Name: Neisseria meningitidis Infektion von induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Gehirnendothelzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Erfahren Sie die Infektion von iPSC-abgeleiteten Gehirnendothelzellen mit Neisseria meningitidis zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen an der Blut-Hirn-Schranke. Diese Methode ermöglicht molekulare Analysen neurologischer Infektionen.

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L.M.E. wird durch das DFG-Graduiertenkolleg GRK2157 "3D-Gewebemodelle zur Untersuchung mikrobieller Infektionen durch menschliche Pathogene" gefördert, das an A. S-U. B.J.K. wird durch ein Postdoktorandenstipendium der Alexander von Humboldt-Stiftung gefördert. Darüber hinaus danken wir Lena Wolter für ihre technische Unterstützung bei der Generierung der iPSC-BECs in Kultur.

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Modellierung von BECs und der BHS war mit Herausforderungen verbunden, da primäre und immortalisierte humane BECs in vitro dazu neigen, robuste Barrierephänotypen zu vermissen. Das Aufkommen menschlicher Stammzelltechnologien hat die Erzeugung von iPSC-abgeleiteten BEC-ähnlichen Zellen ermöglicht, die die erwarteten charakteristischen BHS-Phänotypen wie Endothelmarker, Tight-Junction-Expression, Barriereeigenschaften, Reaktion auf andere ZNS-Zelltypen und funktionelle Efflux-Transporter beibehalten 12,13,14,...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61400">Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae</a>. The Authors section was updated from:
Leo M. Endres1 
Alexandra Schubert-Unkmeir1 
Brandon J. Kim1,2 
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of W&#252;rzburg 
2Department of Biological Sciences, University of Alabama
to:
Leo M. Endres1 
Sarah F. Hathcock2 
Alexandra Schubert-Unkmeir1 
Brandon J. Kim1,2 
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of W&#252;rzburg 
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61400">Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) und die meningeale Blut-Liquor-Schranke (mBCSFB) sind extrem dichte zelluläre Barrieren, die den Kreislauf vom zentralen Nervensystem (ZNS) trennen und hauptsächlich aus hochspezialisierten Gehirnendothelzellen (BECs) bestehen1,2. Zusammen sorgen BECs für eine ordnungsgemäße Homöostase des Gehirns, indem sie Nährstoffe und Abfallprodukte in und aus dem Gehirn regulieren und gleichzeitig viele Toxine, Medikamente und Krankheitserreger ausschließen 1,2. Eine bakterielle Meningitis tritt auf, wenn durch Blut übertragene Bakterien in der Lage sind, mit der von BECs gebildeten Barriere zu interagieren und diese zu durchdringen und Entzündungen zu verursachen. Neisseria meningitidis (Nm, Meningokokken) ist ein gramnegatives Bakterium, das den Nasenraum von 10 bis 40 % der gesunden Menschen besiedelt, aber in einigen Fällen schwere systemische Erkrankungen verursachen kann3. Bei betroffenen Personen kann Nm Zugang zum Blutkreislauf erhalten, wo es Purpura fulminans verursachen und in BECs eindringen kann, um Zugang zum ZNS zu erhalten, was zu Meningitisführt 3. Nm ist weltweit eine der Hauptursachen für bakterielle Meningitis und trotz Impfbemühungen immer noch eine der Hauptursachen für Meningitis4. Moderne medizinische Eingriffe, wie z. B. die Behandlung mit Antibiotika, haben diese Erkrankungen überlebensfähig gemacht, aber die Betroffenen mit Meningitis bleiben oft mit bleibenden neurologischen Schäden zurück 5,6.
Frühere Studien haben bakterielle Faktoren und Wirtssignale identifiziert, die zu Nm-BEC-Interaktionen beitragen 7,8,9,10,11. Die identifizierten Adhäsine und Invasine wie das Opazitätsprotein Opc und Typ-IV-Pili sowie Rezeptoren wie CD147 wurden an verschiedenen BEC-Modellen in vitro durchgeführt, diesen Modellen fehlen jedoch viele definierende BHS-Eigenschaften7,9,11,12. Ein vollständiges Verständnis der Nm-BEC-Wechselwirkungen ist nach wie vor schwer fassbar, was zum Teil auf die Unfähigkeit, In-vivo-Modelle zu verwenden, den unvollständigen Impfschutz und das Fehlen robuster menschlicher BEC-Modelle in vitro zurückzuführen ist.
Die Modellierung von hBECs in vitro war aufgrund der einzigartigen Eigenschaften von BECs eine Herausforderung. Im Vergleich zu peripheren Endothelzellen weisen BECs eine Reihe von Phänotypen auf, die ihre Barriereeigenschaften verbessern, wie z. B. einen hohen transendothelialen elektrischen Widerstand (TEER) aufgrund komplexer Tight Junctions12. Einmal aus der Mikroumgebung des Gehirns entfernt, verlieren BECs schnell ihre Barriereeigenschaften, was die Nützlichkeit von primären oder immortalisierten In-vitro-Modellen, die nur eine schwache Barriere bilden, einschränkt12,13. Die Kombination aus der menschlichen Spezifität von Nm-Infektionen, dem Mangel an robusten In-vivo-Modellen und den Herausforderungen bei der Modellierung menschlicher BECs in vitro schafft einen Bedarf an besseren Modellen, um die komplexe Wirt-Pathogen-Interaktion zwischen Nm und BECs zu verstehen. In jüngster Zeit wurden BEC-ähnliche Zellen aus iPS-Zellen abgeleitet, die BECs in vivo besser nachahmen 12,13,14,15. iPSC-BECs sind menschlichen Ursprungs, leicht skalierbar und besitzen im Vergleich zu ihren primären oder immortalisierten Gegenstücken die erwarteten BEC-Phänotypen12,13,14,15. Darüber hinaus haben wir und andere gezeigt, dass iPSC-BECs nützlich sind, um verschiedene Erkrankungen des ZNS zu modellieren, wie z.B. Wirt-Pathogen-Interaktion, Chorea Huntington und MCT8-Mangel, der das Allan-Hurndon-Dudley-Syndrom verursacht 16,17,18,19,20,21. In dieser Arbeit zeigen wir, wie iPSC-BECs aus erneuerbaren iPSC-Quellen abgeleitet werden können und wie die Infektion von iPSC-BECs mit Nm zur Aktivierung der angeborenen Immunantwort führt. Wir glauben, dass dieses Modell nützlich ist, um Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen, die in anderen In-vitro-Modellen nicht rekapituliert werden können, und besonders nützlich ist, wenn Interaktionen mit humanspezifischen Krankheitserregern wie Nm untersucht werden.

