder gleichwertige Einweg-Taschentücher</td></tr><tr><td>VWR Mikro-Deckglas 18x18mm</td><td>VWR</td><td>48366205</td><td></td></tr><tr><td>XM10 Kamera</td><td>Olympus</td><td>XM10</td><td>Oder gleichwertige Mikroskopkamera</td></tr></tbody></table>

untersuchung der flagellen-getriebenen motilität in escherichia coli durch anwendung von drei etablierten techniken in einer serie

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Die Motilität ist entscheidend für das Überleben und den Erfolg vieler Bakterienarten. Es gibt viele Methoden, um die Motilität zu nutzen, um Signalwege zu verstehen, die Funktion und den Aufbau von Flagellenteilen aufzuklären und Bewegungsmuster zu untersuchen und zu verstehen. Hier demonstrieren wir eine Kombination von drei dieser Methoden. Die Motilität in weichem Agar ist die älteste und bietet eine starke Auswahl für die Isolierung von Gain-of-Function-Suppressor-Mutationen in motilitätseingeschränkten Stämmen, bei denen die Motilität durch eine zweite Mutation wiederhergestellt wird. Die Zellanbindetechnik, die zuerst verwendet wurde, um die rotierende Natur des Flagellenmotors zu demonstrieren, kann verwendet werden, um den Einfluss von Signaleffektoren auf die Motordrehzahl und ihre Fähigkeit, die Drehrichtung zu wechseln, zu bewerten. Der "Grenzübertritts"-Assay ist neuer, bei dem schwimmende Bakterien darauf vorbereitet werden können, sich kollektiv als Schwarm zu bewegen. In Kombination stellen diese Protokolle einen systematischen und leistungsfähigen Ansatz dar, um Komponenten der Motilitätsmaschinerie zu identifizieren und ihre Rolle in verschiedenen Facetten des Schwimmens und Schwärmens zu charakterisieren. Sie können leicht angepasst werden, um die Motilität bei anderen Bakterienarten zu untersuchen.

Die Isolierung von Pseudo-Revertanten in einem E. coli-Stamm, dessen Motilität durch hohe Konzentrationen des Signalmoleküls c-di-GMP beeinträchtigt wird, wurde in neueren Arbeiten aus unserem Labor34detailliert beschrieben. Dieser Stamm (JP1442) wies zwei Mutationen auf:Δ yhjH und ΔycgR. YhjH ist die aktivste Phosphodiesterase, die c-di-GMP in E. coliabbaut. Das Fehlen von YhjH führt zu erhöhten c-di-GMP-Spiegeln und einer Hemmung der Motilität. YcgR ist ein c-...

Viele Bakterien verwenden Flagellen-getriebene Motilität, um ihre Umgebung zu navigieren und eine günstige Umgebung sowohl einzeln als auch als Kollektiv zu besiedeln. Demonstriert wird hier die Verwendung von drei etablierten Methoden, die Die Motilität als Selektionswerkzeug nutzen, um Komponenten / Pfade zu identifizieren, die zur Schwimm- und Schwarmmotilität beitragen.

Untersuchung der Flagellen-getriebenen Motilität in Escherichia coli durch Anwendung von drei etablierten Techniken in einer Serie

