Name: Modellierung der Hepatitis-B-Virusinfektion in nicht-hepatischen 293T-NE-3NRs-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Erfahren Sie die Modellierung von Hepatitis-B-Virusinfektionen in nicht-hepatischen 293T-NE-3NR-Zellen zur Untersuchung extraleberischer HBV-Replikation und Wirtfaktoren. Diese Methode ermöglicht neue Erkenntnisse über HBV-assoziierte Nierenerkrankungen.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81870432 und 81570567 bis X.L.Z.), (Nr. 81571994 bis P.N.S.), Research Fund for International Young Scientists (Nr. 81950410640 bis W.I.) unterstützt. Die Li Ka Shing Shantou University Foundation (Nr. L1111 2008 bis P.N.S.). Wir danken Prof. Stanley Lin vom Shantou University Medical College für ihre sachdienliche Beratung.

Kultur, Sammlung von Überstandstoffen aus HepG2.2.15-Zellen und HBV-Infektion sollte in Biosicherheits-Level II (P2) oder Biosicherheits-Level III (P3) Labor nach der Biosicherheits-Anleitung im Land durchgeführt werden. Die Sicherheitspraktiken im Labor sollten befolgt werden, um die Sicherheit des Laborpersonals zu gewährleisten, und alle sollten geimpft und HBsAb-positiv nachgewiesen werden, bevor HBV-Experimente durchgeführt werden. Beobachten Sie den Zustand der Zellen bei jedem Schritt, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Menschliche Serumproben wurden in Übereinstimmung mit der Genehmigung verwendet, die vom Institutional Review Board des Shantou University Medical College erhalten wurde.
1. HepG2.2.15 Zellkultur
HINWEIS: HepG2.2.15 Zellüberstand, HepG2.2.15 Zellüberstandkonzentrat und alle Spitzen, Kolben, Platten und Schläuche, die in Kontakt mit HepG2.2.15 kommen, sollten entsorgt werden, nachdem sie über Nacht in 2% Viruziden eingeweicht wurden.
<ol><li>Entfernen Sie die Durchstechflasche mit HepG2.2.15-Zellen aus flüssigem Stickstoff und tauen Sie auf, indem Sie die Durchstechflasche in einem 37 °C-Wasserbad sanft wirbeln. HINWEIS: Um die Möglichkeit einer Kontamination zu reduzieren, halten Sie die Kappe aus dem Wasser. Das Auftauen sollte schnell erfolgen (ca. 2 min).</li>
	<li>Entfernen Sie die Durchstechflasche aus dem Wasserbad, sobald die Zellen aufgetaut sind, und desinfizieren Sie sie mit 70% Ethanol. HINWEIS: Führen Sie von diesem Punkt aus alle Schritte unter strengen aseptischen Bedingungen aus.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen in einen 25 cm2 Gewebekulturkolben und fügen Sie 4 ml komplettes Kulturmedium hinzu (DMEM mit 10% FBS, Penicillin 100 U/ml, Streptomycin 0,1 mg/ml). Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5%CO2.</li>
</ol>2. Sammlung von HepG2.2.15 Zellkultur Überstand
<ol><li>Kultur HepG2.2.15 Zelle in T25-Flaschen bei 37 °C, 5%CO2 in einem befeuchteten Inkubator. Ändern Sie das Medium alle 3 Tage.</li>
	<li>Sammeln Sie den Zellüberstand in einem 50 ml Zentrifugenrohr. Schließen Sie den Deckel fest und wickeln Sie ihn mit einem Paraffinfilm.</li>
	<li>Bewahren Sie den HepG2.2.15 Überstand bei -20 °C auf, um das HBV-Virus aktiv zu halten.</li>
</ol>3. Konzentrierender HepG2.2.15 Überstand
<ol><li>HepG2.2.15 Überstand von -20 °C entfernen und bei 4 °C auftauen.</li>
	<li>Um die Zellfragmente zu entfernen, filtern Sie den HepG2.2.15 Überstand mit einer 0,45 m Membran auf ein neues 50 ml Zentrifugenrohr. Blockieren Sie zunächst den Filter, indem Sie 10 ml DMEM mit 10 % FBS filtern, bevor Sie den Virus filtern, und filtern Sie dann den Zellkulturüberstand.</li>
	<li>Fügen Sie 14 ml gefilterten Überstand zu einer Viruskonzentratorsäule hinzu und schließen Sie den Deckel. Zentrifugieren Sie die Säule bei 3.200 x g für 35 min in einer horizontal enkreizten Zentrifuge. Sammeln Sie das HepG2.2.15 Überstandkonzentrat (ca. 200 l) in ein 1,5 ml Rohr.</li>
	<li>Waschen Sie die Säule einmal mit DMEM, indem Sie 200 L DMEM hinzufügen und in ein 1,5 ml-Rohr einsammeln.</li>
</ol>4. Nachweis der HBV-DNA in Überstandkonzentrat
<ol><li>Schalten Sie den Trockenblockheizer ein und stellen Sie die Temperatur auf 100 °C ein.</li>