<table><tbody><tr><td>Accutase (1x)</td><td>Sigma</td><td>A6964</td><td>Reagenz für enzymatische Zelldissoziation</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>All-trans-Retinsäure (RA)</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31 (PECAM-1)</td><td>Thermo Scientific (Labvision)</td><td>RB-10333</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Claudin-5</td><td>Invitrogen</td><td>4C3C2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Glut-1</td><td>Thermo Scientific (Labvision)</td><td>SPM498 (MA5-11315)</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Occludin</td><td>Invitrogen</td><td>33-1500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VE-Cadherin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-52751</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>33-9100</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Proteose Pepton</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoethanol</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>805740</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturplatten und -</td><td>flaschen Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klasse II Biosicherheitswerkbank</td><td>Nuaire</td><td>NU-437-400E</td><td></td></tr><tr><td>CO2-Inkubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Inkubator)</td><td>Nuaire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Columbia Ager + 5 % Schafblut</td><td>Biomerieux</td><td>43049</td><td></td></tr><tr><td>Costar Transwell Polyesterfilter (12- oder 24-Well)</td><td>Corning</td><td>3460, 3470</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ROTH</td><td>A994.1</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td></td></tr><tr><td>Epithel-Volt-Ohm-Messgerät (Millicell ERS-2) mit STX-Elektrode</td><td>Merck (Millipore)</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NO3)3</td><td>ROTH</td><td>5632.1</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop (Eclipse Ti)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer (Neubauer)</td><td>A. Hartenstein</td><td>ZK06</td><td></td></tr><tr><td>Humaner basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Humanes endotheliales Serum Freies Medium (hESFM)</td><td>Gibco</td><td>11111-044</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop (Wilovert)</td><td>Hund (Will Wetzlar)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iPS(IMR90)-4 Zellen</td><td></td><td></td><td></td>Zur</tr><tr>Herstellung von 110 ml<td>Kellogg's</td><td></td><td></td><td>Nahrungsergänzungsmittel bereiten Sie 100 ml 4 g/ml Glukose, 0,1 g/ml Glutamin und 0,2 mg/ml Thiaminpyrophosphat und 10 ml 5 mg/ml Fe(NO3)3 vor und kombinieren Sie die Lösungen. Filter, sterilisieren und aliquotiert bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>Knockout-Serumersatz (KOSR)</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin (GlutaMAX)</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>LunaScript RT SuperMix Kit</td><td>NEB</td><td>E3010L</td><td>cDNA-Synthesekit</td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>ROTH</td><td>4627,5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ROTH</td><td>KK36.1</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetten (Research Plus)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>ROTH</td><td>6329</td><td></td></tr><tr><td>Nichtessentielle Aminosäuren (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA-Isolationskit</td><td>Machery-Nagel</td><td>740955</td><td>RNA-Isolationskit</td></tr><tr><td>Pipettenjunge (Accu-Jet Pro)</td><td>Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thrombozytenarmes Plasma gewonnenes Serum, Rind (PDS)</td><td>Fisher</td><td>50-443-029</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25742</td><td>qPCR Master Mix</td></tr><tr><td>qPCR Film (MicroAmp Optical Adhesive Film)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4211971</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Platten (MicroAmp Fast 96-Well)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>ROCK-Inhibitor, Y27632 Dihydrochlorid</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR Thermocycler (StepOnePlus)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipetten</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StemFlex Basalmedium + 50x StemFlex Supplement</td><td>Gibco</td><td>A3349401</td><td>Stammzellerhaltungsmedium</td></tr><tr><td>Schwingender Schaufelrotor (Heraeus #2704)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thiaminpyrophosphat</td><td>Sigma</td><td>C8754-5G</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung, 0,4</td>%<td>Gibco</td><td>15250061 Versene</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>15040-033</td><td>Nicht-enzymatisches Zelldissoziationsreagenz (EDTA)</td></tr></tbody></table>

