Name: Plasmodium falciparum Gametozytenkultur und Mückeninfektion durch künstliche Membranfütterung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-03T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Erfahren Sie die Kultivierung infektiöser Gametozyten von Plasmodium falciparum und deren Fütterung an Anopheles-Mücken mittels Membranfütterung. Diese Methode ermöglicht Studien zur Malaria-Übertragungsbiologie und Sporozoiten-Generierung.

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Die Autoren danken Bloomberg Philanthropies für die finanzielle Unterstützung des Johns Hopkins Malaria Research Institute (JHMRI). Diese Arbeit wäre ohne die Expertise der JHMRI-Insekten- und Parasitologie-Kerneinrichtungen nicht möglich gewesen.

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<li>Miura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualification+of+Standard+Membrane-Feeding+Assay+with+Plasmodium+falciparum+Malaria+and+Potential+Improvements+for+Future+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Qualification of Standard Membrane-Feeding Assay with Plasmodium falciparum Malaria and Potential Improvements for Future Assays.</a> PLoS One. 8 (3), 57909(2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die hier beschriebenen Methoden werden am Johns Hopkins Malaria Research Institute seit mehr als 10 Jahren erfolgreich eingesetzt15,16,17,18,19,20,21,22. Gametozyten, die unter Verwendung dieses Protokolls hergestellt wurden, wurden für Gametozytocidal-Assa...

Malaria wird durch Plasmodium-Parasiten verursacht und durch infektiösen Stich weiblicher Anopheles-Mücken auf ihre Wirbeltierwirte übertragen. Laut dem Bericht der Weltgesundheitsorganisation (WHO) von 2019 gab es schätzungsweise 405.000 Todesfälle von insgesamt 228 Millionen Malariafällen1. Die meisten Todesfälle im Zusammenhang mit Malaria konzentrierten sich auf die afrikanische Region, insbesondere auf Kinder unter fünf Jahren. Während die Gesamtinzidenzrate von Malaria seit 2010 weltweit zurückgegangen ist, hat sich der Rückgang in den letzten Jahren stabilisiert und zusätzliche Bekämpfungsstrategien sind dringend erforderlich, um die Krankheit zu eliminieren.
Zyklische asexuelle Blutstadien von Malariaparasiten verursachen Krankheitspathogenese und eine kleine Untergruppe davon differenziert sich in weibliche und männliche Gametozyten. Plasmodium falciparum Gametozyten sind einzigartig in der Natur, da sie 7-10 Tage brauchen, um sich durch fünf morphologisch unterschiedliche Stadien zu entwickeln. Unreife Gametozyten vom Stadium I bis IV werden im Knochenmarkparenchym sequestriert und bleiben im peripheren Kreislauf weitgehend abwesend2,3,4,5. Erythrozyten, die mit Gametozyten im reifen Stadium V infiziert sind, werden im Blutkreislauf freigesetzt und zirkulieren frei, um von Moskitos aufgenommen zu werden. Sobald sie sich im Mückenmitteldarm befinden, werden Gametozyten durch eine Temperaturänderung und Exposition gegenüber der Mitteldarmumgebung aktiviert, verwandeln sich in weibliche und männliche Gameten und beginnen mit der Entwicklung der Mückenstadien, die mit den infektiösen Stadien der Sporozoiten in den Mückenspeicheldrüsen6,7gipfelt .
Da Trager und Jenson8 eine standardisierte Methode zur Kultivierung von P. falciparumbeschrieben haben, sind Studien zu den asexuellen Blutstadien stark fortgeschritten. Das Fehlen eines zuverlässigen Kultursystems für sexuelle Stadien hat es jedoch schwierig gemacht, P. falciparum Gametozyten, Übertragungsbiologie und Mückenstadien zu untersuchen. In den letzten Jahren wurden mehrere Methoden veröffentlicht, die Laboratorien bei der Etablierung von Gametozytenkulturen geholfen haben9,10,11,12. Dieses Manuskript beschreibt ein standardisiertes und zuverlässiges Protokoll zur Kultivierung von P. falciparum-Gametozyten, das eine wertvolle Ressource für die Malaria-Forschungsgemeinschaft darstellen kann. Diese Methode ermöglicht die robuste Produktion von reifen und infektiösen Gametozyten, was zusammen mit einem standardisierten Mückenfütterungsprotokoll zu einer hochzuverlässigen Mückeninfektiosität führt. Diese Methoden wurden etabliert, um eine ununterbrochene Versorgung mit Gametozyten und Parasiten im Mückenstadium aufrechtzuerhalten. In diesem Manuskript beschreiben wir ein gründliches Gametozytenkulturprotokoll (Abbildung 1), die Vorbereitung von Glasmembranfütterern und die Infektion von Moskitos mit diesen Membranfressern (Abbildung 2), die Dissektion des Mitteldarms (Abbildung 3) und der Speicheldrüse von Moskitos (Abbildung 4) und die Quantifizierung der Infektion bei Mücken nach Mitteldarm- und Speicheldrüsendissektion.