	<li>Um sicherzustellen, dass die Konzentration der HBV-DNA im HepG2.2.15-Überstandkonzentrat innerhalb des Standardkurvenbereichs liegt, verdünnen Sie das Konzentrat 20-fach, indem Sie 10 l HepG2.2.15 Überstandkonzentrat zu 190 l DMEM in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr hinzufügen. Fügen Sie 200 L HepG2.2.15 Überstand hinzu, Negativkontrolle (HBV-negatives Serum von gesundem Spender), HBV-Positivkontrolle (HBV-positives Serum vom HBV-Patienten) und vier Verdünnungen der im Kit enthaltenen quantitativen Referenzen (2,0 x 106, 2,0 x 105, 2,0 x 104, 2,0 x 103 GEq /ml) bzw. 1,5 ml Mikrozentrifugenröhren zu trennen.</li>
	<li>Fügen Sie 450 l HBV DNA-Extraktionspuffer aus dem Kit zu allen oben genannten acht 1,5 ml-Röhren, Wirbel für 15 s und Spin-down für 10 s. Inkubieren bei 100 °C für 10 min in trockenen Blockheizung. Zentrifuge bei 12.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Fügen Sie den auf Eis platzierten PCR-Röhren 27 L PCR-Master-Mix und 3 l Taq-Polymerase-Enzym hinzu. HINWEIS: Der im Kit enthaltene PCR-Master-Mix enthält die Primer gegen den konservierten Bereich der HBV-DNA.</li>
	<li>Fügen Sie den auf Eis platzierten PCR-Röhren 20 L zentrifugierte übergroße Flüssigkeit hinzu. Decken Sie fest und drehen Sie nach unten für 10 s.</li>
	<li>Verwenden Sie die folgenden Bedingungen auf einer Echtzeit-PCR-Maschine: 93 °C für 2 min, 10 Zyklen von 93 °C für 45 s gefolgt von 55 °C für 60 s; dann 30 Zyklen von 93 °C für 30 s gefolgt von 55 °C für 45 s, um Echtzeit-PCR durchzuführen. HINWEIS: Der Im kommerziellen Kit enthaltene Master-Mix hat Primer gegen die konservierte Region der HBV-DNA.</li>
	<li>Exportieren Sie die erhaltenen Ct-Werte und erzeugen Sie eine Standardkurve, wie in Tabelle 1 und Abbildung 2dargestellt.</li>
	<li>Berechnen Sie auf Basis der Standardkurve die HBV-DNA-Konzentration von HepG2.2.15 Überstandkonzentrat verdünnt 20x, wie in Tabelle 2dargestellt. Berechnen Sie die HBV-DNA-Konzentration von HepG2.2.15 Überstandkonzentrat (Tabelle 2).</li>
	<li>Das HepG2.2.15 Überstandkonzentrat in Aliquots aufteilen und bis zur Verwendung bei -80 °C lagern.</li>
</ol>5. In-vitro-Infektion von HepG2-NE- und 293T-NE-3NRs-Zellen
<ol><li>Bereiten Sie das folgende Infektionsmedium in DMEM/F-12 vor: 10% FBS, 4 mM Glutamin-Ergänzung, 0,1 mM NEAA, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin, 1 g/ml Puromycin, 40 ng/ml Dexamethason, 20 g/ml Hydrocortison und 5 g/ml Insulin. Bei 4 °C lagern. HINWEIS: Diese NTCP-positiven Zellen sind puromycinresistent9.</li>
	<li>Fügen Sie 0,1% Gelatine zu 5 Brunnen von 48 Well-Platte, 200 l zu jedem Brunnen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 2 h, entsorgen Sie den Überstand. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für weitere 2 h.</li>
	<li>Seed HepG2-NE mit einer Dichte von 1 x 104 Zellen in je 2 Brunnen. Samen 293T-NE-3NRs-Zellen mit einer Dichte von 1 x 104 Zellen in jeweils 2 Brunnen (Alltrans-Retinsäure bei 1 mol/L und Clofibricsäure bei 1 mmol/L Endkonzentrationen wurden dem Medium zugesetzt, um die RXR- bzw. PPAR-Kernhormonrezeptoren zu aktivieren). Samen 293T-NE in 1 Brunnen mit einer Dichte von 1 x 104 Zellen. HINWEIS: Durchfluss der Zellen bei Derkonfluss mit 0,25% Trypsin. Zählen Sie die Zellenzahl, und säen Sie die Zellen dann auf eine entsprechende Dichte.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zelle bei 37 °C, 5%CO2 in einem befeuchteten Inkubator für 24 h. Beobachten Sie die Zellen nach 24 h und setzen Sie die Infektion fort, wenn die Zellen gesund sind.</li>
