Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

Dieses Protokoll bietet ein einzigartiges Werkzeug für die Erzeugung und Isolierung von Chlamydien mit veränderten Entwicklungsprofilen, was letztlich die Identifizierung der Gene ermöglicht, die den Entwicklungszyklus regulieren. Die Hauptvorteile dieser Methode sind die Möglichkeit, die Entwicklung von Chlamydien-Zellen in Echtzeit zu verfolgen und die Fähigkeit, Chlamydien zu isolieren, mit Alter-Entwicklungsprogrammen. Um einen Chlamydien-Trachomatis-Reporter zu mutagenisieren, sah man einen Chlamydienbestand, der etwa dreimal den zehnten bis siebten Elementarkörper enthielt.

Transformiert mit dem Reporter Plasma von Interesse und Pellet, wird der Gedanke durch Zentrfugation bestückt. Verwenden Sie die Beschallung mit 10% Leistung für 10 Sekunden, um die Elementarkörper in 100 Mikroliter des versehentlichen Stoffwechselpuffers wieder auszusetzen und die resultierende Elementarkörpersuspension gleichmäßig zwischen zwei 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren aufzuteilen. 50 Mikroliter frisch zubereitete EMS-Metabolismuslösung in die Chlamydien-Aliquots für Mutagenese und 50 Mikroliter Impfstoffwechselpuffer nur für die Stockmutagenese in das Chlamydien-Aliquot geben und beide Proben 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

EMS ist ein bekannter krebserregender Verschleißhandschuhe während der Handhabung und tränkt alle EMS-verunreinigten Geräte und Medien 24 Stunden vor der Entsorgung in einem Molaren-Natriumhydroxid ein. Aufbau einer Großhandelskultur, für die Bildgebung und Isolierung der befruchteten Chlamydien-Trachometer. Samen sechs Gutglas-Bodenplatten, mit sechs mal 10 bis fünf kosten sieben Zellen, in zwei Milliliter komplettem Medium pro Brunnen und Samen eine 24 Brunnen Polystyrolplatte mit 10 bis die fünfte Ursache sieben Zellen in einem Milliliter komplettes Medium pro Brunnen.

Um die Wirtszellkultur mit mutagenisierten Abscheu chlamydia trachomatis infizieren, fünf Brunnen einer Glasbodenplatte mit etwa sechs mal 10 bis fünf, von mutagenisierten Elementarkörpern. In 1,5 Milliliter eiskaltem HBSS pro Brunnen. und infizieren sie den restlichen Brunnen, mit etwa zwei mal 10 bis fünf mundtagenisierten Elementarkörpern in 1,5 Millilitereisis HBSS pro Brunnen, nach einer 15-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius, mit Schaukeln, waschen Sie die infizierten Zellen mit 37 Grad Celsius HBSS, ergänzt mit einem Milligramm pro Milliliter Heparin, gefolgt von einer HBSS Spülung.

Waschen Sie die Zellen wieder mit Heparin, gefolgt von zwei Spülungen mit HBSS allein, um sicherzustellen, dass das gesamte Heparin entfernt wird. Nach der letzten Wäsche, fügen Sie vier Milliliter von 37 Grad Celsius Bildgebungsmedium, um jeden Brunnen. Und füllen Sie die Zwischenräume mit 37 Grad Celsius entionisiertem Wasser und legen Sie die Platten dann 10 Stunden lang in den Zellkultur-Inkubator.

Am Ende der Inkubation setzen die Mikroskop-Stufe Inkubator auf 5% Kohlendioxid, und 37 Grad Celsius. Und legen Sie die sechs Gutglas-Bodenplatte in den Bühnen-Inkubator. Verwenden Sie in der Imaging-Software das Hochauflösende-Screening-Plugin, um die sechs Well-Platten-Vorlagen auszuwählen, und erstellen Sie eine Bildpositionsliste, die aus 12 Sichtfeldern pro Brunnen besteht, um den Fokus für die automatisierte Bildgebung festzulegen und die Belichtung auf 250 Millisekunden bei einer Intensität von 4 % im GFB-Kanal und einer Dichte von 18 % im RFP-Kanal einzustellen.

Also während des Bildgebungszyklus für 24 Stunden, mit 30-Minuten-Intervallen, um die Kinetik des Entwicklungszyklus zu erfassen und die Bildaufnahme so einzustellen, dass sie mehrere Z-Stacks mit einem Fokusbereich enthält, der auf beiden Seiten des InFocus-Slices endet, wählen Sie dann relatives Z für die Bildgebung, mehrere Slices im Erfassungsfenster und verwenden Sie die Option Bildstapeldatei. , um die zu speichernden Bilder als TIFF-Stack-Dateien festzulegen. Um Einschlussspuren mit Änderungsentwicklungsprofilen zu identifizieren, verwenden Sie die Importzelle im EMS-Bildschirm, Markdown-Python-Notebook, um die Einschlussspurdaten aus den Spots in der Spurstatistik, CSV-Dateien in den Datenrahmen des Pandas zu importieren.

Verwenden Sie die Berechnungszelle, um die Zeit für den maximalen Ausdruck für die frühen und späten Reporter für jede Spur zu berechnen, und verwenden Sie das Bokeh-Plottingpaket in der halben max Plotzelle, um die Zeit von zwei halb maximaler Expression bis zur hälften maximalen Expression im Gegenwert von hctB prom zu visualisieren. Verwenden Sie den interaktiven Track-ID-Explorer bokeh, um Einschlüsse aus der mutierten Population zu identifizieren, die außerhalb der mockbehandelten Streuwolke liegen. Um Veränderungen in der Promotorexpression Kinetik dynamisch im animierten Blutzelldiagramm zu visualisieren, werden die Expressionsintensitäten des EOU-Prom gegen hctB prom dargestellt.

