Name: In-vitro- und In-vivo-Verabreichung von magnetischer Nanopartikel-Hyperthermie mit einem maßgeschneiderten Verabreichungssystem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Erfahren Sie die präzise Verabreichung magnetischer Nanopartikel-Hyperthermie in präklinischen Modellen. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Erwärmung von Zielgeweben mit kontinuierlicher Thermometrie für Sicherheit und Dosimetrie.

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Die Studie wurde durch die Fördernummern NCI P30 CA023108 und NCI U54 CA151662 finanziert.

Das Dartmouth College Animal Care and Use Program ist von der American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (iAAALAC) akkreditiert und hält sich an alle Richtlinien und Vorschriften von UDSA und NIH (Office of Laboratory Animal Welfare). Alle In-vivo-Studien wurden vom Dartmouth College Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Das Euthanasieverfahren entspricht den AVMA-Richtlinien für die Euthanasie von Tieren aus dem Jahr 2020.
1. Instrumentierung/Aufbau des Systems
<ol><li>Entwerfen Sie eine benutzerdefinierte AMF-Antenne (Spule) als geschlossene Schleife und wählen Sie Formen aus, um das gewünschte Magnetfeld zu erzeugen. Verwenden Sie Induktivitätsformeln und Eigenschaften aus der Auswahl des Stromgenerators, um kompatible Spulen zu entwerfen, um das gewünschte Feld zu erzeugen. Verwenden Sie unterschiedliche Designs für In-vitro- und In-vivo-Experimente.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Induktivität der AMF-Antenne innerhalb des akzeptablen Bereichs des Stromgenerators liegt. Fügen Sie Kondensatoren hinzu oder subtrahieren Sie sie, um die Antenne an den Stromgenerator anzupassen (abzustimmen).</li>
	<li>Entwerfen Sie für In-vitro-Experimente eine spiralförmige Spule mit 14 Windungen und einem Innendurchmesser von 2 cm und einer Länge von 14 cm, die 1,5-ml-Röhrchen enthalten kann, so dass mehrere Proben gleichzeitig behandelt werden können. Isolieren Sie die Spule mit einem Vinylpolymer und verwenden Sie einen Styropor-Abstandhalter, um die Spule von den Rohren zu trennen. Einzelheiten zu den Entwurfsspezifikationen und -überlegungen sind in der Zusatzdatei 1 enthalten.</li>
	<li>Erwerben Sie für In-vivo-Experimente eine speziell angefertigte Ganzkörper-Spiralspule von einem Hersteller mit proprietären Designinformationen. Verwenden Sie einen 8-mm-Vierkantschlauch (da dies ein gleichmäßigeres Feld innerhalb der Bohrung der Spule erzeugt) und einen Konzentrator im Zielbehandlungsbereich. Machen Sie den Konzentrator 5,0 cm lang, mit insgesamt 5 Umdrehungen, was zu einem Innendurchmesser von 3,6 cm und einem Außendurchmesser von 5,2 cm führt, und positionieren Sie sich im Zielbereich. Umgeben Sie die Spule mit einer Polycarbonat-Schale.</li>
	<li>Verwenden Sie einen AMF-Generator mit einstellbarer Leistung und Frequenz von 10 kW oder mehr als Stromquelle. Die Induktivität passt die Stromquelle und die Antennen/Spulen auf einen Bereich von 0,62 bis 1,18 μHenries (μH) an, was Frequenzen zwischen 30 und 300 kHz ermöglicht. Kühlen Sie den Generator mit recyceltem Wasser durch eine Zentrifugalpumpe, deren Druck auf 50 psi geregelt ist.</li>
	<li>Kühlen Sie die Spulen mit einem Kühler mit einer Kühlleistung von 5,6 Tonnen, der 25% Wärmeträgerflüssigkeit auf Ethylenglykolbasis, die mit Wasser verdünnt ist, durch die AMF-Antenne pumpt. Stellen Sie die Temperatur des Kühlers so ein, dass die Antenne die Probe nicht erwärmt oder kühlt.</li>
	<li>Für die Tiereindämmung konstruieren Sie einen schlauchförmigen Halter, der in der Mitte der Spule mit einem Luftspalt von 0,5 cm zwischen dem Halter und der Spulenoberfläche aufgehängt werden kann. Schließen Sie eine einstellbare konditionierte Luftpumpe an, die Luft durch die Schale um die Spule zirkulieren lässt, und stellen Sie sie so ein, dass sie eine normale Tierkerntemperatur aufrechterhält. Verbinden Sie das Anästhesiegerät mit dem röhrenförmigen Tierhalter in der Nähe des Kopfes des Tieres, um eine ordnungsgemäße Anästhesie zu gewährleisten.</li>
	<li>Erstellen Sie für die Zelleindämmung eine Vorrichtung, die Wasser aus einem Wasserbad durch den Abstandshalter zirkulieren lässt, in dem sich die Schläuche befinden. Stellen Sie die Temperatur dieses Wasserbades so ein, dass die Rohre von Wasser bei 37 °C umgeben sind.</li>
	<li>Verwenden Sie faseroptische Sonden, um die Temperaturen innerhalb des Tumors, des Tierkerns und der Tierumgebung zu überwachen, oder für In-vitro-Studien, um die Temperatur des Zellpellets und des Wassers, das die Röhrchen umgibt, zu überwachen.</li>
	<li>Verwenden Sie magnetische Eisenoxid-Nanopartikel mit einer Größe von 100 nm für alle Experimente. ANMERKUNG: Konzentration und spezifische Absorptionsrate (SAR) sind zwei Merkmale, die bei der Auswahl von Nanopartikeln berücksichtigt werden müssen, da sie sich direkt auf die mögliche Wärme- und Wärmedosis auswirken18.</li>
</ol>2. Hyperthermie in vitro
<ol><li>Kultur B16F10 murine Melanomzellen in RPMI-Medien mit 10% FBS und 1% Pen/Streptokokken. Platte 150.000 Zellen/Well in 6-Well-Platten mit 2 mL vollständigem Medium.</li>