	<li>Bereiten Sie den Infektionskomplex wie in Tabelle 3erwähnt, fügen HBV (HepG2.2.15 Überstand konzentrat), DMSO, PEG8000 und Infektionsmedium bis 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr hinzu. Bereiten Sie den CsA-Bestand vor, indem Sie ihn in DMSO auf eine Konzentration von 5 mM auflösen und den Bestand bei -20 oC halten. Die Arbeitslösung von CsA beträgt 5 m. Samen 1 x 104 Zellen pro Brunnen der 48-Well-Platte. Fügen Sie 100 l HepG2.2.15 Überstandkonzentrat (mit HBV 1.5063 bei 107 GEq/ml) hinzu, um Zellen bei 150 GEq/Zelle zu infizieren.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Brunnen 500 l des Infektionskomplexes hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5 %CO2 im befeuchteten Inkubator für 24 h.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit 500 l PBS, bevor Sie das Medium wechseln. Fügen Sie 1 ml des Mediums in jedem Brunnen hinzu. Wenn der Zellenzustand schlecht ist und einige Zellen schweben, ändern Sie das Medium direkt. Dies ist Tag 1 der Infektion. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage sanft.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen am 11. Tag zweimal mit 500 l PBS und fixieren Sie die Zellen mit eiskaltem Methanol zur Immunfluoreszenz.</li>
</ol>6. HepG2.2.15 Co-Kultur mit HepG2-NE / 293T-NE-3NRs / 293T-NE
<ol><li>1 ml/Gut von 0,1% Gelatine zu 5 Brunnen von 6 Well-Platte hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 2 h und entsorgen Sie den Überstand. Die Platte noch mal für weitere 2 h bei 37 °C bebrüten, um den Brunnen vollständig zu trocknen.</li>
	<li>Samen 1 x 105 Zellen/Brunnen von HepG-NE in 2 Brunnen, 293T-NE-3NRs in 2 Bohrungen und 293T-NE in 1 Bohrgut der Platte. Samen 1 x 105 Zellen/Gut von HepG2.2.15 auf fünf Membraneinsätze (24 mm, 0,4 m Porendurchmesser, unbeschichtet) in einer separaten 6-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5%CO2 in einem befeuchteten Inkubator für 24 h.</li>
	<li>Nach 24 h, wenn die Zellen alle anhaftend und in gutem Zustand sind, bereiten Sie sich auf die Co-Kultur vor. Entsorgen Sie das Medium in den 6-Well-Platten- und Zellmembraneinsätzen. Legen Sie die Membraneinsätze mit HepG2.2.15 in die 6 Wellplatte, die mit HepG-NE, 293T-NE-3NRs und 293T-NE durch Pinzette gesät ist. Inkubieren Sie die Zelle bei 37 °C, 5%CO2 in einem befeuchteten Inkubator, ändern Sie das Medium alle 3-4 Tage. HINWEIS: Stellen Sie Gruppen wie folgt ein: Nun 1: 293T-NE Co-Kultur mit HepG 2.2.15; Gut 2: HepG2-NE Co-Kultur mit HepG 2.2.15; Gut 3: 293T-NE-3NRs Co-Kultur mit HepG2.2.15; Gut 4: HepG2-NE Co-Kultur mit HepG 2.2.15 (CsA hinzufügen); Gut 5: 293T-NE-3NRs Co-Kultur mit HepG2.2.15 (CsA hinzufügen); Fügen Sie das komplette Medium zu gut Nummer 1, 2 und 3 hinzu, fügen Sie das Medium mit 5 'M CsA zu gut 4 und 5 gut hinzu, ca. 9 ml für jeden Brunnen, stellen Sie sicher, dass die Medien in Kontakt sind, damit Viruspartikel von Transwells migrieren, um Zellen zu infizieren.</li>
	<li>Nach 10 Tagen die Membraneinsätze entfernen, PBS auf die 6-Well-Platte geben und zweimal sanft waschen, die Zellen mit eiskaltem Methanol zur Immunfluoreszenz fixieren.</li>
</ol>7. Durchführen der Immunfluoreszenz für HBcAg
<ol><li>Fixieren Sie die Zellen mit eiskaltem Methanol bei -20 °C für mehr als 3 h. Entsorgen Sie das Methanol. Waschen Sie die Zellen mit PBS für 10 min bei Raumtemperatur auf Shaker, wiederholen Sie für 3 Mal.</li>
	<li>5% BSA (100 l/48-Well-Platte, 500 l/6-Well-Platte) hinzufügen, auf horizontalem Shaker für 1 h bei 40 Rpm und Raumtemperatur schütteln.</li>
	<li>Fügen Sie die HBcAg Primärantikörperlösung (Primärantikörper: 5% BSA-Lösung =1:200, 100 l / 48-Well-Platte, 500 l / 6-Well-Platte) hinzu, über Nacht bei 4 °C schütteln.</li>
	<li>Waschen Sie Brunnen mit PBST (PBS mit 0,1% Tween 20), für 10 min bei Raumtemperatur auf Shaker, wiederholen Sie für 3 mal.</li>
	<li>Fügen Sie die zweite Antikörperlösung (594 beschrifteter Antikörper, der in Ziege gegen Kaninchen IgG aufgezogen wird: PBS = 1:1.000, 100 l /48-Well-Platte, 500 l / 6-Well-Platte), bedecken Sie die Platte mit Folie und schütteln Sie für 2 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Dreimal mit PBST waschen, jeweils 10 min schütteln.</li>
	<li>Fügen Sie 1 g/ml DAPI hinzu, schütteln Sie 2 min. Zweimal mit PBST auf einem Shaker für jeweils 5 min waschen. PBST verwerfen. PBS hinzufügen und unter Immunfluoreszenzmikroskop beobachten.</li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization. Global hepatitis report, 2017. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22World+Health+Organization%22">World Health Organization</a>. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2017).</li>