neisseria meningitidis infektion von induzierten pluripotenten stammzell-abgeleiteten gehirnendothelzellen

Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

Meningokokken-Meningitis ist eine lebensbedrohliche Infektion, die auftritt, wenn Neisseria meningitidis (Meningokokken, Nm) Zugang zum zentralen Nervensystem (ZNS) erlangen kann, indem sie in hochspezialisierte Gehirnendothelzellen (BECs) eindringt. Da es sich bei Nm um einen humanspezifischen Krankheitserreger handelt, macht der Mangel an robusten In-vivo-Modellsystemen die Untersuchung der Wirt-Pathogen-Interaktionen zwischen Nm und BECs schwierig und begründet die Notwendigkeit eines humanbasierten Modells, das native BECs nachahmt. BECs besitzen im Vergleich zu peripheren Endothelzellen, die durch komplexe Tight Junctions und einen erhöhten transendothelialen elektrischen Widerstand (TEER) gekennzeichnet sind, engere Barriereeigenschaften. Viele In-vitro-Modelle , wie z. B. primäre BECs und immortalisierte BECs, fehlen jedoch entweder oder verlieren schnell ihre Barriereeigenschaften, nachdem sie aus der nativen neuronalen Mikroumgebung entfernt wurden. Jüngste Fortschritte in der humanen Stammzelltechnologie haben Methoden zur Ableitung gehirnähnlicher Endothelzellen aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) entwickelt, die BECs im Vergleich zu anderen In-vitro-Humanmodellen besser phänokopieren. Die Verwendung von iPSC-abgeleiteten BECs (iPSC-BECs) zur Modellierung der Nm-BEC-Interaktion hat den Vorteil, dass menschliche Zellen verwendet werden, die BEC-Barriereeigenschaften besitzen, und kann zur Untersuchung der Barrierezerstörung, der Aktivierung des angeborenen Immunsystems und der bakteriellen Interaktion verwendet werden. Hier zeigen wir, wie man iPSC-BECs aus iPS-Zellen ableiten kann, zusätzlich zur bakteriellen Vorbereitung, Infektion und Probenentnahme für die Analyse.

