Name: Erstellung übereinstimmender In vivo/In vitro Patienten-abgeleiteter Modellpaare von PDX- und PDX-abgeleiteten Organoiden für die Krebspharmakologieforschung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 49 s
Description: Erfahren Sie die Erstellung von Organoiden aus Patienten-xenografts für die Krebsforschung. Diese Methode ermöglicht abgestimmte In-vivo/In-vitro-Modelle zur verbesserten Wirkstoffscreening.

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Die Autoren danken Dr. Jody Barbeau, Federica Parisi und Rajendra Kumari für die kritische Lektüre und Bearbeitung des Manuskripts. Die Autoren danken auch dem Crown Bioscience Oncology in vitro und in vivo Team für ihren großen technischen Aufwand.

Alle Protokolle und Änderungen oder Verfahren, die die Pflege und Verwendung von Tieren betreffen, wurden vor der Durchführung der Studien vom Crown Bioscience Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) überprüft und genehmigt. Die Pflege und Verwendung von Tieren wurde in Übereinstimmung mit den internationalen Richtlinien der AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) durchgeführt, wie im Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, National Research Council (2011) berichtet. Alle Tierversuche wurden unter sterilen Bedingungen in SPF-Einrichtungen (spezifisch pathogenfrei) durchgeführt und in strikter Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren verschiedener Regierungsinstitutionen (z. B. The National Institutes of Health) durchgeführt. Die Protokolle wurden vom Ausschuss für die Ethik der Tierversuche an der Einrichtung (z. B. institutioneller IACUC-Ausschuss) genehmigt.
1. Vorbereitung auf die Tumortransplantation
<ol><li>
Tierhaltung
	<ol>
<li>Haus Balb/c Nacktmäuse (n=5) in einzelnen belüfteten Käfigen, bei 20-26 °C, 30-70% Luftfeuchtigkeit und einem Beleuchtungszyklus von 12-h hell/12-h dunkel, mit wöchentlich gewechselter Maiskolbeneinstreu und Bestrahlung sterilisiertes Trockengranulatfutter plus steriles Trinkwasser ad libitum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Präparation von Spendertumorfragmenten
	<ol>
<li>Überwachen Sie tumortragende Spendermäuse genau auf Körpergewicht (BW, über Waage) und Tumorvolumen (TV, durch Messschiebermessung).</li>
		<li>Wenn der Fernseher 800-1000 mm3erreicht, euthanasieren Sie die tumortragenden Tiere in einer biogefährlichen Haube.<ol>
<li>Legen Sie Mäuse in eine Euthanasiekammer mit einem Deckel, der CO2-Gas in die Kammer abgibt. Entladen Sie Gas in die Kammer mit einer Durchflussrate, die schnelle Bewusstlosigkeit mit minimaler Belastung für das Tier erzeugt. Der optimale Durchfluss für CO2 liegt bei etwa 2-2,5 Lpm.</li>
			<li>Stellen Sie die Euthanasie sicher, indem Sie beobachten, dass die Tiere das Bewusstsein nicht wiedererlangen.</li>
			<li>Nach dem offensichtlichen klinischen Tod den Gasfluss für >1 Min aufrechterhalten, um die Möglichkeit zu minimieren, dass sich ein Tier erholen kann.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sterilisieren Sie die Haut um den Tumor mit Jodophorabstrichen. Sammeln Sie Tumore, indem Sie benachbarte Nicht-Tumorgewebe entfernen und in eine Petrischale mit 20 ml PBS legen, die vor der Euthanasie vorgekühlt (4 °C) ist.</li>
		<li>Waschen Sie die Tumoren mit PBS in einer anderen Petrischale, um Blutbestandteile zu entfernen, gefolgt von halbieren und zusätzliche Haut, Blutgefäße, Verkalkungen und / oder Nekrose entfernen.</li>