<li>Yoffe, B., Burns, D. K., Bhatt, H. S., Combes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrahepatic+hepatitis+B+virus+DNA+sequences+in+patients+with+acute+hepatitis+B+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection.</a> Hepatology. 12, 187-192 (1990).</li>
<li>Mason, A., Wick, M., White, H., Perrillo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus+replication+in+diverse+cell+types+during+chronic+hepatitis+B+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection.</a> Hepatology. 18, 781-789 (1993).</li>
<li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide+is+a+functional+receptor+for+human+hepatitis+B+and+D+virus%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus.</a> eLife. 1, 00049(2012).</li>
<li>Tang, H., McLachlan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+hepatitis+B+virus+by+nuclear+hormone+receptors+is+a+critical+determinant+of+viral+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 1841-1846 (2001).</li>
<li>Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+hepatitis+B+virus+particles+in+Hep+G2+cells+transfected+with+cloned+hepatitis+B+virus+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 1005-1009 (1987).</li>
<li>Sells, M. A., Zelent, A. Z., Shvartsman, M., Acs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+intermediates+of+hepatitis+B+virus+in+HepG2+cells+that+produce+infectious+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions.</a> Journal of Virology. 62, 2836-2844 (1988).</li>
<li>Watashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporin+A+and+its+analogs+inhibit+hepatitis+B+virus+entry+into+cultured+hepatocytes+through+targeting+a+membrane+transporter%2C+sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide+%28NTCP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP).</a> Hepatology. 59, 1726-1737 (2014).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+host+factors+support+HBV+infection+in+non-hepatic+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defined host factors support HBV infection in non-hepatic 293T cells.</a> Journal of Cell and Molecular Medicine. 24, 2507-2518 (2020).</li>
<li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell-derived+hepatocytes+as+a+model+for+hepatitis+B+virus+infection%2C+spreading+and+virus-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions.</a> Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).</li>
<li>Ortega-Prieto, A. M., Cherry, C., Gunn, H., Dorner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Model+Systems+for+Hepatitis+B+Virus+Research%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">In Vivo Model Systems for Hepatitis B Virus Research.</a> ACS Infectious Diseases. 5, 688-702 (2019).</li>
<li>Liang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B%3A+the+virus+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B: the virus and disease.</a> Hepatology. 49, 13-21 (2009).</li>
<li>Nie, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+of+hepatitis+B+virus-host+interactions+in+liver+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> EBioMedicine. 35, 114-123 (2018).</li>
<li>Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+kidney+organoids%3A+progress+and+remaining+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Human kidney organoids: progress and remaining challenges.</a> Nature Reviews Nephrology. 15, 613-624 (2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Hier führen wir Protokolle für HBV-Infektionen in nicht-hepatischen 293T-NE-3NRs und Hepatom-basierten HepG2-NE-Zellen ein. 293T-NE-3NRs waren sowohl bei hohen als auch niedrigen GEq-Infektionen für HBV-Infektionen geeignet. Bei der Verwendung unseres Protokolls müssen die folgenden kritischen Schritte berücksichtigt werden. Der Zellstatus ist ein wichtiger Faktor für eine erfolgreiche Infektion. Das Infektionsmedium muss rechtzeitig nach der Anfangsperiode der HBV-Infektion gewechselt werden. 293T-NE-3NRs-Zellen sind na...

