Anwendung der Laser-Mikrodissektion zur Aufdeckung der regionalen Transkriptomik im menschlichen Nierengewebe
June 9th, 2020
Wir beschreiben ein Protokoll für die Lasermikrodissektion von Untersegmenten der menschlichen Niere, einschließlich des Glomerulus, proximalen Tubuli, dick aufsteigender Gliedmaße, Sammelkanal und Interstitium. Die RNA wird dann aus den erhaltenen Kompartimenten isoliert und die RNA-Sequenzierung wird durchgeführt, um Veränderungen in der transkriptomischen Signatur innerhalb jedes Teilsegments zu bestimmen.
Die Lasermikrodissektion ermöglicht die transkriptomische Analyse von räumlich definierten Regionen innerhalb der Nierengewebeproben. Dies ermöglicht uns die einzigartige Möglichkeit, auch nach krankheitsinduzierten Veränderungen interessante Strukturen zu identifizieren. Die Hauptvorteile dieser Methodik sind ihre Komplementarität zu anderen Omics-Technologien, wie z. B. der Einzelzell-RNA-Sequenzierung.
Es ermöglicht eine bemerkenswerte Gewebeökonomie und ermöglicht sogar den Nachweis von schwach exprimierten Transkripten. Schneiden Sie die Probe nach der Entnahme der Gewebeprobe mit einem auf minus 20 Grad Celsius eingestellten Kryostaten auf eine Dicke von 12 Mikrometern und fixieren Sie die Probe mit dem Objektträgeradapter auf einem speziellen Laser-Mikrodissektionsobjektträger. Mischen Sie innerhalb von 10 Tagen nach der Kryosektion 89,2 Mikroliter RNase-freies 10%BSA in PBS mit vier Mikrolitern FITC-Phalloidin, 1,5 Mikrolitern DAPI, zwei Mikrolitern des Antikörpers von Interesse, der direkt an Alexa Fluor 546 konjugiert ist, und 3,3 Mikroliter RNase-Inhibitor.
Waschen Sie die Rutsche eine Minute lang bei minus 20 Grad Celsius 100% Aceton und legen Sie die Rutsche in eine Feuchtigkeitskammer. Waschen Sie die Oberseite der Folie zweimal 30 Sekunden lang pro Waschgang mit frischem RNase-freiem PBS, gefolgt von zwei 30-Sekunden-Wäschen mit 10 % BSA in RNase-freiem PBS. Behandeln Sie die Probe nach dem letzten Waschen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie sie zwei weitere Male mit 10 % BSA in RNase-freiem PBS waschen.
Nach dem zweiten Waschen trocknen Sie den Objektträger fünf Minuten lang in einer Gewebekulturhaube an der Luft, bevor Sie ihn auf die Lasermikrodissektions-Schneidplattform laden. Installieren Sie autoklavierte 500-Mikroliter-Mikrozentrifugen-Sammelröhrchen, die für PCR-Arbeiten geeignet sind und 50 Mikroliter Extraktionspuffer aus einem RNA-Isolationskit enthalten, auf dem Gerät. Identifizieren Sie nach dem Laden die interessierenden Bereiche innerhalb der Probe anhand von Färbung, Morphologie und Standort.
Verwenden Sie Immunfluoreszenz, um mindestens 500.000 Mikrometer große quadratische Segmente zu umreißen. Initiieren Sie dann die Lasermikrodissektion, um die Region mit einer Laserleistung von mehr als 40 herauszuschneiden. Verschließen Sie nach Abschluss des Lasermikrodissektionsprozesses die Sammelröhrchen der Mikrozentrifuge und schnippen Sie kräftig mit den Röhrchen, um sicherzustellen, dass der Inhalt von den Kappen zum Boden der Röhrchen gelangt.
Nach der Zentrifugation inkubieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang in einem 42 Grad heißen Wasserbad, bevor Sie die Röhrchen erneut zentrifugieren. Anschließend werden die Überstände aus der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius in neue 500-Mikroliter-Röhrchen umgefüllt. Die Identifizierung von tubulären Untersegmenten in der Niere erfolgt durch Antikörperfärbung einzigartiger tubulärer Marker zusätzlich zur Zellmorphologie und strukturellen Orientierungspunkte.
Die Fluoreszenzmarkierung in Verbindung mit morphologischen Gewebemerkmalen und der räumlichen Positionierung der Bildstrukturen ermöglicht die Visualisierung von Nierenuntersegmenten mit einem hohen Maß an Sicherheit. In dieser repräsentativen Downstream-Sequenzierungsanalyse lag die Erfolgsrate bei der Einhaltung der minimalen Dissektionsflächeneingabe bei mehr als 90 %, was zu einer hohen Gesamtmenge an mRNA führte, die für den Gennachweis zur Verfügung stand. In dieser Analyse erreichten 100 % der Proben die minimale Nachweisschwelle von mindestens 10.000 Genen.