		<li>Legen Sie nur intakte Tumorstücke in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit 20 ml PBS, bevor Sie es zur Transplantation in einen separaten Tierraum transportieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Subkutanes Tumorwachstum
<ol><li>
Subkutane Impfung von Tumorstücken in immungeschwächte Mäuse
	<ol>
<li>Schneiden Sie den PDX-Tumor mit einem Skalpell in 2 mm große Stücke und legen Sie sie zur subkutanen (SC) Implantation in Trokare.</li>
		<li>Betäubung der Empfängertiere mit 5% Isofluran (gehalten durch einen Nasenkegel bei 1%). Die Tiere entspannen sich, verlieren ihren Aufrichtreflex und werden schließlich unbeweglich, bis sie nicht mehr auf Schmerzen reagieren. Fixieren Sie die betäubten Mäuse auf einem Experimentierbrett in der richtigen seitenseitigen Position und sterilisieren Sie mit Iodophorabstrichen, insbesondere die Bereiche, die den Ort der Tumorimpfung umgeben.</li>
		<li>Auf der linken Flankenhaut nur kranial zur Hüfte, machen Sie einen 0,5 cm Schnitt mit einem Skalpell und schaffen Sie einen Tunnel unter der Haut in Richtung vordere Stirn, 2-3 cm, mit stumpfer Zette.</li>
		<li>Übertragen Sie aseptisch einen Würfel Tumorfragment pro Impfstelle aus dem Medium und legen Sie tief in den subkutanen Tunnel. Bestätigen Sie visuell die Position des Fragments vor dem Schließen der Wunde mit Wundclips.</li>
		<li>Überwachen Sie die tumorimplantierten Mäuse (5), bis sie bei Bewusstsein sind, um das sternale Liegerad aufrechtzuerhalten, und bringen Sie sie erst nach ihrer vollständigen Genesung von der Anästhesie in ihren Käfig zurück.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tumortragende Mäuse-Gesundheitsüberwachung
	<ol>
<li>Überprüfen Sie den Wasser- und Nahrungsverbrauch täglich und erfassen Sie wöchentlich das Körpergewicht.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Mäuse während der Routineüberwachung. Erfassen Sie alle Auswirkungen auf Mobilität, Atmung, Pflege und allgemeines Aussehen, Nahrungs- und Wasserverbrauch, BW-Gewinn / -Verlust, Aszites usw.</li>
		<li>Messen Sie TV zweimal wöchentlich mit Bremssätteln und drücken Sie in mm3 per: TV = 0,5 a × b2, wobei a und b die Länge bzw. Breite des Tumors sind.</li>
		<li>Opfere Tiere, um Proben zu sammeln, wenn eines der folgenden Anzeichen auftritt: BW-Verlust >20%; eingeschränkte Mobilität (nicht in der Lage zu essen oder zu trinken); nicht in der Lage, sich normal zu bewegen, aufgrund von signifikantem Aszites oder vergrößertem Bauch; Anstrengung in der Atmung; Tod.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Nekropsie und Tumorernte
<ol><li>Wenn das Tumorvolumen 200-800 mm3erreicht hat, euthanasieren Sie Mäuse gemäß den zugelassenen Protokollen (siehe Schritt 1.2.2).</li>
	<li>Sammeln Sie Tumorgewebe, indem Sie benachbarte Nicht-Tumorgewebe entfernen, gefolgt von einem 50-ml-Kunststoffröhrchen mit AD+++ (auf Eis) vor der Dissoziation.</li>
</ol>4. Vorbereitung für PDX-abgeleitete Organoidkultur
HINWEIS: Alle folgenden Schritte wurden in einer Biosicherheitswerkbank gemäß den Standardrichtlinien für Gewebekulturen durchgeführt. Bewahren Sie vorgewärmte Bestände von 96-, 24- und 6-Well-Platten vor Gebrauch in einem 37 °C-Inkubator auf.
<ol><li>Reagenzpräparate<ol>
<li>Bereiten Sie die Lösung des Basalmembranextrakts (BME) vor (Wachstumsfaktor reduziert, Phenolrot-frei). Bewahren Sie 10 ml BME über Nacht in einem 4 °C-Kühlschrank auf. Nach dem Auftauen die BME-Flasche schwenken, um die Dispersion zu gewährleisten.</li>