Hepatitis B betrifft das Leben von mehr als 2 Milliarden Menschen und ist eine der größten Bedrohungen für die öffentliche Gesundheit. Weltweit sind rund 257 Millionen Menschen chronisch mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV) infiziert, was dieGesellschaftschwer belastet 1 . Hepatozyten sind nicht die einzigen Zellen, die von HBV und anderen Zellen in nicht-hepatischem Gewebe infiziert sind, wie Niere und Hoden, sind auch mit diesem Virus infiziert2,3. Derzeit sind HBV-Infektionszellmodelle auf menschliche Hepatozyten mit nur wenigen nicht-hepatischen Zelllinienmodellen beschränkt. Dies behindert die Untersuchung der HBV-Infektion und der HBV-bedingten Pathologie von nicht-hepatischen Geweben. Hier stellen wir Protokolle zur Untersuchung der HBV-Infektion in nicht-hepatischen 293T-Zellen sowie in Häpatom-basierten Zellen vor.
Natriumtaurocholat Co-Transporting Polypeptid (NTCP) ist ein funktioneller Rezeptor für menschliche Hepatitis B und Hepatitis D Virus4. Hepatozyten-Kernfaktor 4 (HNF4), Retinoid-X-Rezeptor (RXR) und Peroxisomen-Proliferator-aktivierter Rezeptor (PPAR) sind leberangereicherte Transkriptionsfaktoren, die den viralen Tropismus von HBV einschränken. Sie wurden verifiziert, um die vorgenomische RNA-Synthese der HBV zu fördern und die HBV-Replikation in einer Nichthäpatom-Zelllinie5zu unterstützen. Wir konstruierten drei verschiedene Zelllinien, HepG2-Zelllinien, die NTCP (HepG2-NE), 293T-Zelllinie exzätsierend NTCP (293T-NE) und 293T Zelllinie, die vier Wirtsgene exizieren; NTCP, HNF4, RXR und PPAR (293T-NE-3NRs). Auf der Grundlage von 293T-NE-3NRs wurden zwei Methoden zur HBV-Infektion entwickelt (Abbildung 1). Die erste Methode verwendet die Impfung in 293T-NE-3NRs mit hoher viraler Genomäquivalenz (hohe GEq (150), DMSO und PEG8000) für 24 h. Die zweite Methode verwendet co-culturing 293T-NE-3NRs mit HepG2.2.15, die HBV-Partikel (niedrige GEq (ca. 1,83) ohne DMSO und PEG8000 produzieren können, wodurch die natürlichen Bedingungen eng nachgeahmt werden.
HepG2.2.15-Zellen werden aus der HepG2-Linie abgeleitet und seiteln chronisch infektiöse HBV sowie subvirale Partikel in das Kulturmedium6,7. Cyclosporin A (CsA) ist ein Immunsuppressivum, das klinisch zur Unterdrückung der Xenograft-Abstoßung verwendet wird. Studien haben gezeigt, dass CsA den HBV-Eintrag in kultivierte Hepatozyten hemmt, indem es die Transporteraktivität von NTCP hemmt und die Bindung von NTCP an große Hüllproteine blockiert8.
HepG2-NE-Zellen wurden als Positivkontrolle verwendet, während CsA-behandelte Zellen als Negativkontrolle verwendet wurden. Im Vergleich zu den positiven und negativen Kontrollgruppen können wir herausfinden, welche Wirtsgene bei der HBV-Infektion eine entscheidende Rolle spielen. Darüber hinaus können wir durch diese Art der HBV-Infektion auch andere neuartige Mechanismen oder Wirtsgene finden, die an einer HBV-Infektion beteiligt sind.