Das hier beschriebene Protokoll wurde von Stebbins et al. adaptiert und beleuchtet den Prozess zur Differenzierung von iPS-Zellen in gehirnähnliche Endothelzellen, die BHS-Eigenschaften besitzen, und wie dieses Modell für Infektionsstudien mit iPSC-BECs mit Nm19,22 verwendet werden kann. Die iPSC-BECs weisen bei richtiger Differenzierung enge Barriereeigenschaften auf, die durch TEER gemessen werden und oft größer als 2000 Ω·cm2 sind, und exprimieren e...

Das hier beschriebene Protokoll zeigt die wichtigsten Schritte bei der Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus gehirnähnlichen Endothelzellen, der Vorbereitung von Neisseria meningitidis auf eine Infektion und der Probenentnahme für andere molekulare Analysen.

Neisseria meningitidis Infektion von induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Gehirnendothelzellen

Meningococcal meningitis is a life-threatening infection that occurs when Neisseria meningitidis (meningococcus, Nm) can gain access to the central ...

Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung von iPSC-abgeleiteten hirnähnlichen Endothelzellen, um die Interaktionen zwischen Wirtserregern an den Blut-Hirn-Schranken, wie z. B. der meningealen Blut-Liquor-Schranke, in einem Modell zu untersuchen, das Endothelzellen des Gehirns in vivo besser nachahmen kann. Die In-vitro-Untersuchung der Barriereeigenschaften von Endothelzellen im Gehirn und der Wechselwirkungen mit humanspezifischen Krankheitserregern kann aufgrund von Einschränkungen bei der Modellierung eine Herausforderung darstellen. iPSC-abgeleitete Endothelzellen des Gehirns sind für diese Anwendungen besonders nützlich, da sie überlegene Barrierephänotypen besitzen und menschlichen Ursprungs sind.Halten Sie die induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in Sechs-Well-Platten mit zwei Millilitern Stammzellerhaltungsmedium. Um die Zellen zu passieren, aspirieren Sie das Medium aus einer Vertiefung, die nicht konfluent ist, und fügen Sie einen Milliliter nicht-enzymatisches Zelldissoziationsreagenz hinzu. Dann inkubieren Sie die Platte sieben Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Ersetzen Sie in der Zwischenzeit die Matrix-Gel-Lösung auf einer neuen Sechs-Well-Platte durch zwei Milliliter frisches Stammzellerhaltungsmedium pro Well. Aspirieren Sie das Reagenz für die Zelldissoziation und achten Sie darauf, keine Zellen zu aspirieren, die noch an der Platte befestigt sind. Spülen Sie den Boden der Vertiefung mit sechs Millilitern Stammzellerhaltungsmedium aus, bis sich alle Zellen vollständig gelöst haben.Säen Sie die neue Sechs-Well-Platte mit unterschiedlichen Dichten, in der Regel ein bis sechs oder ein bis 12 für die normale Wartung. Schütteln Sie die Platte hin und her und von links nach rechts und pausieren Sie zwischen abwechselnden Schüttelbewegungen, bis sich das Medium abgesetzt hat. Legen Sie es dann in den Inkubator.Geben Sie einen Milliliter enzymatisches Zelldissoziationsreagenz in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte sieben Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Um das Reagenz der Zelldissoziation zu deaktivieren, geben Sie einen Milliliter der Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit mindestens zwei Millilitern frischem Stammzellerhaltungsmedium. Schleudern Sie die Zellensuspension fünf Minuten lang bei 1500 G herunter.Dann resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter Stammzellerhaltungsmedium und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Resuspendieren Sie 7,5 mal 10 bis fünfte Zellen in 12 Millilitern Stammzellerhaltungsmedium und 10 mikromolaren Gesteinsinhibitoren. Die Matrix aus einem T75-Kolben aspirieren und die Zellsuspension in den Kolben übertragen.Schütteln Sie den Kolben, um die Zellen zu verteilen, und legen Sie ihn in den Inkubator. Aktualisieren Sie das Medium in den nächsten zwei Tagen täglich, um den Gesteinsinhibitor zu entfernen und das Wachstum der Stammzellkolonien zu unterstützen. Beginnen Sie am dritten Tag mit der Differenzierung, indem Sie das Medium in ein unbedingtes Medium verwandeln.Wechseln Sie das Medium in den nächsten fünf Tagen täglich. Sechs Tage nach Beginn der Differenzierung wird die Endothelzellpopulation selektiv erweitert, indem auf Endothelzell- oder EC-Medium mit 20 Nanogramm pro Milliliter bFGF und 10 mikromolare Retinsäure umgestellt wird. Inkubieren Sie die Zellen zwei Tage lang.Bereiten Sie Kollagen IV und Fibronektinlösung gemäß