<table><tbody><tr><td>10% Zuckerlösung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml serologische Pipette</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konisches Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>1 ml serologische Pipette</td><td>Falcon</td><td>357521</td><td></td></tr><tr><td>25 ml serologische Pipette</td><td>Falcon</td><td>357535</td><td></td></tr><tr><td>37°; C Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml konisches Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>5 ml serologische Pipette</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Gewebekulturplatten</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9" Glaspipette</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Anopheles Mücken</td><td>JHMRI, Insektenkern</td><td></td><td>Wir verwenden A. stephensi oder A. gambiae (Keele)</td></tr><tr><td>Zellzähler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zirkulierendes Wasserbad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette mit feiner Spitze</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>Geimsa Färbung</td><td>Sigma</td><td>GS1L</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Exsikkator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasmembran-Feeder</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG183570</td><td></td></tr><tr><td>Glasobjektträger</td><td>Fisherbrand</td><td>12-552-3</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Menschliches Blut O+</td><td>JHU</td><td></td><td>Erythrozyten dreimal mit RPMI waschen und bei 50% Hämatokrit</td></tr> kühlen <tr><td>Humanserum O+</td><td>Interstate Blutbank</td><td></td><td>Sammeln Sie mindestens 6 Einheiten Serum von verschiedenen Spendern und frieren Sie Aliquots bei -20& ein °C.</td></tr><tr><td>Hypoxanthin</td><td>Sigma</td><td>H9337</td><td>Herstellung 500x Stamm in 1M NaOH</td></tr><tr><td>Mercurochrom</td><td>Sigma</td><td>M7011</td><td>Bereiten Sie eine 1%ige Stammlösung in PBS vor, die bei Bedarf auf 0,1% verdünnt werden kann</td></tr><tr><td>Mikro-Pipettenmikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td></td><td>Jedes Mikroskop mit 10x-, 40x- und 100x-Objektiv funktioniert.</td></tr><tr><td>Moskitobecher</td><td>Neptunbecher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylglucosamin</td><td>Sigma</td><td>A3286</td><td>Optional und nur erforderlich, wenn reine Gametozyten benötigt werden.</td></tr><tr><td>Netz:</td><td></td><td></td><td>Stellen Sie sicher, dass es Mücken eindämmen kann und Blut zuführen</td></tr> kann <tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Thermo Scientific</td><td>249964</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmodium falciparum NF54</td><td>BEI Resources</td><td>MRA-1000</td><td>Frieren Sie eine große Anzahl von Frühpassagekulturen ein, um sicherzustellen, dass Sie eine konstante Versorgung haben</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>CV-041-CV</td><td>Medien enthalten Glutamin und HEPES</td></tr><tr><td>Objektträgerwärmer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td>Optional für Medien, nur bei Verwendung von Malariagasmischung während der Kulturinkubation</td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td></td> hinzufügen<td></td><td></td></tr><tr><td>Xanthurensäure</td><td>Sigma</td><td>D120804</td><td>Für Flagellationsmedien</td></tr></tbody></table>

plasmodium falciparum gametozytenkultur und mückeninfektion durch künstliche membranfütterung

Plasmodium falciparum Gametocyte Culture and Mosquito Infection Through Artificial Membrane Feeding

Malaria ist nach wie vor eines der wichtigsten Probleme der öffentlichen Gesundheit und verursacht eine erhebliche Morbidität und Mortalität. Malaria ist eine durch Mücken übertragene Krankheit, die durch einen infektiösen Stich von der weiblichen Anopheles-Mücke übertragen wird. Die Malariabekämpfung wird sich schließlich auf eine Vielzahl von Ansätzen stützen, darunter Möglichkeiten, die Übertragung zu, durch und von Moskitos zu blockieren. Um Mückenstadien von Malariaparasiten im Labor zu untersuchen, haben wir ein Protokoll zur Kultivierung hochinfektiöser Plasmodium falciparum-Gametozyten optimiert, einem Parasitenstadium, das für die Übertragung vom menschlichen Wirt auf den Mückenvektor erforderlich ist. P. falciparum Gametozyten reifen durch fünf morphologisch unterschiedliche Schritte, was etwa 1-2 Wochen dauert. Die in diesem Protokoll beschriebene Gametozytenkultur wird in 15 Tagen abgeschlossen und ist ab den Tagen 15-18 für Moskitos infektiös. Diese Protokolle wurden entwickelt, um einen kontinuierlichen Zyklus von infektionskompetenten Gametozyten aufrechtzuerhalten und eine ununterbrochene Versorgung mit Mückenstadien des Parasiten aufrechtzuerhalten. Hier beschreiben wir die Methodik der Gametozytenkultur und wie man Moskitos mit diesen Parasiten mit Glasmembran-Feedern infiziert.