<table><tbody><tr><td>0,45 Mio. Tonnen m Membranfilter</td><td>Millex-HV</td><td>SLHU033RB</td><td>Filter für HepG 2.2.15 Überstand</td></tr><tr><td>293T-NE</td><td>Laborbau</td><td>&mdash; &ndash;</td><td>Zellmodell für HBV-Infektionen</td></tr><tr><td>293T-NE-3NRs</td><td>Bau von Laboratorien</td><td> &ndash;</td><td>Zellmodell für HBV-Infektionen</td></tr><tr><td>594 markierte Ziege gegen Kaninchen IgG</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZF-0516</td><td>Für Immunfluoreszenz-Assay, zweiter Antikörper</td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>BIOFIL</td><td>TCP010006</td><td>Für Co-Kultur</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 ml</td><td>Millipore</td><td>UFC910008</td><td>Für die Konzentration von HepG 2.2.15 Überstand</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Beyotime</td><td>ST023</td><td>Für Immunfluoreszenz-Assay</td></tr><tr><td>Cyclosporin A</td><td>Sangon biotech</td><td>59865-13-3</td><td>Inhibitor der HBV-Infektion</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime</td><td>C1006</td><td>Für die Kernfärbung</td></tr><tr><td>Diagnosekit zur Quantifizierung von Hepatitis-B-Virus-DNA (PCR-Fluoreszenz-Sondierung)</td><td>DAAN GENE</td><td>7265-2013</td><td>Für den HBV-DNA-Nachweis</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>HyClong</td><td>SH30243.01</td><td>Für Kulturmedium</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>Zur Verbesserung der Infektionseffizienz</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>CLARK Bioscience</td><td>FB25015</td><td>Für Kulturmedium</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>ZEISS</td><td>Axio Beobachter Z1</td><td>Für Immunfluoreszenzassay</td></tr><tr><td>HepG2-NE</td><td>Laborbau</td><td>&mdash; &ndash;</td><td>Zellmodell für HBV-Infektionen</td></tr><tr><td>HBcAg-Antikörper</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZA-0121</td><td>Für Immunfluoreszenzassays, Primärantikörper</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZLI-9062</td><td>Für die Zellwäsche</td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Merck</td><td>P8260</td><td>Für Infektionsmedium</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Glutamin</td><td>Thermo Fisher</td><td>10378016</td><td>Für Kulturmedium</td></tr><tr><td>Transwell</td><td>CORNING</td><td>3412</td><td>Für Co-Kultur</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>sigma-Aldrich</td><td>WXBB7485V</td><td>für PBST</td></tr><tr><td>Virkon</td><td>Douban</td><td>6971728840012</td><td>Virusid</td></tr></tbody></table>

