Quantitative Echtzeit-PCR-Bewertung von microRNA-Expressions in der Mausniere mit einseitiger ureteraler Obstruktion
27. August 2020
Wir beschreiben eine Methode zur Bewertung der microRNA-Expression in den Nieren von Mäusen mit einseitiger Harnleiterobstruktion (UUO) durch quantitative Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion. Dieses Protokoll eignet sich zur Untersuchung von Nieren-MicroRNA-Expressionsprofilen bei Mäusen mit UUO und im Kontext anderer pathologischer Erkrankungen.
Diese Methode ermöglicht es, microRNA-Expression in Nieren von Mäusen mit einer breiten Palette von pathologischen Bedingungen, wie Nierenfibrose zu bieten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie microRNA-Expressionsprofilierung mit hoher Genauigkeit und Empfindlichkeit ermöglicht, indem ein einfacher Prozess verwendet wird, der Zeit spart und technische Fehler verhindert. Um die Scheinoperation durchzuführen, verwenden Sie chirurgische Schere und Pinzette, um einen Schnitt in der Haut am Bauch zu machen und schneiden Sie den Muskel und die Peritonealmembran von der Blase bis zum linken unteren Rand der Rippen.
Befeuchten Sie zwei Wattestäbchen mit PBS und ziehen Sie vorsichtig den Darm zur Seite. Legen Sie die befeuchteten Tupfer, um die linke Niere und Harnleiter zu identifizieren. Schließen Sie die Peritonealmembran und dann den Einschnitt mit 4-0 Nylon.
Um die einseitige Harnröhre Obstruktion durchzuführen, oder UUO, machen einen Schnitt in der Haut am Bauch und schneiden Sie den Muskel und peritoneale Membran, wie für die Scheinchirurgie gezeigt. Legen Sie eine 2,5-Milliliter-Spritze unter die Maus. Befeuchten Sie zwei Wattestäbchen mit PBS, ziehen Sie dann den Darm vorsichtig zur Seite mit der Pinzette und legen Sie die Tupfer, um den linken Harnleiter zu identifizieren.
Verwenden Sie die Pinzette, um die linke Niere zu heben. Verwenden Sie 4-0 Seide, um den linken Harnleiter an zwei Stellen etwa einen Zentimeter voneinander entfernt zu ligieren. Schneiden Sie den Harnleiter am Mittelpunkt der beiden Ligationen und verwenden Sie dann 4-0 Nylon Nähte, um die Peritonealmembran und Denkholz zu schließen.
Nach dem Schneiden der Peritonealmembran, wie zuvor gezeigt, heben Sie sie mit einer Pinzette an und verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen seitlichen Schnitt an der oberen Kante zu machen, und setzen Sie dann den Schnitt entlang der untersten Kante der Rippen fort. Identifizieren Sie die linke Niere und refluxen Sie sie mit PBS, bis die Niere gelb-weiß wird. Entfernen Sie die Niere, indem Sie die linke Nierenarterie und Vene mit der chirurgischen Schere schneiden und in eine Petrischale legen, dann waschen Sie sie sorgfältig mit PBS.
Schneiden Sie die Niere mit der chirurgischen Schere und Pinzette in etwa 10-Milligramm-Proben, legen Sie jedes Stück der Niere in ein eigenes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr und schließen Sie die Kappe des Rohres. Eine Nierenprobe in den Silikonhomogenisator geben und 700 Mikroliter eines Phenyl-/Guanidin-basierten Lysereagenz hinzufügen. Drücken und drehen Sie den Stößel des Homogenisators langsam gegen die Nierenprobe, um sie zu homogenisieren.
Wiederholen Sie das Pressen und Verdrehen, bis die Probe vollständig im Lysereagegelöst ist. Um die Probe weiter zu homogenisieren, übertragen Sie das homogenisierte Lysat auf die Biopolymer-Spin-Säule und drehen Sie es drei Minuten lang bei 14.000-fachem G, und übertragen Sie dann das ausgefällte Lysat in ein ungenutztes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Kombinieren Sie das Lysat in der Röhre mit 140 Mikroliter Chloroform und kappen Sie das Rohr fest.
Um das Lysat und Chloroform zu mischen, das Rohr 15 Mal invertieren. Inkubieren Sie die Proben für zwei bis drei Minuten bei Raumtemperatur, dann drehen Sie sie bei 12.000 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Ohne den Niederschlag zu stören, übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr und fügen Sie das 1,5-fache seines Volumens von 100% Ethanol hinzu.
Wirbel die Mischung für fünf Sekunden. 700 Mikroliter der Probe in einem Zwei-Milliliter-Sammelrohr auf eine membranverankerte Spinsäule laden. Schließen Sie die Säulenkappe und drehen Sie die Spalte 15 Sekunden lang bei 15.000 Mal G, und werfen Sie dann das ausgefällte Lysat im Sammelrohr weg.