Nach der Lasermikrodissektion kann die Anreicherungsanalyse der Genexpression bekannter Marker mit denen aus anderen Kompartimenten verglichen werden. In dieser Analyse wurde ein Marker für jedes Untersegment durch Lasermikrodissektion mittels regionaler Transkriptomik identifiziert, die auch eine spezifische immunhistochemische Färbung des entsprechenden Nephron-Untersegments ergab. Es ist wichtig zu beachten, dass die Lasermikrodissektion stark auf das Fachwissen des Benutzers angewiesen ist, um die zu präparierenden Strukturen von Interesse genau zu identifizieren.
Diese Technik ermöglicht die Untersuchung spezifischer regionaler Genexpressionssignaturen, die zur Beurteilung potenzieller Signalwege verwendet werden können, die am Fortschreiten der Krankheit beteiligt sind, sowie der Biologie von gesundem Gewebe.
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Überblick
Diese Studie präsentiert ein Protokoll für die Laser-Mikrodissektion spezifischer Teilsegmente innerhalb des menschlichen Nierengewebes, einschließlich des Glomerulus und des proximalen Tubulus. Die isolierte RNA aus diesen Kompartimente ermöglicht eine transkriptomische Analyse, um Veränderungen in den Genexpressionsmustern aufzudecken, die mit verschiedenen Nierenstrukturen assoziiert sind.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Transkriptomische Analyse
- Nierenbiologie
- Untersuchung der Krankheitsprogression
Hintergrund
- Bedeutung der Untersuchung von Nieren-Teilsegmenten
- Herausforderungen bei der Analyse räumlich definierter Strukturen nach einer Erkrankung
- Komplementarität mit anderen Omics-Technologien
Verwendete Methoden
- Laser-Mikrodissektion
- Humane Nierengewebeproben
- RNA-Isolierung und -Sequenzierung
Hauptergebnisse
- Hohe Erfolgsrate bei der Dissektion und RNA-Wiedergewinnung
- Identifizierung von Genexpressionsmarkern für Nieren-Teilsegmente
- Potenzielle Signalwege im Zusammenhang mit der Krankheitsprogression gezeigt
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll demonstriert eine effektive Methode zur Untersuchung der regionalen Genexpression in der Niere.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der Nierenbiologie und potenzieller Krankheitsmechanismen bei.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Laser microdissection enables spatially resolved transcriptomic profiling of human kidney tissue, addressing a critical gap in discovery biology where dissociation-based methods lose anatomical context. This approach supports target validation by linking gene expression signatures to defined nephron sub-segments, enhancing mechanistic de-risking in renal disease models. The method provides predictive confidence for pathway interrogation and portfolio prioritization in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping gene expression to anatomically defined kidney compartments.
- Operational Value: Supports biological de-risking through spatially anchored transcriptomic signatures that maintain tissue context.
- Predictive Value: Facilitates target confidence by correlating regional marker expression with functional sub-segment identity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream omics workflows by isolating high-integrity RNA from microdissected regions.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through QC parameters assessing specimen adequacy and dissection success rates.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation by providing quantitative, spatially resolved transcriptomic outputs for screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery findings to preclinical validation through disease-relevant system modeling using human kidney sub-segments.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development by identifying compartment-specific gene expression profiles detectable in tissue.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs preclinical decision-making by revealing pathway activity in anatomically precise disease-affected regions.
Pipeline & Workflow Integration
Laser microdissection fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, enabling spatially resolved molecular profiling that bridges imaging and omics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking gene expression to structural landmarks in kidney tissue.
- Screening: Delivers assay readiness through high-success-rate dissection (>90%) and sufficient RNA yield for sequencing applications.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (gene detection thresholds ≥10,000 genes) enabling cross-condition comparison.
- Translational Research: Advances preclinical continuity by preserving spatial context lost in dissociation-based methods.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across tissue types via antibody marker substitution, supporting platform-wide adoption.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in renal target validation.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through defined workflow parameters and QC checkpoints.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling risk-adjusted prioritization based on sub-segment-specific biology.
- Portfolio Impact: Supports capital efficiency through early de-risking of renal targets using spatially resolved evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence staining and morphological identification of renal sub-segments.
- Dependent on laser microdissection platforms and RNA isolation kits compatible with low-input samples.
- Necessitates cross-team standardization for staining protocols, dissection thresholds, and QC metrics.
- Adaptation across models requires validation of antibody markers and structural landmarks in target tissues.
- Practical limitations include user-dependent precision in region identification and RNA integrity maintenance during processing.