	<li>Bestimmen Sie die geeignete Behandlung für jede Vertiefung, d.h. Zellen ohne mNPs und ohne AMF, Zellen mit mNPs und ohne AMF, Zellen ohne mNPs und AMF, Zellen mit mNPs und AMF. HINWEIS: Stellen Sie außerdem sicher, dass geeignete Kontrollen vorhanden sind, wenn Sie Hyperthermie mit einer anderen Therapie kombinieren. AMF wird in einem Standard-Forschungslabor durchgeführt, das mit den erforderlichen Strom- und Kühlkapazitäten nachgerüstet ist.</li>
	<li>24 Stunden nach der Beschichtung mNPs in die entsprechenden Vertiefungen geben, wie im vorherigen Schritt bestimmt. Fügen Sie mNPs zu einer Konzentration von 3 mg Eisen / ml hinzu. Stellen Sie sicher, dass die mNPs im gesamten Bohrloch verteilt sind, indem Sie entweder eine Standardmedien/mNP-Lösung erstellen (alte Medien entfernen, diese Lösung hinzufügen) oder indem Sie die mNPs direkt und sanft wirbelnde Platten hinzufügen, um eine homogene Verteilung zu gewährleisten.</li>
	<li>Beginnen Sie die Behandlung 48 Stunden nach der Zugabe von mNPs, wenn die Wells ~ 80% konfluent sind, indem Sie das Medium entfernen und die Wells mit frischen Medien waschen. Entfernen Sie das Medium.</li>
	<li>Fügen Sie 0,5 ml Trypsin zu jedem behandelten Wohlbefinden hinzu und schwenken Sie es sanft. Verwenden Sie ein Mikroskop, um zu überprüfen, ob die Zellen abgelöst sind.</li>
	<li>Geben Sie 1 ml Medium in jede Vertiefung, um die Zellen in 1,5-ml-Röhrchen zu sammeln. Sammeln Sie alle Zellen aus dem Brunnen (~ 1 x 106 Zellen). Verwenden Sie für jede Vertiefung ein deutlich beschriftetes separates Röhrchen.</li>
	<li>Spinnröhrchen bei 60 x g für 2-3 min, damit die Zellen pelletieren können. Bewahren Sie das Pellet im Medium auf.</li>
	<li>Legen Sie die Schläuche in den mit Wasser gefüllten Abstandhalter in der Spule. Stellen Sie die Temperatur des Wasserbades so ein, dass das Medium und das Zellpellet auf 37 °C gehalten werden. Überwachen Sie die Temperatur innerhalb der Röhre und des Wasserbades mit separaten faseroptischen Temperaturfühlern.</li>
	<li>Schalten Sie den Kühler ein und überprüfen Sie, ob das Kühlmittel durch die Spule fließt. Schalten Sie die Stromquelle ein, und stellen Sie den Prozentsatz des Maximums auf das gewünschte Feld ein. Betreiben Sie die 14-Gang-Magnetspule, die von einem 10-kW-Generator gespeist wird, bei 165 kHz und 23,87 kA/m (300 Oe).</li>
	<li>Platzieren Sie einen separaten faseroptischen Temperaturfühler in einem der Rohre. Behandeln Sie die Zellen bis zur zuvor festgelegten thermischen Protokolldosis. Ein Beispiel ist 30 min bei 43 °C (CEM43 von 30).</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in den Medien, die sich in ihren Röhrchen befinden, und beschichten Sie sie in neue 6-Well-Platten. Beschriften Sie die neuen Schilder deutlich. Das Ziel ist es, alle gesammelten Zellen (~ 1 x 106 Zellen) neu zu beschichten. HINWEIS: Es sollten neue 6-Well-Platten verwendet werden, um sicherzustellen, dass die zu kultivierenden Zellen behandelt werden. Wenn die alten Platten verwendet werden, können immer noch Zellen auf den Platten verbleiben, die nicht erfolgreich trypsinisiert wurden.</li>
	<li>Falls erforderlich, für das nächste experimentelle Verfahren, lysieren Sie die Zellen für die RNA- oder Proteinexpressionsanalyse.</li>
</ol>3. Hyperthermie in vivo
<ol><li>Zellkultur und Impfung<ol><li>Kultur B16F10 murine Melanomzellen in RPMI-Medien mit 10% FBS und 1% Pen/Streptokokken. Verwenden Sie Teller / Schüsseln, die genügend Zellen für die Impfung der gewünschten Anzahl von Tieren liefern. Zum Beispiel werden 10, 100 mm Schalen, die mit 100.000 Zellen plattiert sind, mit genügend Zellen für 20 Mäuseinjektionen innerhalb von 48 Stunden konfluieren.</li>
		<li>Trypsinisieren Sie die Zellen und sammeln Sie sie mit reinem RPMI-Medium (kein FBS oder Pen/Streptokokken).</li>
		<li>Zählen Sie die Zellen und erstellen Sie eine Lösung für die gewünschte Zellkonzentration, basierend auf dem Impfvolumen und der Anzahl der Mäuse.</li>
		<li>Betäuben Sie 6 Wochen alte weibliche C57Bl/6-Mäuse mit verdampftem Isofluran und Sauerstoff. Legen Sie die Tiere in einen Plexiglaskasten mit 5% Isofluran und 95% Sauerstoff, bis sie induziert sind. Nach der Induktion wird das Tier entnommen und ein Stirnkegel mit 2 % Isofluran verwendet, um die Schritte 3.1.5-3.1.7 und 3.3.3-3.3.6 abzuschließen. HINWEIS: Für die Anästhesie während der Behandlung verwenden Sie eine eingebaute Anästhesieeindämmung. Befolgen Sie die institutionellen Standardprotokolle für die Anästhesie der Maus. Stellen Sie vor dem Tierversuch eine entsprechende IACUC-Zulassung sicher. Bringen Sie das Tier nach der Anästhesie in den Käfig zurück und überwachen Sie die Genesung, um sicherzustellen, dass keine Komplikationen auftreten.</li>
		<li>Überprüfen Sie, ob Sie nicht auf die aufrichtenden Reflexe reagieren.</li>
		<li>Rasieren Sie die rechte Flanke mit einem Elektrorasierer.</li>
		<li>Reinigen Sie den Injektionsbereich mit einem Alkoholtupfer. Injizieren Sie 1-2 x 106 Zellen mit einer 100 μL Glasspritze mit einer 28 G Nadel, dispergiert in 50 μL Medien intradermal auf der rasierten rechten Flanke der Anästhesie.</li>
	</ol></li>