		<li>Bereiten Sie Basismedien / Waschpuffer AD++ vor. 5 ml 200 mM L-Glutamin, 1 M HEPES und Pen/Strep werden zu Advanced DMEM/F12-Medien hinzugefügt, indem Sie mit einer 5-ml-Pipette pipettieren.</li>
		<li>Herstellung des organoiden Darmmediums wie von Sato et al.18 beschrieben durch Ergänzung der Basismedien mit N-Ac (1 mM), A83-01 (500 nM), B27 (1x), EGF (50 ng/ml), Noggin (100 ng/ml), Nicotinamid (10 mM), SD202190 (10 nM), R-Spondin (500 ng/ml), L-Glutamin (2 mM), HEPES (10 μM), Penicillin-Streptomycin (1x) und Y-27623 (10 μM)19.</li>
		<li>AD+++Verdauungsmedium vorbereiten: 10 ml 1x organoide Kulturmedien mit 500 μL Kollagenase Typ II (20 mg/ml) und 10 μL RhoKI Y-27632 (10 mM).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tumordissoziation20<ol>
<li>Übertragen Sie den Tumor in einem 50 ml Kunststoffschlauch in eine 10 cm große Petrischale. Machen Sie ein makroskopisches Foto neben einem Lineal und zeichnen Sie eine Beschreibung seiner Bedingungen auf (z. B. Größe, Fettgewebe, Vaskularisation, Nekrose usw.).</li>
		<li>Entfernen Sie überschüssiges AD+++ durch Aspiration und schneiden Sie das Tumorgewebe mit einer Schere in kleine Stücke, gefolgt von der Übertragung von 1-2 Stücken in ein 2 ml Mikroröhrchen zum Einfrieren auf Trockeneis. Für die genomische Profilierung bei -80 °C lagern. Die restlichen Stücke mit einer Schere in feinere Stücke schneiden, bevor sie mit AD+++ in ein 50-ml-Kunststoffrohr überführen werden.</li>
		<li>Hackfleisch 2-3 mal mit 35 ml AD+ waschen, gefolgt von zugabe von 10 ml Verdauungsmedium (siehe Schritt 4.1.4) und Platzierung auf einem Orbitalschüttler bei 4 x g für 1 h bei 37 °C.</li>
		<li>Homogenisieren Sie das verdaute Gewebe durch Pipettieren nach oben und unten mit einer sterilen 5-ml-Kunststoffpipette, gefolgt von der Zugabe von 20 ml AD+++ und der Filtration durch 100 μm Zellsieb.</li>
		<li>Waschen Sie den Durchlauf zweimal mit AD+++ (spinnen Sie bei 450 x g für 5 min), gefolgt von einer Resuspension in BME (fügen Sie 4x Volumen BME zum Pellet zur Suspension hinzu) und halten Sie es auf Eis19.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herstellung der Organoidkultur<ol>
<li>Fügen Sie die BME-Zellsuspension in mehreren Tropfen zu insgesamt 200 μL pro Vertiefung in die 6-Well-Platte ein.</li>
		<li>Die Platte wird in einen 37 °C Inkubator überführen. Nach 30 min erstarren die Geltropfen.</li>
		<li>Fügen Sie 2 ml organoide Medien zu jeder Vertiefung hinzu, wobei die repräsentativen Tropfen durch mikroskopische Fotografie aufgezeichnet werden, bevor sie in einen Inkubator überführt werden (37 °C und 5% CO2).</li>
		<li>Halten Sie die Organoidkulturen mit Mediumswechsel alle 3-4 Tage und Passage im Verhältnis 1: 2 alle 7 Tage oder abhängig von ihrem Wachstum und ihrer Dichte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Histopathologie und Next Generation Sequencing (NGS) Analyse
<ol><li>Histopathologie<ol>
<li>Sammeln Sie Organoide aus dem Brunnen mit dem vorhandenen Medium mit einer P1000-Pipette, gefolgt von Zentrifugation (Spin bei 450 x g für 5 min), Waschen mit PBS und Fixieren in 10% Formalin für 1 h.</li>
		<li>Legen Sie die fixierten Organoide in 100% Gelatine am Boden des konischen Röhrchens von 50 ml, gefolgt von einer routinemäßigen Gewebeverarbeitung und Einbettung.</li>
		<li>Führen Sie hämatoxylin-eosin (H & E) -Färbung mit Standardprotokollen auf 4 mm Paraffinabschnitten durch.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RNAseq- und Whole-Exom-Sequenzierung<ol>