Hier präsentieren wir Ergebnisse aus einer Reihe von Membranfuttermitteln unter Verwendung von P. falciparum NF54-Gametozytenkulturen, die mit dem obigen Protokoll erzeugt wurden (siehe Abbildung5). Die Gametozytenkultur wurde mit etwa 0,5% asexueller Kultur im Mischstadium an Tag 0 begonnen, die bis Tag 4 und Tag 5 zu einer maximalen Parasitemie von etwa 15% anwuchs. Wie in Abbildung 5A bei dieser hohen Parasitämie gezeigt, werden die Parasiten gestres...

Detaillierte Untersuchungen an Mückenstadien von Malariaparasiten sind entscheidend, um wirksame Strategien zur Blockierung der Übertragung zu entwickeln. Dieses Protokoll zeigt, wie man infektiöse Gametozyten effektiv kultiviert und diese Gametozyten dann an Moskitos verfüttert, um Mückenstadien von P. falciparumzu erzeugen.

Plasmodium falciparum Gametozytenkultur und Mückeninfektion durch künstliche Membranfütterung

Malaria remains one of the most important public health problems, causing significant morbidity and mortality. Malaria is a mosquito borne disease ...

Gametozyten sind für die Übertragung von Malariaparasiten verantwortlich. Die Erzeugung infektiöser Gametozyten im Labor ist der Schlüssel zur Untersuchung der Übertragungsbiologie in Mückenstadien und zur Erzeugung von Sporozoiten für spätere Ergebnisse. Diese Methoden sind für jedes Labor einfach zu übernehmen, und eine visuelle Demonstration wird dazu beitragen, diese Verfahren mit der weltweiten Malaria-Gemeinschaft zu teilen.Meine Kollegen Godfree Mlambo, unser leitender wissenschaftlicher Mitarbeiter, und Sachie Kanatani, unser Postdoktorand, beide vom Johns Hopkins Malaria Research Institute, werden das Verfahren mit mir demonstrieren. Um eine Gametozytenkultur einzurichten, schleudern Sie fünf Milliliter der Feederkultur in einer Zentrifuge herunter und suspendieren Sie das Pellet in 30 Millilitern vollständigem Medium wieder. Mischen Sie 1,2 Milliliter verpackter roter Blutkörperchen mit dem Röhrcheninhalt und geben Sie fünf Milliliter der resultierenden Suspension in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Kulturplatte.Stelle den Teller dann bei 37 Grad Celsius in ein Kerzenglas. In den nächsten 15 bis 18 Tagen werden täglich 70 bis 80 % des Kulturüberstands aus jeder Vertiefung

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Sobald ein Gen als potentiell feuerfesten für die Dengue-Virus identifiziert ist, muss er für seine Rolle bei der Verhinderung virale Infektionen innerhalb der Mücke ausgewertet werden. Dieses Protokoll zeigt, wie das Ausmaß der Dengue-Infektionen von Mücken getestet werden kann. Die Techniken für den Anbau bis das Virus in Kultur-, Membran-Fütterung Moskitos menschlichem Blut und Testen von viralen Titer in der Mücke Mitteldarm demonstriert.

Protokoll für Dengue-Infektionen in Mücken (Aedes aegypti) und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung

Sobald ein Gen als potentiell feuerfesten für Malaria identifiziert wird, muss er für seine Rolle bei der Verhinderung Plasmodium-Infektionen innerhalb der Mücke ausgewertet werden. Dieses Protokoll zeigt, wie das Ausmaß der Plasmodium-Infektionen von Mücken getestet werden kann. Die Techniken für die Vorbereitung der gametocyte Kultur-, Membran-Fütterung Moskitos menschlichem Blut und Testen von viralen Titer in der Mücke Mitteldarm demonstriert.

Protokoll für Plasmodium falciparum-Infektionen in Mücken und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung

Dieses Video zeigt die Erstellung eines experimentellen Mausmodells für zerebrale Malaria. Sporozoiten, die aus mit Plasmodium berghei infizierten weiblichen Mücken isoliert wurden, werden in die Schwanzvenen einer gefesselten Maus injiziert, was zu einer Störung der Blut-Hirn-Schranke und einer Gehirnentzündung führt, die zerebrale Malaria verursacht. Dieses infizierte Mausmodell bietet ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der mikrovaskulären Pathologie in vivo im Zusammenhang mit...