modellierung der hepatitis-b-virusinfektion in nicht-hepatischen 293t-ne-3nrs-zellen

Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells

HBV infiziert hauptsächlich menschliche Hepatozyten, aber es wurde auch gefunden, um extrahepatische Gewebe wie Niere und Hoden zu infizieren. Dennoch sind zellbasierte HBV-Modelle auf Hepatom-Zelllinien (wie HepG2 und Huh7) beschränkt, die einen funktionellen HBV-Rezeptor, Natrium-Taurochoat-Co-Transport-Polypeptid (NTCP), überausdrücken. Hier verwendeten wir 293T-NE-3NRs (293T überexpressing human NTCP, HNF4, RXR und PPAR) und HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) als Modellzellenlinien.   Die HBV-Infektion in diesen Zelllinien wurde entweder unter Verwendung konzentrierter HBV-Viruspartikel aus HepG2.2.15 oder durch kokultivierende HepG2.2.15 mit den Zielzelllinien durchgeführt. HBcAg Immunfluoreszenz für HBcAg wurde durchgeführt, um HBV-Infektion zu bestätigen. Die beiden hier vorgestellten Methoden werden uns helfen, HBV-Infektionen in nicht-hepatischen Zelllinien zu untersuchen.

Wir konstruierten pSIN-NTCP-EGFP Plasmid, das NTCP und EGFP Fusion und mit Puromycin-Resistenz ausdrückt. Das Plasmid wurde in HepG2- und 293T-Zellen transfiziert, um stabile Zelllinien HepG2-NE und 293T-NE zu konstruieren, die NTCP und EGFP exzättieren. Plasmide (pSIN-HNF4, pSIN-RXR, pLV-PPAR-puro-flag) mit Puromycinresistenz und Expression wurden in 293T-NE-Zellen transfiziert, um eine stabile Zelllinie zu konstruieren, die 4 Wirtsgene9exektiert. Die Expression von NTCP-EGFP kann durch grüne Flu...

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Hepatitis-B-Virus-Infektion (HBV) in neuartigen 293T-Zellen (293T-NE-3NRs, die menschliche NTCP, HNF4, RXR und PPAR) und traditionelle Leberzellen (HepG2-NE, exzessizierenden menschlichen NTCP) exdrücken.

Modellierung der Hepatitis-B-Virusinfektion in nicht-hepatischen 293T-NE-3NRs-Zellen

HBV mainly infects human hepatocytes, but it has also been found to infect extrahepatic tissues such as kidney and testis. Nonetheless, cell-based HBV ...

Die HBV-Virusreplikation bei der Extrahepatie spielt eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von extrahepatischen Syndromen. Derzeit sind Zellkulturmodelle für den Beginn einer extrahepatischen HBV-Infektion begrenzt. Wir präsentieren ein in vitro nicht-hepatisches Infektionsmodell, um neuartige Wirtsfaktoren zu identifizieren, die die HBV-Replikation beeinflussen, und HBV-bedingte Nierenerkrankungen zu untersuchen.Im Vergleich zu herkömmlichen HBV-Infektionsmodellen haben wir 293T-Zelllinie, 293T-NE-3NR, übernommen und entwickelt und mit HepG2.2.15 kokultiviert. HBV-Infektion sollte in einem Labor der Biosicherheitsstufe zwei oder der Biosicherheitsstufe 3 durchgeführt werden. Die Sicherheitspraktiken im Labor sollten befolgt werden, um die Sicherheit des Laborpersonals zu gewährleisten, und alle Forscher sollten geimpft werden und HBS-Antikörper positiv erkennen, bevor hBV-Experimente durchgeführt werden.Beginnen Sie mit der Kultivierung der HepG2.2.15-Zellen unter Berücksichtigung, dass die Zellüberstand sowie alle Spitzen, Kolben, Platten und Röhren, die in Kontakt mit HepG2.2.15 kommen, sollten in 2%Virucide über Nacht vor der Entsorgung eingeweicht werden. Entfernen Sie die D

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir beschreiben zwei Methoden für die...

Zwei Methoden der Heterokaryon Formation zu entdecken HCV Restriktionsfaktoren

Quelle: Meister, T. L., et al. Ein Zellkulturmodell zur Herstellung von Hepatitis-E-Virus-Stämmen mit hoher Titerkonzentration. J. Vis. Exp. (2020).In diesem Video wird der Prozess der Isolierung von Hepatitis-E-Virus-(HEV-)Partikeln aus transfizierten menschlichen hepatzellulären Karzinomzellen demonstriert. Extrazelluläre Viruspartikel werden aus filtrierten Überständen gewonnen, während intrazelluläre Partikel freigesetzt werden, indem die Zellen wiederholten Gefrier-Tau-Zyklen unterzogen...

Gewinnung von Hepatitis-E-Viruspartikeln aus menschlichen Leberkrebszellen

Das Video zeigt einen Assay, bei dem von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleitete CD8+ T-Zellen verwendet werden, um die Replikation des Hepatitis-B-Virus (HBV) in Mäusen zu hemmen. Diese T-Zellen, die mit HBV-spezifischen Rezeptoren versehen sind, werden in transgene Mäuse übertragen. Replikationskompetente HBV-Genom-Plasmide werden dann direkt in die Leber injiziert und ermöglichen so die Aufnahme viraler DNA. Sobald virale Antigene exprimiert und von hybriden...