	<li>Tumorwachstum/Nanopartikel-Injektion<ol><li>Messen Sie Tumore in 3 Dimensionen mit Messschiebern (Länge, Breite und Tiefe) und berechnen Sie Volumina nach (Länge x Breite x Tiefe x π)/6.</li>
		<li>Wenn das Tumorvolumen 120 mm3 (+/- 20mm3) erreicht, werden die Tiere untersucht. Entwerfen Sie die Studie und stellen Sie sicher, dass es geeignete Kontroll- und Behandlungsgruppen gibt, einschließlich Kombinationstherapie-Kohorten (d. h. Kontrolle, mNPH, Bestrahlung und die Kombination).</li>
		<li>Betäubung von Mäusen, die mNPs erhalten, wie in 3.1.4 beschrieben.</li>
		<li>Reinigen Sie den Bereich mit einem Alkoholtupfer. Injizieren Sie mNPs 3 h vor der AMF-Behandlung in den Tumor. Injizieren Sie ein Volumen, so dass die Dosis 7,5 mg Eisen / cm3 des Tumors beträgt. HINWEIS: Unveröffentlichte Daten aus dem Labor deuten darauf hin, dass die maximale mNP-Aufnahme nach 3-6 Stunden erfolgt.</li>
	</ol></li>
	<li>AMF-Behandlung<ol><li>Betäuben Sie die Maus und legen Sie sie auf ein Heizkissen, um die Kerntemperatur aufrechtzuerhalten.</li>
		<li>Überprüfen Sie, ob Sie nicht auf die aufrichtenden Reflexe reagieren. Entfernen Sie die Ohrmarke oder andere Metallgegenstände an der Maus.</li>
		<li>Setzen Sie vorsichtig einen geschmierten faseroptischen Temperaturfühler in das Rektum der Maus ein.</li>
		<li>Legen Sie einen Katheter in den Tumor und entfernen Sie die Nadel. Schneiden Sie den Katheter so, dass er nicht zu sehr aus dem Tumor herausragt. HINWEIS: Die faseroptischen Temperaturkatheter werden platziert und entfernt, während sich die Mäuse unter Vollnarkose befinden, d.h. die Katheter sind nur während der Tumorerwärmung an Ort und Stelle. Mäuse erhalten zum Zeitpunkt des Eingriffs eine subkutane Einzeldosis eines NSAID-Analgesiemedikaments, Ketoprofen (5 mg/kg). Wir haben keine kurz- oder langfristigen Beschwerden oder Morbiditäten im Zusammenhang mit der Platzierung der Katheter beobachtet.</li>
		<li>Führen Sie einen faseroptischen 3-Sensor-Temperaturfühler in den Katheter ein. Der Katheter schützt die faseroptischen Temperaturfühlersensoren.</li>
		<li>Kleben Sie die rektale und intratumorale Sonde an den Schwanz des Tieres, um sicherzustellen, dass sie an Ort und Stelle bleiben.</li>
		<li>Legen Sie die Maus in ein 50-ml-Röhrchen und gehen Sie mit dem Kopf nach unten. Der Schlauch sollte ein Loch in der Nähe des Kopfes haben, wo die Anästhesie angeschlossen und abgegeben wird.</li>
		<li>Legen Sie den Schlauch in die Spule und schließen Sie die Anästhesie wieder an.</li>
		<li>Legen Sie einen faseroptischen Temperaturfühler locker in die Röhre, um die Umgebungstemperatur zu messen.</li>
		<li>Schalten Sie den Kühler ein und stellen Sie sicher, dass das Kühlmittel zirkuliert.</li>
		<li>Überprüfen und stellen Sie sicher, dass die Computersoftware die verschiedenen Temperaturen anzeigt, und beginnen Sie mit der Aufzeichnung, damit eine CEM43-Berechnung in Echtzeit angezeigt werden kann. Das erforderliche CEM43 ist die zuvor festgelegte Dosis. HINWEIS: Bevor der Magnet eingeschaltet wird, stellen Sie sicher, dass keine Metallgegenstände am Tier befestigt sind, da sich diese schnell erwärmen. Stellen Sie außerdem sicher, dass jeder im Raum keinen Herzschrittmacher hat und es für sie sicher ist, dort zu sein.</li>
		<li>Schalten Sie den Magneten bei einem niedrigen Leistungsprozentsatz ein.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass die faseroptischen Temperaturfühler Temperaturänderungen aufzeichnen. Die Temperaturen steigen an, sobald das AMF aktiviert wird, wenn das Feld zunimmt. Stellen Sie sicher, dass die Kerntemperatur des Tieres bei 38 °C bleibt. Regulieren Sie die Kerntemperatur mit dem klimatisierten Luftmantel.</li>
		<li>Passen Sie die Stärke des Magnetfeldes an, indem Sie die Leistung des Generators mit dem eingebauten Einstellrad ändern, das wiederum das Temperaturniveau im Tumor steuert.</li>
		<li>Schalten Sie die AMF ab, sobald die gewünschte Dosis, wie sie zuvor vom Benutzer bestimmt wurde (z. B. CEM43 40), innerhalb des Tumors erreicht ist.</li>
		<li>Sobald die AMF abgeschaltet ist, entfernen Sie den Schlauch von der Spule.</li>
		<li>Nehmen Sie die Maus aus dem Röhrchen und ziehen Sie die verschiedenen Sonden und den Katheter heraus. Wenn nötig, markieren Sie das Tier mit einer neuen Ohrmarke aus Metall.</li>
		<li>Sobald die Behandlungen abgeschlossen sind, schalten Sie den Kühler aus.</li>
		<li>Erholen Sie die Tiere aus der Narkose, um Komplikationen zu vermeiden. Überwachen Sie ihr Verhalten, um sicherzustellen, dass sie zur Normalität zurückkehren.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das Design und die Implementierung dieses Systems bietet die Möglichkeit, genaue und reproduzierbare In-vitro- und In-vivo-Experimente zur magnetischen Nanopartikel-Hyperthermie durchzuführen. Es ist wichtig, dass das System so ausgelegt ist, dass die AMF-Frequenz und die Feldstärke angemessen auf den magnetischen Nanopartikeltyp, die Konzentration und die gewünschte Gewebeposition und -temperatur abgestimmt sind. Darüber hinaus ist die genaue Überwachung der Temperatur in Echtzeit entscheidend für die Sicherheit und die...