<li>Sammeln Sie Organoide aus dem Brunnen mit dem vorhandenen Kulturmedium mit einer P1000-Pipette, gefolgt von der Zentrifugation mit einer Mikrozentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit (12.000 x g)für 5 min bei 4 °C.</li>
		<li>Sammeln Sie das Pellet, indem Sie den mittleren Überstand entfernen, um sicherzustellen, dass kein sichtbares BME vorhanden ist, gefolgt von einem Schnappgefrieren in einem Mikroröhrchen (Trockeneis) und dann in einen -80 ° C-Gefrierschrank überführen.</li>
		<li>Extrahieren Sie RNA oder DNA mit einem Standardverfahren von Herstellern und führen Sie NGS-Analysen sowohl für RNAseq als auch für die Gesamtetomsequenzierung (WES) durch.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. IC50 Assay20
<ol><li>Organoid-Aussaat in 384-Well-Platte für IC50-Assay<ol>
<li>Dissoziieren Sie Organoide in BME-Tropfen aus jeder Vertiefung (Verdauung von BME), indem Sie 20 μL 100x Dispaselösung zu jeder Vertiefung (6-Well-Platte) hinzufügen, die 2 ml organoides Medium enthielt, gefolgt von 10 Minuten Inkubation bei 37 ° C.</li>
		<li>Pipette verdaute Organoide aus allen Vertiefungen durch einen 70 μm-Filter in ein 50-ml-Kunststoffröhrchen, um die Organoide zu sammeln.</li>
		<li>Zählen Sie die Organoide unter Mikroskopie zur Bestimmung der Organoidkonzentration. Suspendieren Sie die Organoide mit Kulturmedium, bevor Sie BME hinzufügen, um eine Endkonzentration von 5% (v / v) auf Eis zu erreichen.</li>
		<li>Fügen Sie 50 μL der Organoidsuspension in jede 384-Well-Platte mit dem Flüssigkeitsspender hinzu, gemäß der Plattenkarte mit einer Aussaatdichte von 200 CR2110 PDXOs pro Vertiefung in entsprechendem Organoidkulturmedium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cisplatin und Irinotecan Behandlung<ol>
<li>Verwenden Sie Cisplatin (mit der höchsten Konzentration von 100 μM) und "Irinotecan" (mit der höchsten Konzentration von 10 μM). Fügen Sie SN-38 (ein Metabolit von Irinotecan, im Gegensatz zu Irinotecan, das normalerweise für In-vivo-Studien verwendet wird) zu jeder Vertiefung gemäß dem Verdünnungsschema des Arzneimittels für 9 Dosen in serieller Verdünnung durch digitales Dispener hinzu.</li>
		<li>Erstellen Sie die Platemap mit dem Software-Tool für digitale Spender. Fügen Sie ein Negativkontrollfahrzeug mit 100% Lebensfähigkeit und postiver Kontrolle von 5 μM Starurosporin ein, das 0% Lebensfähigkeit zeigte.</li>
		<li>Legen Sie die mit Medikamenten behandelten 384-Well-Platten wieder in einen 37 °C-Inkubator.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestimmung der Lebensfähigkeit von Organoidzellen nach medikamentöser Behandlung<ol>
<li>Bestimmen Sie am Ende der 5 Tage der medikamentösen Behandlung die Lebensfähigkeit der Organoidzellen mit lumineszierenden Zelllebensfähigkeitsreagenzien gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Verfahren. Fügen Sie mit dem flüssigen Dispener in jede Vertiefung ein lumineszierendes Reagenz hinzu und mischen Sie es für 5 minuten auf einem Plattenschüttler, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln.</li>
		<li>Zeichnen Sie das Lumineszenzsignal auf einem Lumineszenz-Multi-Well-Plattenleser auf.</li>
		<li>Berechnen Sie die normalisierten Viabilitäten jeder Vertiefung unter Verwendung der Rohwerte des Plattenlesers und erstellen Sie eine Dosis-Wirkungs-Kurve und IC50-Werte durch nichtlineare Kurvenanpassung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Alle Autoren sind die derzeitigen Vollzeitmitarbeiter von Crown Bioscience, Inc.