den Anweisungen des Manuskripts vor und verwenden Sie es zum Beschichten von Zellkulturplatten und Membraneinsätzen. Das EC-Medium wird aus den Zellen aspiriert und 12 Milliliter Zelldissoziationsreagenz zugegeben. Der Kolben wird bei 37 Grad Celsius inkubiert, bis sich 90 % der Zellen abgelöst haben.Während der Inkubationszeit die Beschichtungslösung von den zuvor vorbereiteten Platten und Einsätzen entfernen und in einer sterilen Haube trocknen lassen. Sobald sich die Zellen abgelöst haben, verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Übertragen Sie die Zellen in ein 50-Milliliter-Röhrchen und verdünnen Sie sie mit dem gleichen Volumen humanem endothelialem serumfreiem Medium.Zählen Sie dann die Zellen mit einem Hämozytometer. Pelletieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 1500 g. Anschließend werden sie in frisch aufbereitetem EC-Medium mit bFGF und Retinsäure für eine Konzentration von 2 Millionen Zellen pro Milliliter resuspendiert.Geben Sie 500 Mikroliter der Zellsuspension auf die Oberseite eines 12-Well-Einsatzes und 1,5 Milliliter Medium auf die Unterseite. Verteilen Sie die Zellen gleichmäßig über den Einsatz und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Wechseln Sie am nächsten Tag das Medium auf EC ohne bFGF oder Retinsäure.Setzen Sie das Epithel-Volt/Ohm-Messgerät in die Biosicherheitshaube ein und schließen Sie die Elektroden an. Desinfizieren Sie die Elektroden, indem Sie sie mindestens fünf Minuten lang in 70%iges Ethanol tauchen und vollständig trocknen lassen. Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und messen Sie sofort den transendothelialen elektrischen Widerstand (TEER), indem Sie die kürzere Elektrode auf den Einsatz und die längere Elektrode in das den Einsatz umgebende Medium legen.Beginnen Sie am Tag vor dem Infektionsexperiment mit einer Übernachtkultur der Bakterien aus gefrorenem Bestand. Neisseria meningitidis mit 5 % Schafsblut auf Columbia Agar streichen und über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Pathogene Bakterien wie Neisseria meningitidis haben das Potenzial, beim Menschen Krankheiten auszulösen.Es ist wichtig, Personen, die mit solchen Mikroorganismen arbeiten, richtig zu schulen, immer Best Practices anzuwenden und die richtige PSA zu tragen. Bereiten Sie am nächsten Tag frische PPM plus-Medien gemäß den Anweisungen des Manuskripts vor und impfen Sie 10 Milliliter des Mediums mit den Bakterien und inkubieren Sie die Kultur. Während die Bakterien inkubieren, ersetzen Sie das Medium in den iPSC-abgeleiteten Endothelzellen des Gehirns und zentrifugieren Sie die Bakterienkultur dann 10 Minuten lang bei 4.000 g.Saugen Sie das Medium an und resuspendieren Sie das Pellet in 250 Mikrolitern PBS. Stellen Sie sich auf einen OD600 von etwa 0,4 ein, was ungefähr eins mal 10 zur achten koloniebildenden Einheit pro Milliliter entspricht. Verdünnen Sie die Bakterien auf die gewünschte Infektionsvielfalt mit EC-Medium und infizieren Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern der vorbereiteten Bakteriensuspension pro Vertiefung.Dann inkubieren Sie die Zellen für die gewünschte Zeit der Infektion. Bei richtiger Differenzierung weisen die iPSC-abgeleiteten Endothelzellen des Gehirns enge Barriereeigenschaften auf, die oft mehr als 2000 Ohm Zentimeter im Quadrat betragen, und endotheliale Marker wie VE-Cadherin und CD-31. Darüber hinaus exprimieren und lokalisieren sie die Tight-Junction-Marker Claudin-5, Occludin und ZO-1 sowie Transporter wie Glut-1.Nach einer Infektion mit Neisseria meningitidis regulieren die Zellen neutrophilische, proinflammatorische Zytokine wie CXCL8, CXCL1, CXCL2, CCL20 und IL6 hoch. Bei der Zelldifferenzierung ist die tägliche Pflege und das Erreichen der anfänglichen optimalen Aussaatdichte bei der Teilung der Zellen von entscheidender Bedeutung. Nach den hier beschriebenen Schritten können Forscher eine Vielzahl von Proben sammeln, um viele Aspekte der postpathogenen Interaktion zu untersuchen, von Entzündungsreaktionen bis hin zur Dysfunktion von Endothelzellen des Gehirns.Das Aufkommen von Endothelzellen im Gehirn, die aus iPS-Zellen gewonnen werden, hat die Türen für den Bereich der Hirnbarrieren geöffnet, um eine Vielzahl von Krankheiten zu untersuchen, bei denen Endothelzellen beeinträchtigt sind. Da bestimmte ZNS-Erreger humanspezifisch sind, demonstrieren wir die Verwendung eines humanbasierten Systems mit dem humanspezifischen Erreger Neisseria meningitidis

