In vitro Neuromuskuläre Junction Induziert von humaninduzierten Pluripotenten Stammzellen
3. Dezember 2020
Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung von In-vitro-NMJs aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) zur Verfügung. Diese Methode kann NMJs mit ausgereifter Morphologie und Funktion in 1 Monat in einem einzigen Brunnen induzieren. Die daraus resultierenden NMJs könnten potenziell verwendet werden, um verwandte Krankheiten zu modellieren, pathologische Mechanismen zu untersuchen oder medikamentöse Verbindungen für die Therapie zu untersuchen.
Dieses menschliche neuromuskuläre Knoten-Induktionssystem kann verwendet werden, um die Bildung von prä- und postsynaptischen Komponenten zu induzieren, einschließlich motorischer Neuronen, Skelettmuskel, und Schwann-Zellen. Eine ausgereifte, komplexe NMJ-Struktur kann nicht nur in einer einzigen Kulturschale aus einer einzigen Ausgangszellenpopulation erhalten werden, sondern das resultierende NMJ besitzt auch die Fähigkeit, sich zusammenzuziehen. Diese Methode hat Potenzial für die Untersuchung neuromuskulärer Erkrankungen, wie spinale Muskelatrophie, und für therapeutische Seuchen.
Das differenzierte NMJ ist ein sehr dickes, komplexes Gewebe, und es ist schwierig zu visualisieren. Indem wir das Verfahren demonstrieren, können wir den Leser anweisen, wie wir bestimmte Strukturen identifizieren können. Waschen Sie die Zellen mit drei MilliliterPBS, bevor Sie einer Petrischale einen Milliliter Zellablösung hinzufügen.
Nach 10 Minuten bei 37 Grad Celsius drei Milliliter embryonales Stammzellmedium zu jedem Brunnen hinzufügen und die Pipette dreimal sanft pipette, um die Zellen von den Abdeckungen zu trennen. Als nächstes bündeln Sie die freistehenden Stammzell-haltigen Überräuer zur Zentrifugation in ein 50-Milliliter-Konikonulus und setzen das Stammzellpellet in drei Millilitern frischen embryonalen Stammzellmediums der Primaten wieder auf, ergänzt mit 10 Mikromolaren Y-27632 ROCK-Hemmern zum Zählen. Dann verdünnen Sie die Zellen auf zwei mal 10 bis zu die fünf Zellen pro Milliliter Medium, ergänzt mit ROCK-Hemmer-Konzentration, und geben Sie zwei Milliliter Zellen in jedem Deckel in jedem Brunnen der extrazellulären Matrix-beschichteten Sechs-Well-Platte zurück.
Ersetzen Sie nach 24 Stunden den Überstand in jedem Brunnen durch zwei Milliliter frisches embryonales Stammzellmedium des Primaten, ergänzt durch ein Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin, und geben Sie die Platte für 24 Stunden an den Zellkultur-Inkubator zurück. Am Ende der Inkubation die Überräube durch zwei Milliliter Differenzierungsmedium, ergänzt durch Doxycyclin pro Brunnen, ersetzen und die Platte für 10 Tage in den Zellkultur-Inkubator zurückgeben. Am Ende der Inkubation die Überräube durch zwei Milliliter myogenes Differenzierungsmedium, ergänzt durch Doxycyclin pro Brunnen, ersetzen und die Platte für weitere 10 Tage an den Zellkultur-Inkubator zurückgeben.
Am Ende der Inkubation, ersetzen Sie die Übersprecher mit zwei Milliliter neuromuskulären Knoten Medium pro Brunnen und geben Sie die Platte an die Zellkultur Inkubator für 30 Tage. Visualisieren Sie am Ende der Inkubation die differenzierten neuromuskulären Verbindungen durch invertierte Mikroskopie. Um die Myotube Kontraktionen auszulösen, fügen Sie 25 Millimolar Calciumchlorid zu jedem Brunnen von differenzierten neuromuskulären Knotenzellen.
Und innerhalb von ein bis zwei Minuten nach der Behandlung, legen Sie die Platte auf die Bühne eines invertierten Mikroskops. Zeichnen Sie mit der Live-Zellmikroskopie einen Film über die Myotube-Kontraktion für 20 Sekunden auf. Am Ende der Aufnahme fügen Sie dem Kulturmedium 300 Nanogramm pro Milliliter Curare hinzu und nehmen Sie den Film für weitere 20 Sekunden auf, bevor Sie die Filmdatei in einem geeigneten Bewegungsvektoranalyse-Softwareprogramm zur Analyse öffnen.