Generierung eines Mausmodells für experimentelle zerebrale Malaria unter Verwendung von Sporozoiten aus der Wirtsmücke

Tuberkulose und Malaria sind zwei der häufigsten Infektionen bei Menschen und die Hauptursachen für Morbidität und Mortalität bei der verarmten Bevölkerung in den Tropen. Wir gründeten eine experimentelle Modellsystem, um Ergebnisse der Malaria-Tuberkulose-Koinfektion bei Mäusen nach der Infektion mit beiden Erregern über ihre natürlichen Infektionsweg zu studieren.

Eine experimentelle Modell zum Studium Tuberkulose-Koinfektion auf Natur Malaria Übertragung von Mycobacterium tuberculosis Und Plasmodium berghei</i

Wir beschreiben ein Mausmodell der experimentellen zerebralen Malaria und zeigen, wie entzündliche und mikrovaskuläre Pathologien in vivo mit Hilfe der Magnetresonanztomographie verfolgt werden können.

In vivo Verfolgung von Ödementwicklung und mikrovaskulärer Pathologie in einem Modell der experimentellen zerebralen Malaria mit Magnetresonanztomographie

Aufgrund der auffälligen Ähnlichkeiten des Lebenszyklus und der Biologie von Nagetier-Malariaparasiten mit menschlichen Malariaparasiten sind Nagetier-Malariamodelle für die Malariaforschung unverzichtbar geworden. Hierbei haben wir einige der wichtigsten Techniken standardisiert, die bei der phänotypischen Analyse von wildflebenden und transgenen Nagetier-Malaria-Arten verwendet werden.

Phänotypische Analyse von Nagetier Malaria Parasiten Asexual und Sexuelle Blutstadien und Mückenstadien

Der Standard Membrane Feeding Assay (SMFA) gilt als Goldstandard für die Bewertung und Identifizierung potenzieller Malariamittel. Dieses künstliche Fütterungssystem wird verwendet, um Moskitos zu infizieren, um die Auswirkungen solcher Verbindungen auf die Intensität und Prävalenz des Parasiten Plasmodium falciparum weiter zu bewerten.

Standard-Membran-Fütterungstest zum Nachweis von Plasmodium falciparum-Infektionen in Anopheles-Mückenvektoren

Hier beschreiben wir eine neue Methode, um die Mechanismen der zellulären Immunität gegen Plasmodien während der Blutphase der Infektion aufzuklären. Dabei handelt es sich um einen In-vitro-Assay , der die Abtötung infizierter roter Blutkörperchen durch zytotoxische Lymphozyten misst.

In vitro Untersuchung der Abtötung von Plasmodium-infizierten roten Blutkörperchen durch zytotoxische Lymphozyten

Malaria wird durch Inokulation des Sporozoitenstadiums von Plasmodium durch infizierte Stechmücken übertragen. Transgenes Plasmodium hat es uns ermöglicht, die Biologie der Malaria besser zu verstehen und hat direkt zur Entwicklung von Malaria-Impfstoffen beigetragen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine optimierte Methodik zur Generierung transgener Plasmodium berghei-Sporozoite.

Gentechnisch veränderte Plasmodium berghei Sporozoiten

Die chemische Genetik beinhaltet die Substitution eines Gatekeeper-Rests durch eine Aminosäure, die eine andere Seitenkette am Zielort enthält. In dieser Arbeit haben wir einen mutierten Parasiten generiert, der ein hypomorphes Allel von cdpk1 enthält, und kompensatorische Signalwege identifiziert, die der Parasit im mutierten Hintergrund einnimmt.

Verständnis der Entwicklung von Kompensationswegen in einem mutierten Malariaparasiten mit hypomorphem Allel pflanzenähnlicher Kinasen

Die sexuelle Entwicklung des Plasmodiums findet im Mitteldarm der Mücke statt. Die sexuellen Stadien des Parasiten ins Visier zu nehmen, ist eine vielversprechende Strategie, um die Übertragung zu blockieren. Wir haben Ookluc entwickelt, eine transgene P. berghei, die nach der Zygotenbildung Nanoluziferase exprimiert und ein Hochdurchsatz-Screening von transmissionsblockierenden Verbindungen ermöglicht. In diesem Artikel werden die Methoden für das Screening mit Ookluc beschrieben.

Ookluc: Eine Plasmodium berghei-Linie zur Identifizierung von transmissionsblockierenden Verbindungen

Erfahren Sie die Kultivierung infektiöser Gametozyten von Plasmodium falciparum und deren Fütterung an Anopheles-Mücken mittels Membranfütterung. Diese Methode ermöglicht Studien zur Malaria-Übertragungsbiologie und Sporozoiten-Generierung.

Plasmodium falciparum Gametozytenkultur und Mückeninfektion durch künstliche Membranfütterung

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