neisseria-meningitidis-infection-induced-pluripotent-stem-cell

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Diese Methode beschreibt, wie zu isolieren und zu verewigen mikrovaskulären Endothelzellen von der Maus Gehirn. Wir beschreiben ein Schritt-für-Schritt-Protokoll ausgehend von der Homogenisierung von Hirngewebe, Verdauungsschritten, Aussaat und Immortalisierung der Zellen. Normalerweise dauert es etwa fünf Wochen, um eine homogene, verewigt mikrovaskuläre Endothelzellen Zelllinie zu erhalten.

Erzeugung eines Immortalisierte Murine Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen Zelllinie als<em&gt; In Vitro</em&gt; Blut-Hirn-Barriere Modell

Dieses Video zeigt ein Protokoll zur Induktion der Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen in Gehirn-Endothelzellen.

Generierung von Endothelzellen des Gehirns aus induzierten pluripotenten Stammzellen

Dieses Video zeigt einen mehrstufigen Prozess zur Differenzierung von humanen iPSCs in mikrovaskuläre Endothelzellen des Gehirns. Die daraus resultierenden differenzierten Zellen ahmen die mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns nach, die sich durch Tight Junctions auszeichnen, was sie ideal für die Erforschung von Hirnerkrankungen macht.

Differenzierung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen in mikrovaskuläre Endothelzellen des Gehirns

Quelle: Parajuli, B., et.al. Transplantation von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Mikroglia in immunkompetente Mäusegehirne über einen nicht-invasiven transnasalen Weg. J. Vis. Exp. (2022).Dieses Video zeigt die transnasale Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSMG) in ein Mausgehirn. Hyaluronidase wird auf die Nasenlöcher einer Maus mit Mikroglia-Depletion aufgetragen, um die Durchlässigkeit zu erhöhen. Die iPSMG-Suspension wird intranasal...