Die vorläufigen Daten für PDX-/PDXO-CR2110 in diesem Bericht unterstützen die biologische Äquivalenz zwischen PDX und seinem Derivat PDXO in Bezug auf Genomik, Histopathologie und Pharmakologie, da beide Modelle die Krankheitsformen darstellen, die vom ursprünglichen CSC des Patienten abgeleitet wurden. Beide Modelle sind patientenbasierte Krankheitsmodelle, die potenziell das klinische Ansprechen der Patienten10,11,12,</su...

Krebserkrankungen sind eine Ansammlung verschiedener genetischer und immunologischer Erkrankungen. Die erfolgreiche Entwicklung wirksamer Behandlungen hängt in hohem Maße von experimentellen Modellen ab, die klinische Ergebnisse effektiv vorhersagen. Große Bibliotheken von gut charakterisierten, vom Patienten abgeleiteten Xenografts (PDX) werden aufgrund ihrer Fähigkeit, tumorbehaftete Merkmale, Heterogenität und Ansprechen des Patienten zu rekapitulieren, seit langem als das translationale In-vivo-System der Wahl angesehen, um Chemo- und/oder zielgerichtete Therapien zu testen2,3. PDXs werden im Allgemeinen als Krebsstammzellerkrankungen betrachtet, die im Gegensatz zu von Zelllinien abgeleiteten Xenografts genetische Stabilitätaufweisen 2. In den letzten Jahrzehnten wurden weltweit große Sammlungen von PDXs erstellt, die heute zum Arbeitspferd der Krebsmedikamentenentwicklung werden. Obwohl weit verbreitet und mit großem translationalem Wert, sind diese Tiermodelle an sich kostspielig, zeitaufwendig und mit geringem Durchsatz und daher für ein großflächiges Screening unzureichend. PDX sind auch für immunonkologische (IO) Tests aufgrund einer immungeschwächten Natur unerwünscht4. Es ist daher unpraktisch, die Vorteile der verfügbaren großen Bibliothek von PDXs voll auszuschöpfen.
Jüngste Entdeckungen, die vom Labor5von Hans Clevers entwickelt wurden, haben zur Etablierung von In-vitro-Kulturen von Organoiden geführt, die aus adulten Stammzellen in den meisten menschlichen Organen epithelialen Ursprungs erzeugt werden5. Diese Protokolle wurden weiter verfeinert, um das Wachstum von Organoiden aus angenommenen CSCs in menschlichen Karzinomen verschiedener Indikationen zu ermöglichen6,7. Diese von Patienten abgeleiteten Organoide (PDOs) sind genomisch stabil8,9 und haben sich als sehr prädiktiv für die klinischen Behandlungsergebnisse10,11,12erwiesen. Darüber hinaus ermöglicht die In-vitro-Natur von PDOs ein Hochdurchsatz-Screening (HTS)13, was potenziell einen Vorteil gegenüber In-vivo-Modellen bietet und große Organoidbibliotheken als Ersatz für die Patientenpopulation nutzt. PDOs sind bereit, eine wichtige Entdeckungs- und Übersetzungsplattform zu werden, die die vielen oben beschriebenen Einschränkungen von PDXs überwindet.
Sowohl PDO als auch PDX sind patientenbasierte und CSC-gesteuerte Modelle, die in der Lage sind, Therapeutika entweder im Rahmen einer personalisierten Behandlung oder eines klinischen Studienformats zu bewerten. Bestehende große Bibliotheken von PDXs, wie die proprietäre Sammlung von >3000 PDXs14,15,16,17, eignen sich daher für die schnelle Generierung von Bibliotheken von Tumororganoiden (PDX-abgeleitete Organoide oder PDXO), was zu einer abgestimmten Bibliothek von gepaarten PDX- und PDXO-Modellen führt. Dieser Bericht beschreibt das Verfahren zur Erstellung und Charakterisierung von Darmkrebs PDXO-CR2110 in Bezug auf sein elterliches PDX-CR2110 Modell16.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634028</td><td>Basismedium</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01</td><td>Waschmedium</td></tr><tr><td>Kollagen Typ II</td><td>Invitrogen</td><td>17101015</td><td>Digest Tumor</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Organoid Kulturmatrix (Basalmembranextrakt, Wachstumsfaktor reduziert)</td></tr><tr><td>N-Ac</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>Organoid-Nährmedium</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>Organoid-Nährmedium</td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Organoid-Nährmedium</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Organoid-Nährmedium</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>Organoid-Nährmedium</td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td>Organoid-Nährmedium</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma</td><td>S7076</td><td>Organoid-Nährmedium</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Sigma</td><td>G9145</td><td>Organoid-Nährmedium</td></tr><tr><td>Rspondin</td><td>Peprotech</td><td>120-38-1000</td><td>Organoid-Nährmedium</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Life Technologies</td><td>35050038</td><td>Organoid-Nährmedium</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Life Technologies</td><td>15630056</td><td>Organoid-Nährmedium</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>Organoid-Kulturmedium</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Abmole</td><td>M1817</td><td>Organoid-Kulturmedium</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105041</td><td>Screening-Assay</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D</td><td>Promega</td><td>G9683</td><td>Screening-Assay (lumineszierender ATP-Indikator)</td></tr><tr><td>Multitropfen-Dispenser</td><td>Thermo Fisher</td><td>Multidrop</td><td>Kombi-Beschichtung Organoide/CellTiter-Glo 3D-Addition</td></tr><tr><td>Digitaler Dispener</td><td>Tecan</td><td>D300e</td><td>Compound-Zugabe</td></tr><tr><td>Envision Plate Reader</td><td>Perkin Elmer</td><td>2104</td><td>Lumineszenz-Reading</td></tr><tr><td>Balb/c nackte Mäuse</td><td>Beijing HFK Bio-Technology Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAeasy Mini-Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>tRNA-Aufreinigungskit</td></tr><tr><td>DNAeasy Blut & Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>DNA-Aufreinigungskit</td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Thermo Fisher</td><td>HG-4000-012</td><td>Einbettung von Organoiden</td></tr></tbody></table>