Hyperthermie wurde in der Vergangenheit in der Krebstherapie eingesetzt, entweder allein oder in Kombination mit anderen Behandlungen. Obwohl es eine lange Geschichte der Verwendung hat, wird die vorteilhafteste Methode zur Verabreichung dieser Behandlung immer noch diskutiert und hängt vom Krankheitsort und -ort ab. Zu den Verfahren zur Hyperthermieabgabe gehören Mikrowellen-, Hochfrequenz-, fokussierter Ultraschall, Laser und metallische Nanopartikel (wie Gold oder Eisenoxid)1,2,3,4. Diese Verabreichungsmethoden können zu einer Reihe von Behandlungstemperaturen von Fieber bis zu Hunderten von Grad Celsius führen. Die biologische Wirkung der Hyperthermie hängt in erster Linie von den verwendeten Temperaturen und der Dauer der Behandlungab 5. Für dieses Manuskript und Zweck konzentrieren wir uns auf die magnetische Nanopartikel-Hyperthermie (mNPH). Diese Methode ermöglicht fokussierte, lokalisierte, gut überwachte und kontrollierte Temperaturänderungen unter Verwendung von ungiftigen, von der FDA zugelassenen Eisenoxid-Nanopartikeln.
Ein Fallstrick bei anderen Hyperthermie-Modalitäten ist das Fehlen eines präzisen zellulären Targetings. Hyperthermie hat kein inhärent hohes therapeutisches Verhältnis, daher ist eine sorgfältige Thermometrie und gezieltes Targeting erforderlich6. mNPH ermöglicht die systemische oder intratumorale Injektion von mNPs, wobei Wärme nur dort erzeugt wird, wo sich die mNPs befinden, wodurch die Behandlung direkt auf den Tumor ausgerichtet ist. mNPH kann wirksam sein, wenn sich die magnetischen Nanopartikel innerhalb oder außerhalb der Zelle befinden. Für die Krebstherapie ist die allgemeine Übersicht von mNPH, dass die magnetischen Nanopartikel injiziert werden (intratumoral oder intravenös), dann wird ein magnetisches Wechselfeld angelegt, wodurch sich die magnetischen Pole der Nanopartikel ständig neu ausrichten, was zu einer lokalen Erwärmung der Zellen und des Gewebes führt, die mit den Nanopartikeln assoziiertsind 7,8 . Durch die Einstellung des Volumens der Nanopartikel und der Frequenz/Stärke des magnetischen Wechselfeldes (AMF) ist es möglich, die im Gewebe erzeugte Temperatur sorgfältig zu steuern.
Diese Behandlung funktioniert gut bei Tumoren, die sich in der Nähe der Körperoberfläche befinden, da tiefere Tumore eine stärkere AMF erfordern, so dass das Risiko einer Wirbelstromerwärmung steigt9. Es gibt Hinweise darauf, dass Hyperthermie klinisch als Monotherapie eingesetzt wird, jedoch wird Hyperthermie oft mit einer Strahlentherapie oder Chemotherapie kombiniert, was zu einer gezielteren Anti-Krebs-Wirkung führt10,11,12. Der klinische Nachweis von Hyperthermie in Kombination mit einer Strahlentherapie wurde in einer früheren Veröffentlichungüberprüft 13. Unser Labor hat eine Vielzahl von Tieren, von Mäusen über Schweine bis hin zu spontanen Krebserkrankungen bei Hunden, mit der mNPH-Methode12,14,15 erfolgreich behandelt. Dieses Protokoll richtet sich an alle, die daran interessiert sind, die Auswirkungen einer lokalisierten Hyperthermiebehandlung allein oder in Kombination mit anderen Therapien zu untersuchen.
Einer der wichtigsten Faktoren bei der Hyperthermie ist die Fähigkeit, die thermische Dosis, die an das Ziel-/Tumorgewebe abgegeben wird, in Echtzeit zu messen und zu verstehen. Eine Standardmethode zur Berechnung und zum Vergleich der Dosis ist der Nachweis der kumulativen äquivalenten Erhitzungsminuten bei 43 °C. Dieser Algorithmus ermöglicht den Vergleich von Dosen unabhängig vom Abgabesystem, maximalen und minimalen Temperaturen (innerhalb eines bestimmten Bereichs) und Aufheiz-/Abkühlparametern 5,16. Die CEM-Berechnung funktioniert am besten für Temperaturen zwischen 39-57 °C5. Zum Beispiel haben wir in einigen der von uns durchgeführten Studien eine thermische Dosis von CEM43 30 (d.h. 30 min bei 43 °C) gewählt. Die Wahl dieser Dosis ermöglichte es uns, eine sichere, wirksame, immungenetische Wirkung in vitro zu untersuchen, sowohl allein als auch in Kombination mit einer EinzeldosisStrahlung 17.
Bei der magnetischen Nanopartikel-Hyperthermie gibt es mehrere Faktoren, die beim Aufbau eines geeigneten Verabreichungssystems berücksichtigt werden müssen. Das Instrumentierungsdesign umfasst wichtige Sicherheitsfaktoren, wie z. B. die Verwendung eines Kühlers, um sicherzustellen, dass die Magnetfeldübertragungsgeräte auch bei hoher Leistung kühl bleiben, und ausfallsichere Verfahren, die verhindern, dass das System eingeschaltet wird, wenn nicht alle Temperatur-, Leistungsbewertungs- und Steuerungssysteme aktiviert wurden. Darüber hinaus gibt es wichtige biologische Faktoren, die sowohl für In-vivo- als auch für In-vitro-Situationen berücksichtigt werden müssen. Bei der Verwendung von kultivierten Zellen ist es notwendig, in Wachstumsmedien zu behandeln und auf einer konstanten lebensfähigen Temperatur zu halten, um physiologische Veränderungen zu vermeiden, die die Ergebnisse beeinflussen könnten. Für einzelne Nanopartikeltypen ist es wichtig, die spezifische Absorptionsrate (SAR) zu kennen, wenn AMF-basierte Heizparameter berechnet werden. Ebenso ist es wichtig, die mNP/Fe-Konzentration in Zellen und Geweben zu kennen, die notwendig ist, um die gewünschte Erwärmung zu erreichen. In-vivo-Methoden erfordern noch mehr Liebe zum Detail, da das Tier während der Behandlung unter Narkose gehalten werden muss und die Körperkerntemperatur des Tieres während der gesamten Behandlung auf einem normalen Niveau gehalten werden muss. Wenn die Körpertemperatur des Tieres sinkt, wie dies unter Narkose der Fall ist, kann dies das Gesamtergebnis in Bezug auf die thermische Dosis des zu behandelnden Gewebes beeinflussen.
In diesem Manuskript diskutieren wir die Methoden, die verwendet werden, um ein vielseitiges magnetisches Nanopartikel-Hyperthermiesystem zu entwerfen und zu konstruieren, sowie wichtige Anwendungsfaktoren, die berücksichtigt werden müssen. Das beschriebene System ermöglicht die robuste, konsistente, biologisch angemessene, sichere und gut kontrollierte Abgabe von magnetischer Nanopartikel-Hyperthermie. Schließlich ist zu beachten, dass die von uns durchgeführten mNPH-Studien häufig andere Therapien wie Bestrahlung, Chemotherapie und Immuntherapie beinhalten. Damit diese Ergebnisse aussagekräftig sind, ist es wichtig zu bestimmen, wie sich die abgegebene Wärme auf die Wirksamkeit und/oder Sicherheitstoxizität anderer Modalitäten (oder umgekehrt) und das Wohlbefinden des Tieres auswirken kann. Aus diesem Grund und den zuvor genannten Dosimetrie- und Therapiesituationen ist es unerlässlich, der Dosiergenauigkeit der magnetischen Nanopartikel-Hyperthermie und den kontinuierlichen Kern- und Zieltemperaturmessungen strikte Aufmerksamkeit zu schenken. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine einfache, konsistente Methode und Beschreibung für die Bereitstellung einer sicheren und effektiven magnetischen Nanopartikel-Hyperthermie bereitzustellen.