Waschen Sie die Probe gründlich, indem Sie 700 Mikroliter Waschpuffer eins zur membranverankerten Spinsäule in einem Zwei-Milliliter-Sammelrohr hinzufügen. Wiederholen Sie dann die Zentrifugation und werfen Sie das Sammelrohr weg. Wiederholen Sie die Wäsche zweimal mit 500 Mikroliter Waschpuffer zwei pro Wäsche.
Nach der letzten Wäsche die membranverankerte Spinsäule in einem Zwei-Milliliter-Sammelrohr bei 15.000 mal G für eine Minute drehen und das gefällte Lysat wegwerfen. Übertragen Sie die membranverankerte Spinsäule in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr. Lösen Sie die gesamte RNA auf, indem Sie der Säule 30 Mikroliter RNase-freies Wasser hinzufügen, die Säulenkappe schließen und bei Raumtemperatur fünf Minuten lang lassen.
Drehen Sie dann die Spalte bei 15.000 mal G für eine Minute. Übertragen Sie die Probe mit der gesamten RNA auf eine neue Mikrozentrifugenröhre auf Eis und messen Sie die Konzentration der gesamten RNA durch Spektrophotometrie. Bereiten Sie eine Master-Mix-Lösung entsprechend den Manuskriptrichtungen vor und fügen Sie acht Mikroliter zu jedem Rohr eines Acht-Well-Rohrstreifens hinzu.
Nach der Anpassung der gesamten RNA-Dichte legen Sie ein 12-Mikroliter-Aliquot der gesamten RNA in jede Röhre und schließen Sie die Kappe. Zentrifugieren Sie die Rohre für 15 Sekunden. Legen Sie die Schläuche in den Thermocycler und inkubieren Sie sie für 60 Minuten bei 37 Grad Celsius.
Wenn fertig, sofort inkubieren sie für fünf Minuten bei 95 Grad Celsius für die Synthese von cDNA. Übertragen Sie die cDNA in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr und verdünnen Sie sie 10-mal mit destilliertem Wasser. Wirbel und Zentrifugieren Sie das Rohr für fünf Sekunden, dann führen quantitative Echtzeit-PCR, wie in der Texthandschrift beschrieben.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um ein einseitiges Urethral-Obstruktions-Maus-Modell über linke Ureteralligation in acht Wochen alten männlichen Mäusen mit einem Gewicht von 20 bis 25 Gramm zu erstellen. Ureters wurden durch Doppelligation mit 4:0 Seidennähten völlig behindert. Die Nieren wurden acht Tage nach der Operation gesammelt.
Die microRNA qRT-PCR-Daten zeigten, dass der Gehalt an microRNA 3070-3p signifikant erhöht war und die Konzentrationen von microRNA, 7218-5p und microRNA 7219-5p in den Nieren der UUO-Mäuse im Vergleich zu den Kontrollen verringert wurden. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, denken Sie daran, die Verdrehung der Nierenprobe zu wiederholen, bis sie vollständig in Phenyl/Guanidin-basiertem Lysereage gelöst ist, um eine gute RNA-Extraktion zu erreichen.
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Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Untersuchung der Mikro-RNA-Expression in den Nieren von Mäusen mit einseitiger Harnleiterobstruktion (UUO) mittels quantitativer Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion beschrieben. Die Technik ermöglicht eine hohe Genauigkeit und Empfindlichkeit bei der Profilierung der Mikro-RNA-Expression unter verschiedenen pathologischen Bedingungen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Nierenpathologie
Hintergrund
- Mikro-RNAs spielen eine entscheidende Rolle bei der Genregulation.
- Die einseitige Harnleiterobstruktion (UUO) ist ein Modell zur Untersuchung von Nierenerkrankungen.
- Das Verständnis von Mikro-RNA-Profilen kann Einblicke in die renale Fibrose ermöglichen.
- Aktuelle Methoden weisen möglicherweise eine unzureichende Empfindlichkeit und Genauigkeit auf.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Beurteilung der Mikro-RNA-Expression in Nierengeweben.
- Erforschung von Nierenerkrankungen und deren zugrundeliegenden Mechanismen erleichtern.
- Verbesserung des Verständnisses über die Rolle von Mikro-RNAs bei pathologischen Zuständen.
Verwendete Methoden
- Quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR).
- Scham-Operation zur Erstellung des Mausmodells.
- Verwendung chirurgischer Instrumente zur Gewebemanipulation.
- Anwendung von PBS zur Gewebehandhabung.
Hauptergebnisse
- Die Methode ermöglicht eine genaue Profilierung von Mikro-RNAs.