Immunfluoreszierende Färbung der Neurofilament synaptischen Gefäße und Acetylcholin-Rezeptoren können durchgeführt werden, um die Neuronen zu identifizieren. Motorneuronen könnten durch TUJ 1 und Islet 1 Färbung identifiziert werden, während postsynaptische Myotuber durch Färbung für Myosin schwere Kette identifiziert werden können. Schwann-Zellen können mit S-100-Antikörpern beschriftet werden.
In diesen Rasterelektronenmikroskopiebildern kann die Morphologie ausgereifter neuromuskulärer Knoten mit klarer Visualisierung der erweiterten Axonklemmen, Axone und Muskelfasern beobachtet werden. Transmissionselektronenmikroskopie kann verwendet werden, um die ausgereifte Ultrastruktur der neuromuskulären Komponenten zu visualisieren, einschließlich der präsynaptischen Axonklemme mit synaptischen Vesikeln und der postsynaptischen Region, die durch den synaptischen Spalten getrennt ist. Junctionale Falten markieren die Kreuzung zwischen Neuron und Muskelfasern.
Hier werden ausgereifte Axonklemmen gezeigt, die synaptische Vesikel enthalten. Zusammengenommen deuten diese morphologischen Merkmale darauf hin, dass die neuromuskulären Komponenten gut induziert und gereift waren. Die funktionelle Beurteilung der Zellen zeigt, dass prominente neuromuskuläre Junction-Bewegungssignale durch Calciumchlorid induziert werden können und dass diese Kontraktionen durch Curare unterbrochen werden können, die bestätigen, dass die motorischen Neuronensignale durch die neuromuskuläre Verbindung übertragen werden, um Muskelkontraktion auszulösen.
Die Zellsädichte beeinflusst die Effizienz der NMJ-Bildung. Es kann entsprechend den experimentellen Zwecken geändert werden, um sich an das Protokoll anzupassen. Diese neuromuskuläre Knotenkultur enthält mehrere Zelltypen, und diese Komponenten können verwendet werden, um die Wechselwirkungen zwischen diesen Zellen während der neuromuskulären Knotenentwicklung oder als Reaktion auf bestimmte Krankheitspathologien zu studieren.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von in-vitro-Neuromuskulären Junctionen (NMJs) aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs). Die Methode ermöglicht die Herstellung reifer NMJs mit funktionellen Fähigkeiten innerhalb eines Monats und stellt somit ein wertvolles Werkzeug für die Krankheitsmodellierung und die Wirkstoffscreening dar.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Regenerative Medizin
Hintergrund
- Die neuromuskulären Verbindungen (NMJs) sind entscheidend für die Muskelkontraktion und die motorische Funktion.
- Die Untersuchung der NMJs kann Einblicke in neuromuskuläre Erkrankungen ermöglichen.
- Humanen iPSCs bieten eine nachwachsende Quelle für die NMJ-Forschung.
- Aktuelle Methoden zur Erzeugung von NMJs sind oft komplex und zeitaufwendig.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines optimierten Protokolls zur Bildung neuromuskulärer Junctionen aus iPSCs.
- Erleichterung der Untersuchung neuromuskulärer Erkrankungen.
- Möglichmachung von Wirkstoffscreenings für therapeutische Interventionen.
Verwendete Methoden
- Zellkultivierungstechniken zur Differenzierung von iPSCs in Bestandteile der neuromuskulären Junction (NMJ).
- Verwendung spezifischer Medien und Zusätze zur Förderung der Reifung.
- Immunfluoreszenzfärbung zur Identifizierung neuronaler und muskulärer Bestandteile.
- Funktionelle Assays zur Beurteilung der NMJ-Aktivität und Kontraktion.
Hauptergebnisse
- Reife neuromuskuläre Endplatten wurden erfolgreich mit funktionellen Fähigkeiten gebildet.
- Calciumchlorid löste Kontraktionen in Myotuben aus.
- Curare unterbrach effektiv Muskelkontraktionen und bestätigte damit die Funktionalität der neuromuskulären Endplatten.
- Bildgebende Verfahren zeigten die detaillierte Morphologie der neuromuskulären Endplatten.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine zuverlässige Methode zur Generierung von neuromuskulären Junctionen aus iPSCs.
- Mit diesem System können Wechselwirkungen bei der Entwicklung der neuromuskulären Junction untersucht werden.
- Mögliche Anwendungen umfassen die Modellierung von Krankheiten und die Prüfung therapeutischer Substanzen.