<table><tbody><tr><td>.25% Trypsin</td><td>Corning</td><td>45000-664</td><td>von vielen Unternehmen erhältlich</td></tr><tr><td>1,5 mL Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf 22363204</td><td>von vielen Unternehmen erhältlich</td></tr><tr><td>B16F10 murine Melanomzellen</td> American <td>Type Culture Collection</td><td>CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>C57/Bl6 Mäuse</td><td>Charles River</td><td>027C57BL/6</td><td>6 Wochen alte weibliche Mäuse</td></tr><tr><td>Chiller</td><td>Thermal Care</td> Kühler <td>der NQ 5-Serie</td><td>, der die Spule kühlt</td></tr><tr><td>Kühlflüssigkeit</td><td>Dow Chemical Company</td><td>Dowtherm SR-1</td><td>Antennenkühlflüssigkeit</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Hyclone</td><td>SH30071</td><td>von vielen Unternehmen erhältlich</td></tr><tr><td>Glasfasersonden, Software und Chassis</td><td>FISO</td><td></td><td>FISO Evolutionssoftware zum Auslesen der Temperaturen</td></tr><tr><td>IR-Kamera</td><td>Flir</td><td></td><td>Infrarotkamera zur Überwachung unbeabsichtigter Erwärmung</td></tr><tr><td>Eisenoxid-Nanopartikel</td><td>micromod Partikeltechnologie GmbH</td><td>Bionisiertes NanoFerrit</td><td>Dextran beschichtete Eisenoxid-Nanopartikel</td></tr><tr><td>Mausspule, Magnet</td><td>Fluxtrol</td><td>kundenspezifisches</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Corning</td><td>45000-652</td><td>von vielen Firmen erhältlich</td></tr><tr><td>HF-Generator</td><td>Huttinger</td><td>TIG 10/300</td><td>Stromquelle</td></tr><tr><td>RPMI Media</td><td>Corning</td><td>45000-396</td><td>von vielen Unternehmen erhältlich</td></tr></tbody></table>