- Hohe Empfindlichkeit bei der Detektion von Mikro-RNA-Spiegeln in Nierengeweben.
- Erleichtert die Untersuchung verschiedener renaler Pathologien.
- Verringert technische Fehler im Vergleich zu herkömmlichen Methoden.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode stellt ein wertvolles Werkzeug für die Nierenforschung dar.
- Sie vertieft das Verständnis der Funktionen von Mikro-RNAs bei Nierenerkrankungen.
- Zukünftige Studien können diese Technik für weiterreichende Anwendungen nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Eine genaue Profilierung der Mikro-RNA-Expression in Modellen der renalen Fibrose unterstützt die Validierung von Zielstrukturen und die mechanistische Absicherung im Rahmen der Arzneimittelentwicklung für Nierenerkrankungen. Diese qRT-PCR-Methode ermöglicht eine reproduzierbare Quantifizierung krankheitsassoziiierter miRNAs und liefert damit eine verlässliche Vorhersage für die Untersuchung von Signalwegen und die Abstimmung von Biomarkern. Sie schließt eine entscheidende Lücke in der Analyse von Nierengewebe und erleichtert die Hypothesenprüfung in frühen Entwicklungsstadien sowie die Priorisierung von Wirkstoffkandidaten.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Quantifizierung der miRNA-Dysregulation bei UUO-induzierter renaler Fibrose.
- Operativer Wert: Bietet einen zuverlässigen Arbeitsablauf zur Isolierung und Messung von miRNA aus Nierengewebe und reduziert so die technische Variabilität.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die funktionelle Validierung von Zielstrukturen, indem Veränderungen der miRNA-Expression mit krankheitsrelevanten Signalwegen verknüpft werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte, quantitative Daten zur miRNA-Expression, die für die Assay-Optimierung und die Bereitschaft für das Screening geeignet sind.
- Operativer Wert: Bietet hohe Empfindlichkeit und Spezifität bei der miRNA-Detektion und ermöglicht dadurch eine zuverlässige Bewertung von Substanzeffekten.
- Skalierbarkeit: Verwendet einen vereinfachten Extraktions- und qRT-PCR-Prozess, der mit mittleren Durchsatzanwendungen kompatibel ist.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet entdeckungsphasenbasierte miRNA-Ergebnisse mit der präklinischen Validierung in einem klinisch relevanten Fibrosemodell.
- Biomarker-Abstimmung: Ermöglicht die Bewertung von miRNA-3070-3p, miRNA-7218-5p und miRNA-7219-5p als potenzielle translationale Biomarker.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen durch reproduzierbare molekulare Messgrößen aus erkranktem Nierengewebe.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Zielidentifizierung bis zur Leitstruktur-Optimierung ein und liefert molekulare Phänotypisierungsdaten, die die frühe Entscheidungsfindung unterstützen.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung miRNA-vermittelter Mechanismen bei renaler Fibrose durch präzise Expressionsprofilierung.
- Screening: Erzeugt quantitative, reproduzierbare Ergebnisse, die ein zuverlässiges Substanz-Screening und die Analyse von Struktur-Wirkungs-Beziehungen unterstützen.
- Analytik: Liefert normalisierte Ct-Werte und Faltungsänderungsmessungen, die einen Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen sowie eine statistische Auswertung ermöglichen.
- Translationale Forschung: Bietet Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem ein krankheitsrelevantes UUO-Modell verwendet wird, um miRNA-Veränderungen im Zusammenhang mit der Pathologie zu bewerten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine standardisierte Plattform für die miRNA-Analyse, die auf verschiedene Nierenerkrankungsmodelle und -projekte übertragbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten in miRNA-vermittelten Wegen verringert werden.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Laboren durch einen gut definierten, kontaminationskontrollierten Arbeitsablauf.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem eine frühzeitige Risikominderung von Targets auf Grundlage robuster molekularer Phänotypisierung ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem quantitative miRNA-Daten bereitgestellt werden, die die Target-Auswahl und -weiterentwicklung informieren.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit RNA, in der Erzeugung chirurgischer Modelle und in der Optimierung von qRT-PCR.
- Setzt den Zugang zu chirurgischen Instrumenten, Homogenisierungsgeräten und Echtzeit-PCR-Ausrüstung voraus.
- Erfordert eine Standardisierung der Schritte zur RNA-Extraktion und cDNA-Synthese über verschiedene Anwender und Standorte hinweg.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn das Protokoll auf verschiedene Nierenregionen oder Krankheitsmodelle angewendet wird.
- Umfasst praktische Einschränkungen im Zusammenhang mit der Variabilität der RNA-Ausbeute und der Notwendigkeit technischer Wiederholungen, um die Robustheit der Daten sicherzustellen.