erstellung übereinstimmender in vivo/in vitro patienten-abgeleiteter modellpaare von pdx- und pdx-abgeleiteten organoiden für die krebspharmakologieforschung

Creating Matched In vivo/In vitro Patient-Derived Model Pairs of PDX and PDX-Derived Organoids for Cancer Pharmacology Research

Patientenabgeleite Tumor-Xenografts (PDXs) gelten als die prädiktivsten präklinischen Modelle, von denen weitgehend angenommen wird, dass sie von Krebsstammzellen (CSC) für die konventionelle Krebsmedikamentenbewertung angetrieben werden. Eine große Bibliothek von PDXs spiegelt die Vielfalt der Patientenpopulationen wider und ermöglicht so populationsbasierte präklinische Studien ("Phase II-like mouse clinical trials"); PDX haben jedoch praktische Einschränkungen durch geringen Durchsatz, hohe Kosten und lange Lebensdauer. Tumororganoide, die auch patientenabgeleitete CSC-gesteuerte Modelle sind, können als in vitro-Äquivalent von PDX betrachtet werden und überwinden bestimmte PDX-Einschränkungen für den Umgang mit großen Bibliotheken von Organoiden oder Verbindungen. Diese Studie beschreibt eine Methode zur Herstellung von PDX-abgeleiteten Organoiden (PDXO), die zu gepaarten Modellen für die In-vitro- und In-vivo-Pharmakologieforschung führen. Subkutan transplantierte PDX-CR2110-Tumoren wurden von tumortragenden Mäusen gesammelt, als die Tumoren 200-800 mm 3 erreichten, gemäßeinemzugelassenen Autopsieverfahren, gefolgt von der Entfernung der benachbarten Nicht-Tumorgewebe und der Dissoziation in kleine Tumorfragmente. Die kleinen Tumorfragmente wurden gewaschen und durch ein 100 μm Zellsieb geleitet, um die Trümmer zu entfernen. Zellcluster wurden gesammelt und in einer BME-Lösung (Basement Membrane Extract) suspendiert und in einer 6-Well-Platte als fester Tröpfchen mit umgebenden flüssigen Medien für das Wachstum ineinem CO 2-Inkubator plattiert. Das Organoidwachstum wurde zweimal wöchentlich unter Lichtmikroskopie überwacht und fotografisch aufgezeichnet, gefolgt von einem Flüssigenmittelwechsel 2 oder 3 mal pro Woche. Die gezüchteten Organoide wurden (7 Tage später) im Verhältnis 1:2 weiter durchgelassen, indem die in BME eingebetteten Organoide durch mechanische Scherung gestört wurden, unterstützt durch Zugabe von Trypsin und die Zugabe von 10 μM Y-27632. Organoide wurden in Kryoröhrchen zur Langzeitlagerung kryokonserviert, nachdem sie durch Zentrifugation aus BME freigestellt und zur weiteren Charakterisierung ebenfalls beprobt wurden (z. B. DNA-, RNA- und FFPE-Block).

Morphologie von PDXOs, typisch für Organoide unter Lichtmikrokopie und konsistent mit elterlicher PDX pro H &amp; E-Färbung Unter Lichtmikroskopie zeigt PDXO-CR2110 eine typische zystische Morphologie (Abbildung 1A), wie zuvor für patientenabgeleitete Organoide (PDO) beschrieben, die die Ähnlichkeit zwischen PDXO und PDO unter den gleichen Kulturbedingungen unterstützen.
Die histopathologische Untersuchung durch H&amp;E-Färbung zeigt, dass die ...

Es wird eine Methode beschrieben, um Organoide unter Verwendung von patientenabgeleiteter Xenografts (PDX) für das In-vitro-Screening herzustellen, was zu übereinstimmenden Paaren von In-vivo/In-vitro-Modellen führt. PDX-Tumoren wurden mechanisch oder enzymatisch in kleine Stücke geerntet / verarbeitet, gefolgt von der Clevers-Methode, um Tumororganoide zu züchten, die passageiert, kryokonserviert und gegen das ursprüngliche PDX charakterisiert wurden.

Erstellung übereinstimmender In vivo/In vitro Patienten-abgeleiteter Modellpaare von PDX- und PDX-abgeleiteten Organoiden für die Krebspharmakologieforschung

Patient-derived tumor xenografts (PDXs) are considered the most predictive preclinical models, largely believed to be driven by cancer stem cells (CSC) ...