Transnasale Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen aus humanen Mikrogliazellen in das Gehirn der Maus

Hier präsentieren wir unsere etablierte Methode zur menschlichen Körperzellen in gentechnikfreien menschlichen iPS-Zellen mit Sendai-Virus, das konsequente Ergebnis-und Effizienzsteigerung zeigt neu zu programmieren.

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

Gehirn-Targeting-residente Zellen für die direkte Abstammungslinie Neuprogrammierung bietet neue Perspektiven für die Gehirn-Reparatur. Hier beschreiben wir ein Protokoll, wie die Kulturen für Gehirn-Resident Perizyten aus erwachsenen menschlichen Gehirnrinde angereichert vorzubereiten und wandeln diese in induzierten Neuronen durch Retrovirus-vermittelte Expression der Transkriptionsfaktoren und Sox2 ASCL1.

Lineage-Umprogrammierung der Perizyten-abgeleiteten Zellen des erwachsenen menschlichen Gehirn in Neuronen induziert

Hier beschreiben wir eine Methode, um Meningokokken-Meningitis durch einen intrazisternalen Infektionsweg bei erwachsenen Mäusen zu induzieren. Wir präsentieren ein Schritt-für-Schritt-Protokoll der Meningokokken-Infektion von der Vorbereitung von Inokulum bis zur intrazisternalen Infektion; dann erfassen Sie das Überleben des Tieres und bewerten Sie die bakteriellen Belastungen in murinen Geweben.

Induzieren von Meningokokken-Meningitis Serogroup C bei Mäusen über Intracisternal Delivery

Wir beschreiben eine intrazisternale Injektion, die eine an der Spitze gebogene Nadel verwendet, die zum Schädel stabilisiert werden kann, wodurch das Risiko einer Schädigung des darunter liegenden Parenchyms beseitigt wird. Der Ansatz kann für die genetische Schicksalskartierung und Manipulation von Leptomeningealzellen und für die Verfolgung der Bewegung von Zerebrospinalflüssigkeit verwendet werden.

Induktion von Leptomeningealzellen Modifikation über intrazisternale Injektion

Dieses Protokoll beschreibt eine angepasste Methode zur Ableitung, Erweiterung und Kryokonservierung mikrovaskulärer Endothelzellen des Gehirns, die durch Differenzierung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen werden, und zur Untersuchung der Eigenschaften der Bluthirnschranke in einem Ex-vivo-Modell.

Ableitung, Expansion, Kryokonservierung und Charakterisierung von mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns aus humaninduzierten Pluripotenten Stammzellen

Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten menschlichen Mikroglia (iPSMG) in das Gehirn über einen transnasalen Weg bei immunkompetenten Mäusen. Die Methode zur Herstellung und transnasalen Transplantation von Zellen und die Verabreichung von Zytokinmischung zur Aufrechterhaltung von iPSMG wird gezeigt.

Transplantation von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Mikroglia im immunkompetenten Mäusegehirn über nicht-invasiven transnasalen Weg

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll, die erweiterte Endothelzellkulturmethode (EECM), die die Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu mikrovaskulären Endothelzellen (BMEC)-ähnlichen Zellen des Gehirns ermöglicht. Diese Zellen zeigen die Expression von Endothelzelladhäsionsmolekülen und sind somit ein humanes Blut-Hirn-Schrankenmodell, das geeignet ist, Immunzellinteraktionen in vitro zu untersuchen.

Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen zu mikrovaskulären Endothelzellzellen des Gehirns mit einem reifen Immunphänotyp

Erfahren Sie die Infektion von iPSC-abgeleiteten Gehirnendothelzellen mit Neisseria meningitidis zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen an der Blut-Hirn-Schranke. Diese Methode ermöglicht molekulare Analysen neurologischer Infektionen.

Neisseria meningitidis Infektion von induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Gehirnendothelzellen

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