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

Die in diesem Video demonstrierten Protokolle können in jedem Labor der Welt reproduziert werden. In Kombination stellen sie einen systematischen und leistungsfähigen Ansatz zur Charakterisierung der bakteriellen Flagellummotilität dar. Motilität ist ein entscheidender Aspekt der bakteriellen Verbreitung und des Überlebens, und diese drei Methoden sind nützliche und leistungsstarke Werkzeuge für die Analyse sowohl der individuellen als auch der kollektiven Motilität.Die hier beschriebenen Techniken können ohne weiteres angewendet werden, um eine Reihe von Bakterien zu untersuchen, einschließlich solcher, die in der Natur als pathogen eingestuft werden. Wenn Sie dieses Verfahren zum ersten Mal versuchen, denken Sie daran, dass bei falscher Vorbereitung der Schwarmplatten inkonsistentes Verhalten oder Muster beobachtet werden können, die die kollektive Bewegung nachahmen, aber nicht wirklich widerspiegeln. Über Nacht Kulturen des gewünschten motilitätsarmen Stammes in fünf Millilitern Lennox-Brühe bei 30 Grad Celsius mit horizontalem Schütteln züchten, dann Subkultur in frischem LB unter den gleichen Bedingungen bis zur exponentiellen Phase.Impfen Sie sechs Mikroliter der Kultur in die Mitte einer weichen Agarplatte und schieben Sie die geladene Pipettenspitze in den Agar, um den Inhalt vorsichtig auszustoßen. Inkubieren Sie die Platte bei 30 Grad Celsius, bis Motilitätsfackeln sichtbar sind, die vom Impfpunkt oder der Peripherie der Motilitätsringe ausgehen. Verwenden Sie eine sterile Drahtschlaufe, um die Zellen aus dem Flare-Bereich zu heben, und streifen Sie sie auf eine LB-Hartagarplatte, um einzelne Kolonien zu reinigen.Um zu bestätigen, dass die isolierten Suppressormutanten ihre Beweglichkeit wiederhergestellt haben, kultivieren Sie sie auf weichen Agarplatten für interessante Stämme. Beziehen Sie den Wildtyp und den Ausgangsstamm mit Motilitätsmangel zum Vergleich ein. Nachdem Sie die Kulturplatten acht bis 10 Stunden lang bei 30 Grad Celsius inkubiert haben, erfassen Sie den Durchmesser des äußersten Rings, um festzustellen, welche der Isolate die Motilität im Wesentlichen wiederhergestellt haben.Bereiten Sie eine Exponentialphasenkultur des interessierenden Stammes vor. Pelletieren Sie dann 10 Milliliter Zellen durch Zentrifugation bei 2000 mal G für drei Minuten und resuspendieren Sie sie in 10 Millilitern filtersterilisiertem Motilitätspuffer (MB). Waschen Sie die Zellen noch zwei Mal in MB und suspendieren Sie sie nach der abschließenden Zentrifugation in einem Milliliter MB. Übertragen Sie die Zellsuspension in eine Ein-Milliliter-Spritze und befestigen Sie eine 23-Gauge-Nadel am Ende.Montieren Sie eine identische Spritze und ein identisches Nadelgerät und befestigen Sie die beiden über einen sechs Zoll langen Polyethylenschlauch, der über jeder Nadelspitze fest ummantelt ist. Scheren Sie die Flagellen, indem Sie die Zellsuspension vorsichtig 50 Mal von einer Spritze zur anderen hin- und herschieben, wobei zwischen allen 10 Durchgängen eine Minute Pause eingelegt wird. Zentrifugieren Sie dann die gescherten Zellen drei Minuten lang bei 2000 mal G und resuspendieren sie in 500 Mikrolitern MB.To bereiten Sie eine Zellfixierungskammer vor, stapeln Sie einen 18 x 18 Millimeter großen Deckglas über einen Glasobjektträger, der durch doppelseitiges Klebeband getrennt ist.Geben Sie 0,01%ige Polylysinlösung auf den oberen Rand der Kammer, um sie zu spülen. Kippen Sie die untere Kante auf ein Tuch, um die Lösung durch die Kammer zu ziehen, und lassen Sie sie dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen. Waschen Sie die Kammer dreimal mit 40 Mikrolitern MB und geben Sie 40 Mikroliter Scherzellsuspension auf den oberen Rand der Kammer.Lassen Sie die Zellen 10 Minuten lang an dem Deckglas haften und spülen Sie dann die Kammer vorsichtig mit 40 Mikrolitern MB aus, um nicht angeschlossene Zellen zu entfernen. Übertragen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch und verwenden Sie Phasenkontrastmikroskopie und ein 100X-Objektiv, um die Population nach Zellen zu durchsuchen, die an Ort und Stelle fixiert sind und sich auf einer einzigen Achse drehen. Öffnen Sie die Mikroskopsoftware, stellen Sie sicher, dass die Zellen scharf sind, und beginnen Sie mit der Videoaufnahme, um die Zellrotation eine Minute lang aufzuzeichnen.Quantifizieren Sie bei der Videowiedergabe die Anzahl der vollständigen Umdrehungen pro Minute und die Häufigkeit, mit der die Zelle die Richtung ändert. Beimpfen Sie sechs Mikroliter einer Kultur mit mittlerer Exponentialzeit, indem Sie sie auf den Agar setzen. Lassen Sie den Deckel fünf bis 10 Minuten lang offen und setzen Sie ihn wieder auf, wenn das Inokulum in der Agaroberfläche getrocknet ist.Dann inkubieren Sie die Platte acht Stunden lang bei 30 Grad Celsius. Gießen Sie etwa 30 Milliliter Schwarmagar in die rechte Kammer einer Petrischale mit zwei Kammern und stellen Sie sicher, dass sie auf gleicher Höhe mit der Kunststofftrennwand zwischen den Kammern ist, aber nicht in die linke überläuft. Nachdem das Agar ausgehärtet ist, füllen Sie die linke Kammer mit etwa 30 Millilitern Schwimm- oder Schwarmagar.Bevor es fest wird, verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze, um den Agar vorsichtig über den Rand zu treiben und verbinden Sie die beiden Seiten mit einer einen Millimeter hohen Agarbrücke, die sich über die gesamte Länge der Teilung erstreckt. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur trocknen. Achten Sie beim Eingießen des Agars auf seine Tiefe.Ist er zu hoch, läuft er über. Ist sie zu niedrig, können Sie die beiden Kammern nicht überbrücken. Dieses Protokoll wurde verwendet, um pseudo-revertante Schübe in einem doppelmutierten E.coli-Stamm mit eingeschränkter Motilität zu isolieren.Einer dieser Revertanten zeigte eine Motilität nahe dem Wildtyp. Als Kontrollen wurden der doppelmutierte Elternteil und der isogene Wildtyp-Stamm verwendet. Die Videoaufnahmen wurden analysiert, um die Umdrehungen pro Minute und den Anteil der Zeit, die sich Motoren im Uhrzeigersinn drehen, zu berechnen.Die yhjH-Mutante zeigte erwartungsgemäß einige Umdrehungen pro Minute und einen geringeren Tumble-Bias im Vergleich zu Wildtyp-E.coli. Sowohl die Doppelmutante als auch ihr Suppressor zeigten ein motorisches Verhalten, das dem Wildtyp ähnelt. Der Grenzübertrittsassay wurde verwendet, um die Fähigkeiten des Wildtyps und des Suppressorisolats zu vergleichen, zu schwärmen und sich dann über die Grenze zu bewegen und auf mit Kanamycin ergänztem Agar zu schwärmen.Beide Stämme zeigten ähnliche Schwarmraten von einem identischen Impfpunkt, aber der Übergang des Schwarms zur Antibiotikakammer war beim Wildtyp durchweg größer als beim Suppressor. Der Unterschied zwischen den beiden Stämmen war bei höheren Kanamycin-Konzentrationen ausgeprägter. Die Einrichtung der Schwarm-Assays kann schwierig sein.Möglicherweise müssen Sie einige Zeit damit verbringen, die Ziehbedingungen zu optimieren, um sie an die für Sie gewünschten Bakterien sowie an Ihre Laborbedingungen während der Medienvorbereitung anzupassen. Die Techniken in diesem Protokoll wurden auf eine Reihe von geißelierten Bakterien angewendet und können wahrscheinlich auf eine Vielzahl ungetesteter Spezies angewendet werden.