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine übereinstimmende Bibliothek von gepaarten patientenabgeleiteten Xenografts (PDX) und entsprechenden vom Patienten abgeleiteten Organoidlinien zu erstellen. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie zur Herstellung von Organoiden mit PDX für das In-vitro-Screening verwendet werden kann, was zu übereinstimmenden Paaren von In-vivo/In-vitro-Modellen führt. Beginnen Sie mit der Ernte der Tumoren und der Verarbeitung des Gewebes, wie im Textmanuskript beschrieben.Nach der Gewebeverdauung das Gewebe mit einer sterilen Kunststoffpipette von fünf Millilitern auf und ab pipetten. Dann 20 Milliliter AD+ in das Homogenat geben und mit einem 100 Mikrometer Zellsieb filtrieren. Waschen Sie das Filtrat zweimal mit AD+, geben Sie es dann in ein Kunststoffrohr und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 450 mal G.Resuspendieren Sie die Zellen in BME und halten Sie sie auf Eis. Um die Organoidkultur vorzubereiten, 200 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte geben und die Platte bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten inkubieren. Fügen Sie zwei Milliliter organoider Medien zu jeder Vertiefung hinzu und stellen Sie die repräsentativen Tropfen unter einem Mikroskop ab.Halten Sie die Organoidkulturen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid mit Mediumswechseln alle drei bis vier Tage und Passage im Verhältnis von eins zu zwei alle sieben Tage. Nachdem Sie die Organoide dissoziiert haben, führen Sie sie durch einen 70-Mikrometer-Filter in ein 50-Milliliter-Kunststoffrohr. Zählen Sie die Organoide unter einem Mikroskop und resuspendieren Sie sie in BME auf Eis für eine Endkonzentration von 5%Fügen Sie 50 Mikroliter der Organoidsuspension in jede 384-Well-Platte mit einem Flüssigkeitsspender für eine Aussaatdichte von 200 CR2110 PDXOs pro Vertiefung hinzu.Verwenden Sie den digitalen Spender, um SN38 in serieller Verdünnung zu jeder Vertiefung hinzuzufügen. Erstellen Sie eine Plattenkarte mit dem Software-Tool für digitale Spender. Die Behandlungen sollten ein Negativkontrollvehikel mit 100% Lebensfähigkeit und eine Positiveinleitung von fünf mikromolaren Staurosporinen mit 0% Lebensfähigkeit umfassen.Wenn Sie fertig sind, legen Sie die mit Medikamenten behandelten 384-Well-Platten wieder in den 37-Grad-Celsius-Inkubator. Unter Lichtmikroskopie zeigt PDXO CR2110 eine typische zystische Morphologie, die die Ähnlichkeit zwischen PDX-abgeleiteten Organoiden und patientenabgeleiteten Organoiden unter den gleichen Kulturbedingungen zeigt. Die histopathologische Untersuchung durch H&E-Färbung zeigt, dass die Gewebestrukturen und Zelltypen von PDXO CR2110 dem ursprünglichen PDX CR2110 ähneln.Genomische Profilvergleiche von PDX und PDXO zeigen eine Korrelation von 94,92% der Transkriptomexpression und eine 97,67%ige Übereinstimmung von DNA-Mutationen, was auf eine allgemeine genomische Ähnlichkeit zwischen diesem Modellpaar hindeutet. Arzneimittelsensitivitätstests wurden an PDXO CR2110 in 384-Well-Platten durchgeführt. PDXO CR2110 war empfindlich gegenüber Irinotecan und resistent gegen Cisplatin, was mit den PDX-Behandlungsergebnissen übereinstimmt.Das aufeinander abgestimmte Paar von In-vitro- und In-vivo-Modellen kann sich gegenseitig für das In-vitro-Screening und die Validierung in vivo ergänzen, die Erfolgsrate der Arzneimittelentdeckung verbessern und möglicherweise die Fluktuationsraten in der klinischen Entwicklung reduzieren.

creating-matched-vivoin-vitro-patient-derived-model-pairs-pdx-pdx

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Patientenabgeleitete organoide Kulturen des pankreatischen duktodalen Adenokarzinoms sind ein schnell etabliertes dreidimensionales Modell, das epitheliale Tumorzellkompartimente mit hoher Genauigkeit darstellt und translationale Forschung entoliert. Hier bieten wir detaillierte Methoden zur Etablierung und Vermehrung von Organoiden sowie zur Durchführung relevanter biologischer Assays mit diesen Modellen.

Isolierung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten Pankreas-Ductal Adenokarzinom-Organoidmodellen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die Wirksamkeit gezielter Therapien zu testen, die auf der Grundlage der genomischen Zusammensetzung eines Tumors ausgewählt wurden. Das Protokoll beschreibt die Identifizierung und Validierung struktureller DNA-Umlagerungen, die Einplage von Patiententumoren in Mäuse und die Erprobung von Reaktionen auf entsprechende Medikamente.