in-vitro- und in-vivo-verabreichung von magnetischer nanopartikel-hyperthermie mit einem maßgeschneiderten verabreichungssystem

In Vitro and In Vivo Delivery of Magnetic Nanoparticle Hyperthermia Using a Custom-Built Delivery System

Hyperthermie wird seit langem bei der Behandlung von Krebs eingesetzt. Die Techniken reichen von der intratumoralen Einführung von heißen Eisenstäben bis hin zu systemisch verabreichten magnetischen Nanopartikeln, die auf Tumorantikörper abzielen, bei Temperaturen von 39 °C (Fieber) bis 1.000 °C (Elektrokauterisation) und Behandlungszeiten von Sekunden bis Stunden. Die Temperatur-Zeit-Beziehung (thermische Dosis) bestimmt die Wirkung mit hohen thermischen Dosen, die zur Gewebeablation führen, und niedrigeren thermischen Dosen, die zu subletalen Effekten wie erhöhtem Blutfluss, Akkumulation von Medikamenten und Immunstimulation führen. Eine der vielversprechendsten medizinischen Therapien ist die magnetische Nanopartikel-Hyperthermie (mNPH). Bei dieser Technik werden magnetische Nanopartikel, die systemisch oder intratumoral abgegeben werden können, mit einem nicht-invasiven, nicht-toxischen magnetischen Wechselfeld aktiviert. Die Größe, der Aufbau und die Assoziation der magnetischen Nanopartikel sowie die Frequenz und Feldstärke des Magnetfeldes sind wichtige Erwärmungsdeterminanten. Wir haben ausgeklügelte Instrumente und Techniken entwickelt, um eine reproduzierbare magnetische Nanopartikel-Hyperthermie in großen und kleinen Tiermodellen und kultivierten Zellen zu ermöglichen. Dieser Ansatz, der eine kontinuierliche Echtzeit-Temperaturüberwachung an mehreren Standorten verwendet, ermöglicht die Abgabe genau definierter thermischer Dosen an das Zielgewebe (Tumor) oder die Zielzellen, während die Erwärmung des Nicht-Zielgewebes begrenzt wird. Die präzise Steuerung und Überwachung der Temperatur an mehreren Standorten und die Verwendung des Industriestandardalgorithmus (kumulative äquivalente Minuten bei 43 °C /CEM43) ermöglichen eine genaue Bestimmung und Quantifizierung der thermischen Dosis. Unser System, das eine Vielzahl von Temperaturen, thermischen Dosen und biologischen Effekten ermöglicht, wurde durch eine Kombination aus kommerziellen Akquisitionen und internen technischen und biologischen Entwicklungen entwickelt. Dieses System wurde so optimiert, dass eine schnelle Umstellung zwischen Ex-vivo-, In-vitro- und In-vivo-Techniken möglich ist. Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie eine effektive Technik und ein System zur Bereitstellung einer reproduzierbaren und genauen magnetischen Nanopartikeltherapie (mNP) Hyperthermie entworfen, entwickelt und implementiert werden können.

In-vitro-Studien Zellen erreichen und halten die gewünschte Temperatur und thermische Dosis nur dann aufrecht, wenn die Menge und Konzentration der magnetischen Nanopartikel / Eisen und der AMF entsprechend abgestimmt sind. Bei der Verwendung von magnetischen Nanopartikeln zur Erwärmung von Zellen in vitro (und in vivo) sollte beachtet werden, dass zur Erzielung einer Hyperthermie in Zellen mit internalisierten magnetischen Nanopartikeln ein bestimmtes Maß an intrazellulärem mNP / Fe erforderlich ist ...

Dieses Protokoll stellt Techniken und Methoden vor, die für die genaue Verabreichung von magnetischer Nanopartikel-Hyperthermie unter Verwendung eines ausgeklügelten Verabreichungs- und Überwachungssystems erforderlich sind.

In-vitro- und In-vivo-Verabreichung von magnetischer Nanopartikel-Hyperthermie mit einem maßgeschneiderten Verabreichungssystem

Hyperthermia has long been used in the treatment of cancer. Techniques have varied from the intra-tumoral insertion of hot iron rods, to systemically ...