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Research

Forschung

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Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Untersuchung der bakteriellen Chemotaxis in stabilen Konzentrationsgradienten chemoeffectors.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Quantifizierung von bakteriellen Chemotaxis in Stable Konzentrationsgradienten

Quelle: Morales-Soto, N. et. al., Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt einen Schwarm-Assay mit Bakterien, die grün fluoreszierendes Protein exprimieren, um die Oberflächenmotilität auf weichem Agar zu beobachten. Die Zeitraffer-Bildgebung erfasst die koordinierte Expansion und Rankenbildung und hebt die bakterielle Oberflächenmotilität hervor.

Schwarm-Assay zur Visualisierung der bakteriellen Oberflächenmotilität

Quelle: Pioli, R., et al., Strukturierung von Mikroorganismen und Mikropartikeln durch sequentielle Kapillaritäts-unterstützte Assemblierung. J. Vis. Exp. (2021)Dieses Video zeigt die Methode zum Einfangen einzelner fluoreszenzmarkierter Escherichia coli (E. coli)- Zellen in mikrofluidischen Fallen unter Verwendung einer kohlenstofffreien Suspension und eines kontrollierten Flusses, gefolgt von einer Nährstoffzugabe zur Auslösung des Wachstums und der Fluoreszenzbildgebung von Mikrokolonien.

