Eine quantitative Nachweismethode für microRNAs in der Niere eines Mausmodells mit ischämischer Nierenschädigung

Eine veränderte Expression von microRNA in AKI kann für Biomarker und Therapie nützlich sein. Dieses Protokoll ist einfach und erzielt konstante Ergebnisse zwischen den Labors. Die IRI der Niere stellt einen der Hauptrisikofaktoren für AKI dar. Die Quantifizierung von microRNAs, die durch IRI verändert werden, führt zu einer Diagnose. MicroRNAs, die aus der Nierenprobe aufgereinigt werden, werden auf andere Systeme aufgebracht. Überwachen Sie während des gesamten Eingriffs sorgfältig auf Unterkühlung, Darmbefeuchtung und Narkosetiefe. Das liegt daran, dass es viele manuelle Techniken gibt, an die man sich gewöhnen muss.

Nachdem Sie bestätigt haben, dass es keine Reaktion auf das Einklemmen der Zehen gibt, legen Sie die betäubte Maus in Rückenlage auf eine beheizte Operationsunterlage. Nachdem Sie einen Mittellinienschnitt gemacht haben, verwenden Sie ein mit PBS angefeuchtetes Wattestäbchen, um den Darm vorsichtig auf die linke Seite der zusätzlichen Bauchhöhle zu schieben, um die rechte Niere und den Harnleiter freizulegen, und verwenden Sie eine abgewinkelte Pinzette, um den rechten Harnleiter anzuheben. Lizieren Sie den Harnleiter an zwei Stellen mit 4-0 geflochtenen Seidennähten, lassen Sie längere Bänder für die Naht, die näher an der Niere liegt, und schneiden Sie zwischen den Nähten. Halten Sie die verbleibende Naht vorsichtig fest, präparieren Sie stumpf das Bindegewebe und das Fett entlang der Niere und identifizieren Sie ein Blutgefäß, das nicht die Nierenarterien oder -venen sind, die die rechte Niere mit Blut versorgen. Ligatieren Sie das Gefäß und, wenn die rechte Niere ausreichend abgelöst wurde, die Nierenvene und die Arterie. Schieben Sie den Darm mit einem mit PBS angefeuchteten Wattestäbchen vorsichtig auf die rechte Seite der zusätzlichen Bauchhöhle, um die linke Niere freizulegen und den Darm mit einem angefeuchteten Tuch zu bedecken. Nachdem Sie die linke Niere wie gezeigt vorbereitet haben, klemmen Sie die Nierenarterie und die Vene einen Zentimeter von der Niere entfernt, um eine Ischämie der linken Niere auszulösen. Eine erfolgreiche Ischämie kann durch eine allmähliche gleichmäßige Verdunkelung des Nierengewebes visuell bestätigt werden. Wenn eine Ischämie bestätigt wird, führen Sie das Darmgewebe in die Bauchhöhle zurück, achten Sie darauf, dass sich der Darm nicht verdreht, und schließen und drapieren Sie die Bauchhaut vorübergehend. Entfernen Sie nach 25 bis 45 Minuten die Klemme und bestätigen Sie, dass sich die Durchblutung und die Nierenfarbe verbessern. Nachdem Sie bestätigt haben, dass der Darm nicht verdreht ist, instillieren Sie intraperitoneale PBS und verschließen Sie den Bauchmuskel und die Haut in zwei Schichten mit 4-0-Nylonnähten. 24 Stunden nach der Einleitung einer ischämischen Verletzung öffnen Sie den Mittellinienschnitt wieder und verwenden Sie eine 27-Gauge-Nadel, um das Blut aus der unteren Hohlvene zu sammeln. Machen Sie einen Mittellinienschnitt in der Brustwand und führen Sie eine 23-Gauge-Nadel in den linken Ventrikel ein. Nachdem Sie den Rückfluss in die Nadel bestätigt haben, machen Sie einen Schnitt in den rechten Leberlappen und injizieren Sie 20 Milliliter PBS. Die Leber färbt sich rot in rosa, was bestätigt, dass ausreichend Blut abgelassen wurde. Verwenden Sie eine Zange und eine Schere, um die linke Niere zu entfernen, und waschen Sie das herausgeschnittene Gewebe in einer Schale mit PBS. Verwenden Sie dann die Pinzette, um die Nierenfaszie zu entfernen, ohne die Niere auszutrocknen, und schneiden Sie die Niere entlang der vertikalen Mittellinie in zwei Hälften. Für die microRNA-Aufreinigung geben Sie 30 Milligramm der gefrorenen Nierenprobe in einen Glashomogenisator mit 700 Mikrolitern Lysereagenz auf Phenylguanidin-Basis auf Eis und drehen Sie den Stößel langsam und wiederholt, um die Probe vollständig zu homogenisieren. Wenn das Gewebe vollständig dissoziiert ist, wird das homogenisierte Lysat in einem Zwei-Milliliter-Sammelröhrchen in das Biopolymer-Zerkleinerungssystem in einer Mikrozentrifugen-Spin-Säule überführt und die Probe durch Zentrifugation auf den Boden des Röhrchens gebracht. Das Lysat wird in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit 140 Mikrolitern Chloroform überführt und das Röhrchen 15 Sekunden lang invertiert, wobei die Kappe fest angezogen ist. Nach einer zwei- bis dreiminütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Probe durch Zentrifugation sedimentiert und der Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit dem 1,5-fachen Volumen von 100 % Ethanol überführt, ohne das Pellet zu stören. Mischen Sie die Probe fünf Sekunden lang, indem Sie sie vortexen, bevor Sie 700 Mikroliter der Probe in eine Spin-Säule auf Siliziumdioxidmembranbasis in einem Zwei-Milliliter-Sammelröhrchen überführen. Nach einer kurzen Zentrifugation verwerfen Sie den Durchfluss und waschen Sie die Probe zweimal pro Waschgang mit 500 Mikrolitern Waschpuffer 2 in einer neuen Schleudersäule auf Basis von Kieselsäuremembranen, um alle Salzspuren zu entfernen. Nach dem zweiten Waschen zentrifugieren Sie die auf Kieselsäuremembranen basierende Spin-Säule erneut und überführen Sie die Säule nach dem Verwerfen des Durchflusses in ein neues 1,5-Milliliter-Sammelröhrchen. Geben Sie 25 Mikroliter RNase-freies Wasser in die Säule und inkubieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie die Probe erneut zentrifugieren. Übertragen Sie dann das 25 Mikroliter große microRNA-haltige Eluit in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. In dieser Studie wurden sieben microRNAs untersucht, die beim Menschen exprimiert wurden und in den Nieren von Mäusen mit akutem Nierenversagen hochreguliert waren. Es wurde festgestellt, dass die Spiegel von sechs der microRNAs in den Nieren von Mäusen mit Ischämie-Reperfusionsverletzung im Vergleich zu denen in Scheinmäusen signifikant erhöht waren, wobei quantitative Echtzeit-PCR gezeigt wurde. Der Harnstoffstickstoff- und Kreatininspiegel im Serumblut sowie die akute tubuläre Nekrose waren ebenfalls signifikant hochreguliert.

Die Biomarker für die IRI-Diagnose und die spezifische Behandlung von AKI sind nach wie vor unklar. Ich hoffe, dass die microRNA-Forschung voranschreitet und zur Diagnose und Behandlung von AKI beiträgt.