Visualisieren Sie dann einen Snapshot aus dem animierten Diagramm in der Einschluss-Locator-Zelle. Um die entwicklungsfördernden Newtons zu isolieren, von den Einschlüssen von Interesse, positionieren Sie das Sichtfeld über einen Brunnen mit einem identifizierten Einschluss, und übergeben Sie die Nadel über die Phase Differential Interferenz Kontrast weiße Lichtkanal Lichtquelle, um die Nadel zu visualisieren, verwenden Sie die 595 Nanometer, Anregungskanal, um die Elementarkörper für die Extraktion zu visualisieren. Und verwenden Sie die Feineinstellung und den Mikromanipulator, um die Kapillarnadel auf die Aufnahme zu manövrieren, die Aufnahme mit der Nadel zu brechen und den Mikroinjektor zu verwenden, um die Elementarkörper in die Kapillarnadelspitze zu ziehen.

Die extrahierten Elementarkörper aus der Kapillarnadel in einen einzigen Brunnen der bei 24 Brunnen polystyrolplatte hergestellten, und verwenden Sie eine neue Kapillarnadel für die nächste Extraktion. Nach ausreichender Ausdehnung jedes Isolats die infizierte Monoschicht mit einer Ein-Milliliter-Mikropipetspitze stören und die mittleren Zellablagerungen übertragen und Chlamydien in ein neues 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr freigeben. Pellet die geernteten Chlamydien durch Zentrifugation, und resuspendieren Sie das Pellet in 75 Mikroliter eiskalten, Saccharosephosphat Glutamat Puffer, dann teilen Sie die Einschlusssuspension gleichmäßig, zwischen drei neuen 1,5 Milliliter Schraubverschluss Mikrozentrifugenrohre, und speichern Sie die Rohre bei minus 80 Celsius zu lesen.

Um eine Wirtszellkultur für die Bildgebung von Mutagenen einzurichten, isoliert ISED Samen eine 96 Gutglasbodenplatte mit 1,6 mal 10 bis zur vierten kosten sieben Zellen, in 100 Mikroliter komplettem Medium pro Brunnen. Nachdem die Wirtszellmonoschicht die geernteten mutierten Klone und Wildtyp-Chlamydienbestände auf Eis erreicht hat, und verwenden Sie eine Säule pro Isolat, um eine zweifache serielle Verdünnung jedes mutierten Isolats durchzuführen. Infizieren Sie die verbleibende Säule mit Wildtyp-Chlamydien, bei einer Vielzahl von Infektionen von etwa 0,5, und legen Sie eine Platte in den Zellkultur-Inkubator für 10 Stunden am Ende der Inkubation, wählen Sie drei Brunnen pro mutiertem Isolat, die einer Vielzahl von Infektionen von weniger als einem entsprechen, und erzeugen Eine bildgebende Position Liste.

bestehend aus zwei Sichtfeldern pro Brunnen. In diesem Streudiagramm kann die Zeit bis zur Hälfte maximaler Expression der EOU- und hctB-Promotoren aus einzelnen Chlamydien-Isolaten beobachtet werden, die Klone A3667 und B3858 wurden für die Isolierung gewählt, da sie kürzere Zeiten erzeugten, um maximalen Ausdruck zu haben, vom EOU-Promoter und längeren Zeiten vier hctB. Einschlüsse mit veränderter Kinetik können anhand der Visualisierung, der dynamischen Genexpression der beiden Promotoren identifiziert werden, und eine Momentaufnahme des animierten Graphen kann verwendet werden, um den Ort der von Interesse sindden Einschlüsse zu identifizieren.

In diesen repräsentativen Visualisierungen wurden insgesamt 24 Einschlüsse für die Isolierung identifiziert, von denen 10 Differentialkinetik aufwiesen, bei erneuten Tests in drei verschiedenen phäotypischen Kategorien zeigten acht Isolate eine verringerte EOU-Promotorexpression nach etwa 24 Stunden nach der Infektion. Wie der A3667-Klon, das B3858-Isolat, zeigte auch eine verringerte EOU-Promotorexpression, etwa 24 Stunden nach der Infektion. Aber eine allgemeine Zunahme der hctB-Promotorexpression, während das B3662-Isolat erhöhte Blütenstände des EOU-Promotors ausdrückte, gefolgt von einem plötzlichen Ausdrucksverlust bei beiden Promotoren.

Die Analyse der lebenden Zellmikroskopie für mutierte B3662 zeigt, dass die Wirtzelllyse in Zellen, die mit dieser Mutante infiziert sind, viel früher auftrat als in wild infizierten Zellen. Zelltyp Entwicklung mangelhafte Chlamydien-Wiederherstellung, möglicherweise nicht möglich, da diese Zellen den Wirt nicht reinfizieren können. Genomweite Assoziationsstudien können nach der Isolierung verwendet werden, um Entwicklungsgene durch statistische Korrelation zu identifizieren, mit der Einbeziehung von alternativen Promoter-Reportern.

Diese Methode kann auf die Sondierung zahlreicher genetischer Pfade, auf die Zerlegung genetischer Schaltkreismechanismen und anderer intrazellulärer Krankheitserreger ausgedehnt werden.