Testen von gezielten Krebstherapien mit struktureller DNA-Alterationsanalyse und patientenabgeleiteten Xenografts

In der folgenden Arbeit beschreiben wir die aufeinanderfolgenden Schritte, die für die Errichtung einer großen Biobank von Dickdarm- und Bauchspeicheldrüsenkrebs notwendig sind.

Schaffung und Pflege einer lebenden Biobank - Wie wir es tun

Ein hochgenaues In-vitro-Hochdurchsatz-Assay-System wurde entwickelt, um Krebsmedikamente unter Verwendung von von Patienten abgeleiteten Tumororganoiden (PDOs) zu bewerten, ähnlich wie Krebsgewebe, aber für In-vitro-Hochdurchsatz-Assay-Systeme mit 96-Well- und 384-Well-Platten ungeeignet sind.

Hochdurchsatz-In-vitro-Assay mit patientenabgeleiteten Tumororganoiden

Dieses Protokoll beschreibt eine halbautomatische Methode für Organoid-Wirkstoff-Screenings mit mittlerem bis hohem Durchsatz und mikroskopunabhängige, automatisierte Bildanalysesoftware zur Quantifizierung und Visualisierung multiparametrischer, einzelorganoider Arzneimittelreaktionen zur Erfassung der intratumoralen Heterogenität.

Multiparametrisches Tumor-Organoid-Wirkstoff-Screening mit Weitfeld-Live-Cell-Imaging für die Bulk- und Einzelorganoid-Analyse

Das vorliegende Protokoll etabliert und charakterisiert ein patientenabgeleitetes Xenotransplantat-Modell (PDX) für anaplastisches Schilddrüsenkarzinom (ATC) und Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom (HNSCC), da PDX-Modelle schnell zum Standard im Bereich der translationalen Onkologie werden.

Etablierung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten Xenotransplantatmodellen des anaplastischen Schilddrüsenkarzinoms und des Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinoms

Wir stellen ein Protokoll vor, mit dem therapeutische Arzneimitteltests mit Patientinnen-Ovarialkarzinom-Organoiden durchgeführt werden können.

Ovarialkarzinom-Patientinnen-abgeleitete Organoid-Modelle für präklinische Medikamententests

Tumor-Organoide haben die Krebsforschung und den Ansatz der personalisierten Medizin revolutioniert. Sie stellen ein klinisch relevantes Tumormodell dar, das es Forschern ermöglicht, dem Tumor in der Klinik einen Schritt voraus zu sein. Dieses Protokoll etabliert Tumor-Organoide aus frischen Gewebeproben des Pankreastumors und von Patienten stammenden Xenotransplantaten aus dem Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse.

Etablierung von Pankreaskrebs-abgeleiteten Tumororganoiden und Fibroblasten aus frischem Gewebe

Patient-Derived Tumor Organoids sind ein ausgeklügeltes Modellsystem für die Grundlagen- und translationale Forschung. Dieser Methodenartikel beschreibt die Verwendung von Multiplex-Fluoreszenz-Lebendzell-Imaging zur gleichzeitigen kinetischen Beurteilung verschiedener Organoid-Phänotypen.

Multiplex-Lebendzell-Bildgebung für das Ansprechen auf Medikamente in patientenabgeleiteten Organoidmodellen von Krebs

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung von Organoiden von Melanompatienten vor, indem disassoziierte Zellsuspensionen aus frischem Melanomgewebe kultiviert werden. Diese Organoide rekapitulieren patientenspezifische Tumore in vitro originalgetreu und bieten einen innovativen Ansatz zur Erforschung immunsuppressiver Mechanismen von Tumoren, des Wirkstoffscreenings, der Arzneimittelresistenzmechanismen und der Krebsüberwachungsansätze.

Aufdeckung therapeutischer Möglichkeiten mit Organoidmodellen von Melanom-Patienten

Erfahren Sie die Erstellung von Organoiden aus Patienten-xenografts für die Krebsforschung. Diese Methode ermöglicht abgestimmte In-vivo/In-vitro-Modelle zur verbesserten Wirkstoffscreening.

Erstellung übereinstimmender In vivo/In vitro Patienten-abgeleiteter Modellpaare von PDX- und PDX-abgeleiteten Organoiden für die Krebspharmakologieforschung (Video) | JoVE Journal

Erstellung übereinstimmender In vivo/In vitro Patienten-abgeleiteter Modellpaare von PDX- und PDX-abgeleiteten Organoiden für die Krebspharmakologieforschung

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