Diese Methode ist von Bedeutung, da sie die robusteste und reproduzierbarste Methode zur Behandlung der magnetischen Nanopartikel-Hyperthermie in präklinischen Modellen bietet. Diese Technik ermöglicht die präzise und konsistente Verabreichung von Nanopartikel-Hyperthermie durch genaue Überwachung und Steuerung der lokalen Umgebung, der Tierphysiologie und der thermischen Dosis. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, denken Sie daran, dass das Erhitzen von Nanopartikeln auf das Zielgewebe beschränkt bleiben muss.Es ist wichtig, eine reichlich vorhandene und geeignete Thermometrie zu verwenden, um Reproduzierbarkeit und Sicherheit zu gewährleisten. 24 Stunden nach der Beschichtung fügen murine Melanomzellen B16 F10 magnetische Nanopartikel mit einer Endkonzentration von drei Milligramm Ion pro Milliliter hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Nanopartikel gleichmäßig in der Vertiefung verteilt sind, indem Sie im Voraus eine Stammlösung aus Medien und magnetischen Nanopartikeln herstellen.48 Stunden nach der Zugabe der Nanopartikel fügen Sie 0,5 Milliliter Trypsin zu jeder zu behandelnden Vertiefung hinzu und schwenken Sie die Platte vorsichtig. Überprüfen Sie mit einem Mikroskop, ob sich die Zellen abgelöst haben. Geben Sie dann einen Milliliter Medium in jede Vertiefung und sammeln Sie alle Zellen in 1,5-Milliliter-Röhrchen, wobei Sie für jede Vertiefung ein deutlich beschriftetes separates Röhrchen verwenden.Drehen Sie die Röhrchen zwei bis drei Minuten lang bei 60 G, um die Zellen zu pelletieren. Legen Sie dann die Schläuche in den mit Wasser gefüllten Abstandshalter in der Spule. Stellen Sie die Temperatur des Wasserbades so ein, dass das Medium und die Zellenpalette auf 37 Grad Celsius gehalten werden.Richten Sie separate faseroptische Temperaturfühler ein, um die Temperatur im Rohr und im Wasserbad zu überwachen. Schalten Sie den Kühler ein und prüfen Sie, ob das Kühlmittel durch die Spule fließt. Schalten Sie dann die Stromquelle ein und stellen Sie den Prozentsatz des Maximums auf das gewünschte Feld ein.Betreiben Sie die Magnetspule mit 14 Windungen, die von einem 10-Kilowatt-Generator mit 165 Kilohertz und 23,87 Kiloampere pro Meter gespeist wird. Behandeln Sie die Zellen, bis eine zuvor festgelegte Protokoll-Wärmedosis erreicht ist. Nach der Behandlung werden die pelletierten Zellen wieder in das Medium in den Röhrchen suspendiert und in neue, eindeutig gekennzeichnete Sechs-Well-Platten umgefüllt.Nachdem Sie die Maus betäubt haben, reinigen Sie den Tumor mit einem Alkoholtupfer. Injizieren Sie die magnetischen Nanopartikel drei Stunden vor der AMF-Behandlung in den Tumor. Nach drei Stunden betäuben Sie die Maus erneut und prüfen Sie, ob sie nicht auf die aufrichtenden Reflexe reagiert.Entfernen Sie die Ohrmarke oder andere Metallgegenstände an der Maus und setzen Sie vorsichtig einen geschmierten faseroptischen Temperaturfühler in das Rektum ein. Legen Sie den Katheter in den Tumor. Entfernen Sie die Nadel.Schneiden Sie dann den Katheter so ab, dass er nicht zu sehr aus dem Tumor herausragt. Führen Sie eine faseroptische Temperatursonde mit drei Sensoren in den Katheter ein, die die Sensoren schützt. Kleben Sie die rektale und intratumorale Sonde an den Schwanz des Tieres.Setzen Sie die Maus in ein 50-Milliliter-Röhrchen ein, das in der Nähe des Kopfes ein Loch haben sollte, an das die Anästhesie angeschlossen und abgegeben werden kann. Platzieren Sie den Schlauch in der Spule und schließen Sie die Anästhesie wieder an. Setzen Sie einen faseroptischen Temperaturfühler lose in das Rohr ein, um die Umgebungstemperatur zu messen.Schalten Sie dann den Kühler ein und stellen Sie sicher, dass das Kühlmittel zirkuliert. Vergewissern Sie sich, dass die Computersoftware die verschiedenen Temperaturen anzeigt, und beginnen Sie mit der Aufzeichnung, damit eine CEM43-Berechnung in Echtzeit angezeigt werden kann, bei der die erforderliche CEM43-Dosis zuvor hätte bestimmt werden sollen. Schalten Sie den Magneten bei einem niedrigen Leistungsprozentsatz ein und stellen Sie sicher, dass die faseroptischen Temperaturfühler Temperaturänderungen aufzeichnen.Kurz gesagt, dass die Kerntemperatur des Tieres bei 38 Grad Celsius bleibt und mit dem klimatisierten Luftmantel reguliert wird. Passen Sie die Stärke des Magnetfelds an, indem Sie die Leistung ändern, die das Temperaturniveau im Tumor steuert. Schalten Sie die AMF aus, sobald die gewünschte Dosis erreicht ist.Entfernen Sie den Schlauch von der Spule und entfernen Sie die Maus aus dem Schlauch. Schalten Sie dann den Kühler aus. Ziehen Sie die Sonden und Katheter heraus und markieren Sie das Tier gegebenenfalls mit einer neuen Ohrmarke aus Metall.Überwachen Sie die Maus während der Genesung von der Narkose und stellen Sie sicher, dass sie ihr normales Verhalten wieder aufnimmt und keine Komplikationen auftreten. Für die In-vivo-Hypothermie ist es wichtig, so viele faseroptische Temperaturfühler wie möglich an strategischen Stellen zu platzieren, um die Wirksamkeit und Sicherheitsbewertung in Echtzeit zu gewährleisten. Diese Sonden ermöglichen die Aufzeichnung der Temperatur während des gesamten Experiments, was eine genaue Dosimetrie und einen genauen thermischen Verlauf ermöglicht.Hier werden Kurven gezeigt, die während eines In-vivo-Experiments erstellt wurden, was die Fähigkeit unterstreicht, die Temperatur genau zu überwachen und das System so anzupassen, dass die Tumortemperaturen im gewünschten Bereich gehalten werden. Die Vulkandiagramme zeigen differentiell exprimierte Gene nach einer in vitro und in vivo magnetischen Nanopartikel-Hyperthermiebehandlung und zeigen, wie molekulare Techniken zur Überwachung der Hyperthermieeffekte eingesetzt werden können. Eine genaue Überwachung der Tumortemperaturen, der Kerntemperatur der Tiere und der thermischen Dosis ist für eine konsistente Verabreichung der Behandlung erforderlich.Im Anschluss an die Hyperthermie können verschiedene Analysen durchgeführt werden, um die Wirkung und den Mechanismus der Behandlung zu verstehen. Und andere Therapien können für eine größere therapeutische Wirkung eingesetzt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Nehmen Sie adhärente murine Mikrogliazellen in einer Multiwell-Platte.Geben Sie mit Polyacrylsäure beschichtete magnetische Nanopartikel (MNPs) in die Testvertiefung und lassen Sie eine andere Vertiefung als Kontrolle unbehandelt.Inkubieren Sie die Zellen, um die MNP-Aufnahme über Endozytose zu ermöglichen und ihre Internalisierung zu ermöglichen.Mit Puffer waschen, um ungebundene MNPs zu entfernen.Fügen Sie eine Enzymlösung hinzu, um die Zellen zu lösen.Übertragen Sie die abgelösten Zellen in...