Mikrofluidische Strukturierung und fluoreszenzbasierte Verfolgung des einzelligen Bakterienwachstums

Quelle: Scheidweiler, D., et al. Die Kombination von fluidischen Geräten mit Mikroskopie und Durchflusszytometrie zur Untersuchung des mikrobiellen Transports in porösen Medien über räumliche Skalen hinweg. J. Vis. Exp. (2020).Dieses Video demonstriert den Einsatz eines mikrofluidischen Geräts zur Quantifizierung der bakteriellen Beweglichkeit durch eine poröse Matrix, die aus zufällig angeordneten Säulen besteht. Fluoreszierend markierte Bakterien werden in das Gerät eingeführt, mikroskopisch...

Beurteilung der bakteriellen Beweglichkeit mit einem mikrofluidischen Gerät

In diesem Video führen wir einen in vitro Motilitätstest durch, um die Aktin-Myosin-Wechselwirkungen zu analysieren. Die Gleitbewegung von Aktinfilamenten auf immobilisierten Myosinmolekülen wird mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht.

Invertierter Motilitäts-Assay: Eine In-vitro-Technik zur Visualisierung der Myosinbewegung auf immobilisierten Aktinfilamenten

Die Schwarmmotilität wird durch physikalische und Umweltfaktoren beeinflusst. Wir beschreiben ein zweistufiges Protokoll und Richtlinien, um die Herausforderungen zu umgehen, die üblicherweise mit der Vorbereitung und Datenerfassung von Schwarmassays verbunden sind. Ein makroskopisches bildgebendes Verfahren wird eingesetzt, um detaillierte Informationen über das Schwarmverhalten zu erhalten, die von den derzeitigen Analysetechniken nicht bereitgestellt werden.

Vorbereitung, Imaging und Quantifizierung der Bakterienoberfläche Motilität Tests

Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass bakterielle Flagellenmotoren eine Vielzahl von Umweltsignalen wahrnehmen und sich als Reaktion darauf umgestalten. Es wird erwartet, dass die hier diskutierten Bead-Assays dazu beitragen, die Rolle des Umbaus bei der zellulären Anpassung an Umweltstressoren zu erklären.

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Die Bildgebung von Bakterienzellen ist ein aufkommendem systembiologischen Ansatz, der sich auf die Definition statischer und dynamischer Prozesse konzentriert, die die Funktion großer makromolekularer Maschinen diktieren. Hier wird die Integration von quantitativer Live-Zell-Bildgebung und Kryo-Elektronentomographie verwendet, um Legionella pneumophila Typ IV Sekretionssystemarchitektur und -funktionen zu untersuchen.

Anwendung von Live Cell Imaging und Cryo-Electron Tomography zur Auflösung der raumzeitlichen Merkmale des Legionella pneumophila Dot/Icm Sekretionssystems

Hier beschreiben wir die Konstruktion von Nullmutanten von Aeromonas in spezifischen Glykosyltransferasen oder Regionen, die Glykosyltransferasen enthalten, die Motilitätsassays und die Flagellenreinigung, die durchgeführt wurden, um die Beteiligung und Funktion ihrer kodierten Enzyme bei der Biosynthese eines Glykans zu bestimmen, sowie die Rolle dieses Glykans in der bakteriellen Pathogenese.

Erzeugung von Nullmutanten zur Aufklärung der Rolle bakterieller Glykosyltransferasen in der bakteriellen Motilität

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis der bakteriellen Motilität anhand einer Farbreaktion vor. Die Hauptvorteile dieser Methode sind, dass sie einfacher auszuwerten und genauer ist und keine spezielle Ausrüstung erfordert.

Visualisierung der bakteriellen Motilität anhand einer Farbreaktion

Dieses Protokoll stellt eine schnelle und effiziente Methode zur Identifizierung genetischer Faktoren dar, die an verschiedenen Arten von Motilitäten bei Pseudomonas aeruginosa beteiligt sind.

Hochdurchsatzmethode zur Beobachtung von Motilitätsphänotypen bei Pseudomonas aeruginosa

Erfahren Sie, wie Sie die flagellengesteuerte Motilität von Escherichia coli mit drei etablierten Methoden systematisch charakterisieren. Diese Techniken ermöglichen die Analyse individueller und kollektiver Bewegungsmuster.

Untersuchung der Flagellen-getriebenen Motilität in Escherichia coli durch Anwendung von drei etablierten Techniken in einer Serie (Video) | JoVE Journal

Untersuchung der Flagellen-getriebenen Motilität in Escherichia coli durch Anwendung von drei etablierten Techniken in einer Serie

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