Unterdrückung der Hepatitis-B-Virusreplikation mit viralen Antigen-spezifischen T-Zellen

Hepatitis-C-Virus (HCV) ist ein wichtiger menschlicher Krankheitserreger, der Lebererkrankungen, einschließlich Leberzirrhose und Krebs, verursacht. Ein HCV-infektiöses Zellkultursystem ist essentiell, um den molekularen Mechanismus der HCV-Replikation zu verstehen und neue Therapieansätze zu entwickeln. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Untersuchung verschiedener Stadien des HCV-Replikationszyklus.

Ein Protokoll für die Analyse von Hepatitis-C-Virus-Replikation

Die rezellularisierte extrazelluläre Matrix einer dezellularisierten Rattenleber kann als humanisiertes, dreidimensionales ex vivo-Modell verwendet werden, um die Verteilung und Transgenexpression eines Virus oder viralen Vektors zu untersuchen.

Studie von viralen Vektoren in einem dreidimensionalen Modell der Leber neu besiedelt mit dem menschlichen hepatozellulären Karzinom-Zelllinie HepG2

Hier haben wir eine neu entwickelte Hepatitis B-Virus (HBV) Reportersystem beschreiben, die frühen Stadien des HBV-Lebenszyklus zu überwachen. Dieses in vitro System vereinfacht wird in das Screening von anti-HBV - Agenten unterstützen , eine Hochdurchsatz - Strategie.

Entwicklung eines Systems Hepatitis-B-Virus Reporter den frühen Stadien des Replikationszyklus zu überwachen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine schrittweise Anleitung zur 3-d "Leber-on-a-Chip" Infektion mit dem Hepatitis B-Virus Experimente zur Verfügung stellen.

"Leber-on-a-Chip" Kulturen der primäre Hepatozyten und Kupffer Zellen für Hepatitis B-Virus-Infektion

Dieses Verfahren wurde für die Entwicklung fortgeschrittener 3D-Leberkulturen in vitro eingeführt, die eine physiologisch relevantere Bewertung der genotoxischen Gefahren im Zusammenhang mit Nanomaterial-Expositionen sowohl über ein akutes als auch ein langfristiges, wiederholtes Dosisregime ermöglichen können.

Erweiterte 3D-Lebermodelle für In-vitro-Genotoxizitätstests nach langfristiger Nanomaterial-Exposition

Hier wird eine wirksame Methode beschrieben, wie man hohe virale Titerbestände an Hepatitis-E-Viren (HEV) produziert, um Häpatomzellen effizient zu infizieren. Mit der vorgestellten Methode können sowohl nicht umhüllte als auch umhüllte Viruspartikel geerntet und zur Impfung verschiedener Zelllinien verwendet werden.

Ein Zellkulturmodell zur Herstellung von Hepatitis-E-Virus-Beständen mit hohem Titer

Wir präsentieren ein Protokoll zum Screening von Anti-Hepatitis-B-Virus-Verbindungen (HBV), die auf prä- und postvirale Eintrittsphasen abzielen, wobei die isotherme Titrationskalorimetrie verwendet wird, um die Bindungsaffinität (KD) mit dem Wirtsnatriumtaurocholat-Cotransport-Polypeptid zu messen. Die antivirale Wirksamkeit wurde durch die Unterdrückung viraler Lebenszyklusmarker (cccDNA-Bildung, Transkription und virale Assemblierung) bestimmt.

Ein kompetentes Hepatozytenmodell, das den Eintritt von Hepatitis-B-Viren durch Natriumtaurocholat cotransportierendes Polypeptid als therapeutisches Ziel untersucht

Erfahren Sie die Modellierung von Hepatitis-B-Virusinfektionen in nicht-hepatischen 293T-NE-3NR-Zellen zur Untersuchung extraleberischer HBV-Replikation und Wirtfaktoren. Diese Methode ermöglicht neue Erkenntnisse über HBV-assoziierte Nierenerkrankungen.

Modellierung der Hepatitis-B-Virusinfektion in nicht-hepatischen 293T-NE-3NRs-Zellen

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