Häufig gestellte Fragen
Exemplarische Branchenrelevanz
Dieses aus iPSCs abgeleitete in-vitro-Modell der menschlichen neuromuskulären Synapse (NMJ) stellt ein physiologisch relevantes System zur Untersuchung von Krankheitsmechanismen des neuromuskulären Systems und zur Bewertung therapeutischer Substanzen bereit. Durch die Integration prä- und postsynaptischer Komponenten mit funktioneller Vernetzung unterstützt das Modell die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominderung in der frühen Forschung. Die einmonatige Reifungszeit und die robusten funktionellen Messgrößen ermöglichen die Entwicklung skalierbarer Assays für die Wirkstoffidentifizierung und liefern eine vorhersagbare Sicherheit in der translationsmedizinischen Forschung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Modellierung der Bildung und Funktion der neuromuskulären Junction (NMJ) in einem für den Menschen relevanten System.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Entlastung von Risiken durch integrierte Bewertung der Wechselwirkungen zwischen motorischen Neuronen, Skelettmuskel und Schwann-Zellen.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Selektion von Wirkstoffkandidaten durch quantitative Messungen der Integrität der neuromuskulären Junction und der kontraktilen Antwort.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine standardisierte, reproduzierbare Plattform für die Wirkstoffprüfung mit funktionellen Endpunkten, die mit der NMJ-Aktivität verknüpft sind.
- Operationaler Wert: Ermöglicht skalierbare Assays im Mehrfachbrunnenformat unter Verwendung einer einzigen Ausgangspopulation von iPSCs in einer Kulturschale.
- Einsatzbereitschaft des Assays: Erzeugt reife NMJs mit nachweisbaren Kontraktions- und Hemmungsantworten, die für das hochinformative Screening geeignet sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Validierung, indem die pathophysiologischen Vorgänge und die Arzneimittelreaktion an menschlichen neuromuskulären Synapsen modelliert werden.
- Mechanistische Risikominimierung: Ermöglicht die Untersuchung der Störung der neuromuskulären Synapse in Krankheitsmodellen wie der spinalen Muskelatrophie unter Verwendung definierter genetischer Hintergründe.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch auf Grundlage funktioneller Messgrößen der neuromuskulären Synapse, die mit der in-vivo-Innervation der Muskulatur korrelieren.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis hin zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung ein und bietet ein wiederverwendbares, menschenrelevantes System für neuromuskuläre Forschung.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur Bildung, Aufrechterhaltung und Dysfunktion der neuromuskulären Endplatte in genetischen oder toxisch induzierten Krankheitsmodellen.
- Screening: Bietet gebrauchsfertige neuromuskuläre Endplatten mit funktionellen Kontraktions- und Hemmungsparametern zur Beurteilung der Wirkung von Substanzen auf die neuromuskuläre Transmission.
- Analytik: Erzeugt quantitative Daten zur Myotubenmotilität und pharmakologischen Hemmung und ermöglicht Vergleiche zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet aus iPS-Zellen abgeleitete neuromuskuläre Endplatten mit der präklinischen Kontinuität, indem menschenspezifische neuromuskuläre Interaktionen und Pathologien modelliert werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine skalierbare Plattform auf Basis pluripotenter Stammzellen, die für verschiedene neuromuskuläre Indikationen und Screening-Kampagnen anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem mechanistische Unschärfen bei der Entwicklung therapeutischer Ansätze am neuromuskulären Übergang reduziert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch ein definiertes Differenzierungsprotokoll in einer einzigen Kulturschale.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitaleffizienz, indem frühzeitige Erkennung neuromuskulärer Toxizitäten ermöglicht und das Risiko spätzeitiger Fehlschläge verringert wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Wirkstoffen basierend auf funktionellen Ergebnissen am neuromuskulären Übergang und der Zielmolekülbindung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultur humaner iPSCs, deren Differenzierung sowie in der neuromuskulären Biologie.
- Beruht auf spezialisierten Medien, Zusätzen (einschließlich Doxycyclin und ROCK-Inhibitor) und substratbeschichteten Oberflächen mit extrazellulärer Matrix.
- Erfordert standardisierte Protokolle für die Zellsägedichte, den Mediumwechsel und den Zeitpunkt funktioneller Assays.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen für die Hochskalierung auf verschiedene iPSC-Linien und genetische Hintergründe in Krankheitsmodellen.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie die Komplexität der Bildgebung infolge der Bildung dicker, mehrschichtiger Gewebe, die einen Einsatz fortgeschrittener Mikroskopie erfordern.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:59
Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC) Culture
2:00
iPSC Differentiation
3:04
Neuromuscular Junction (NMJ) Muscle Contraction and Curare Treatment
3:47
Results: Representative NMJ Phenotypic, Morphological, and Functional Characterization
5:20
Conclusion