Magnetische Hyperthermie-induzierte Zellschädigung in murinen Mikrogliazellen

Ein MRI-kompatiblen maßgeschneiderten Laserbasis Heizvorrichtung wurde entwickelt, um eine lokale Erwärmung der subkutanen Tumoren um die Freisetzung von Wirkstoffen aus wärmeempfindlichen Liposomen gezielt an der Tumorregion aktivieren bereitzustellen.

Kundenspezifische Laser-basierte Heizvorrichtung zum ausgelöste Freisetzung von Cisplatin von wärmeempfindlichen Liposomen mit Magnet-Resonanz-Bild Anleitung

Dieses Manuskript beschreibt die effiziente, nicht-virale Abgabe von miR-Zellen durch einen PEI / MNP-Vektor und ihre Magnetisierung an Endothelzellen. Somit kann zusätzlich zu genetischer Veränderung, ermöglicht dieser Ansatz für die magnetische Zellführung und MRI Nachweisbarkeit. Die Technik kann verwendet werden, um die Eigenschaften von therapeutischen Zellprodukten zu verbessern.

Vorbereitung und<em&gt; In Vitro</em&gt; Charakterisierung von Magnetized miR-modifizierten Endothelzellen

Dieses Manuskript beschreibt die Herstellung von magnetischen und wärmeempfindlichen Mikrogelen über eine temperaturinduzierte Emulsion ohne chemische Reaktion. Diese empfindlichen Mikrogele wurden durch Mischen von Poly ( N- isopropylacrylamid) (PNIPAAm), Polyethylenimin (PEI) und Fe 3 O 4 -NH 2 Nanopartikeln für die potentielle Verwendung in magnetisch und thermisch getriggerter Arzneimittelfreisetzung synthetisiert.

Magnetisches und thermisch empfindliches Poly (<em&gt; N.</em&gt; -isopropylacrylamid) -basierte Mikrogele für die magnetisch getriggerte kontrollierte Freisetzung

Hier wird ein Protokoll zur Herstellung von Eisenoxid-Nanopartikel-Mikroblasen (NSMs) durch Selbstorganisation, synergisierende magnetische, akustische und optische Reaktionsfähigkeit in einer nanotherapeutischen Plattform für magnetische Hyperthermie und photothermische Kombinationskrebstherapie vorgestellt.

Magnetische, akustische und optische dreifach ansprechende Mikroblasen für magnetische Hyperthermie und pothotothermische Kombinationskrebstherapie

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um kontrollierte Hyperthermie, die durch magnetresonanzgesteuerten, hochintensiven fokussierten Ultraschall erzeugt wird, zu verwenden, um die Wirkstofffreisetzung von temperaturempfindlichen Liposomen in einem Rhabdomyosarkom-Mausmodell auszulösen.

Magnetresonanzgesteuerte, hochintensive, fokussierte, ultraschallerzeugte Hyperthermie: eine praktikable Behandlungsmethode in einem murinen Rhabdomyosarkommodell

Die Blut-Hirn-Schranke ist eine große Hürde bei der Bereitstellung von Therapien für das Glioblastom, eine Krankheit, für die es keine Heilung gibt. Hier berichten wir über eine in vivo bildgesteuerte therapeutische Nanoplattform für Eisenoxid, die diese physiologische Barriere aufgrund ihrer Größe umgehen und sich im Tumor anreichern kann.

Nanopartikel-Verabreichung einer Oligonukleotid-Nutzlast in einem Glioblastom-Multiforme-Tiermodell

Dieses Protokoll stellt Techniken und Methoden vor, die für eine gezielte hyperthermische Therapie in soliden Tumormodellen erforderlich sind. Der Ansatz nutzt die photothermische Umwandlung von Nahinfrarotlicht durch intratumoral injizierte Goldnanostäbchen, um eine lokale Erwärmung innerhalb der Tumormikroumgebung zu induzieren.

Induktion gezielter milder Hyperthermie in murinen Tumormodellen durch photothermische Umwandlung von Nahinfrarotlicht durch intratumorale Gold-Nanostäbchen

Dieser Artikel beschreibt die Kultur der Patientensicherheit Gewebeschnitten für den Gentransfer-Studien und die anschließende Analyse der Genexpression mittels IVIS Biolumineszenz-Bildgebung.

Ex vivo-Kultur der Patient Tissue &amp; Prüfung von Gentransfer

Intramyokardialer Zellabgabe in murinen Modellen von kardiovaskulären Erkrankungen, wie Hypertonie oder Myokardinfarkt, wird häufig verwendet, um das therapeutische Potential von verschiedenen Zelltypen in der Regenerationsstudien getestet. Daher wird eine ausführliche Beschreibung und eine klare Visualisierung dieses chirurgische Verfahren helfen, die Grenzen und Vorteile der Herz-Kreislauf-Zelle therapeutische Analysen in kleinen Nagern zu definieren.

Intramyokardiale Zell Lieferung: Beobachtungen im Herzen Murine

Erfahren Sie die präzise Verabreichung magnetischer Nanopartikel-Hyperthermie in präklinischen Modellen. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Erwärmung von Zielgeweben mit kontinuierlicher Thermometrie für Sicherheit und Dosimetrie.

In-vitro- und In-vivo-Verabreichung von magnetischer Nanopartikel-Hyperthermie mit einem maßgeschneiderten Verabreichungssystem

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