Name: Quantifizierung des Tollwutvirus in verschiedenen Rinderhirnstrukturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Lernen Sie eine qRT-PCR-basierte Methode zur Quantifizierung des Tollwutvirus-N-Gens in verschiedenen Rinderhirnstrukturen. Dieses Protokoll ermöglicht die zuverlässige Detektion niedriger Viruslasten für die Forschung.

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Diese Arbeit wurde vom National Institute of Agricultural, Forestry, and Livestock Research (INIFAP) unterstützt. Wir danken Jerzayn Fraustro Esquivel für seine Mitarbeit bei der Entwicklung des Videos, das mit diesem Dokument verbunden ist.

Diese Studie wurde von den Empfehlungen des Institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -verwendung (IACUC) des Centro Nacional de Investigacion Disciplinaria en Microbiologa Animal (CENID-MA) genehmigt und in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen für die Verwendung von Tieren durchgeführt.
1. Proben
<ol><li>Verwenden Sie verschiedene Bereiche des Gehirns, die von 6 verschiedenen tollwut-positiven Rinderhirnen für die RT-PCR-Analyse seziert wurden.</li>
</ol>2. Direkte fluoreszierende Antikörper (DFA) zur Bestätigung von Tollwut
HINWEIS: Der Nachweis des Tollwutantigens durch DFA ist eine qualitative Methode zur Bestimmung des Vorhandenseins des Tollwutnucleoproteins mit fluorescein-markierten Antikörpern. Der Test wurde mit dem Von Dean et al. (1966)20bereitgestellten Protokoll durchgeführt, wie unten beschrieben.
<ol><li>Machen Sie zwei Eindrücke von jedem Gewebe, das von verschiedenen Gehirnstrukturen auf einem sterilen Dia von ca. 15 mm Durchmesser seziert wird. Verwenden Sie einen Holzapplikator, um einen ca. 3 mm3 Teil des Gewebes auf den sterilen Schlitten zu schmieren. Um den Abstrich zu erstellen, drücken Sie den Holzapplikator vorsichtig manuell gegen die Folie.</li>
	<li>Befestigen Sie die Probenabstriche, indem Sie die Dias in 100% Aceton für 1 h bei -20 °C tauchen. Nach der Inkubation die Schlitten auf einem trockenen Tuch bei 21 °C 30 min trocknen.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Gehirn 50 l des fluorescein-markierten Anti-Nukleoprotein-Antikörpers bei einer Verdünnung von 1:10 durch Abgabe durch eine Spritze hinzu.</li>
	<li>Die Dias mit dem Konjugat in einer feuchten Kammer bei 37 °C für 1 h inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Dias nach der Inkubation zweimal mit Wasser und mit PBS, um überschüssiges Konjugat zu vermeiden. Lassen Sie die Dias bei 21 °C trocknen. Sorgfältig ausbluten, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und dann kurz lufttrocken vor der Montage.</li>
	<li>Fügen Sie einen Tropfen von 50% Phosphatglycerin, um die Oberfläche des Abschnitts zu decken, und dann mit einem Deckelbedeckung abdecken. Beobachten Sie die Abschnitte unter einem Epifluoreszenzmikroskop bei 40-facher Vergrößerung.<ol>
<li>Prozess und beobachten Sie die positiven und negativen Kontrollen (positive Kontrolle: Mausgehirne mit RABV geimpft; negative Kontrollen: RABV-negative Rindergehirne) in der gleichen Weise wie die Proben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Generierung von Positivsteuerung für RT-PCR
<ol><li>Erhalten Sie BHK-21-Zellen von der Keimplasmabank. Verwenden Sie Zellen bis zum70. Durchgang, um den RABV Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA)-Stamm mit Durchgang 2 zu replizieren.</li>
	<li>BhK-21-Zellen in Flaschen pflegen und vermehren, die ein minimales wesentliches Medium (MEM) enthalten, ergänzt durch 10% fetales Kalbsserum (FCS) bei 37 °C in Gegenwart vonCO2 (5%) und unter feuchten Bedingungen. Wachsen Sie die Zellen in 25cm2 Kulturkolben, bis sie 80% Zusammenfluss und dann Subkultur erreichen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Kulturmedium aus den Zellen und waschen Sie die Flasche mit Phosphatgepufferter Saline (PBS). Impfen Sie die Kultur mit 105 TCID/ml des RABV-Stamms ERA. Inkubieren Sie das virale Inokulum für 2 h unter ständigem Schütteln bei 37 °C in Gegenwart von CO2 (5%) und unter feuchten Bedingungen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Infektionsmedium und fügen Sie MEM mit 5% (Serum fetale Rinder) SFB ergänzt. Inkubieren für 72 h bei 37 °C in Gegenwart von CO2 (5%) unter feuchten Bedingungen.</li>
	<li>Ernte RABV 3 Tage nach der Impfung, wenn die Zellen zytopathische Effekte aufweisen. Die infizierten Zellen einfrieren und dann bei 4 °C auftauen, um die Zellen zu lysieren. Das Medium aus der Flasche sammeln und die Zellen dann bei 10 min bei 4 °C in ein Zentrifugenrohr für zentrifugieren.</li>
	<li>Die Überräube von RABV bei -80 °C lagern und Arbeitsaliquots für die Lagerung bei -70 °C vorbereiten.</li>
	<li>Intracerebal impfen Sie das Virus, das im vorherigen Schritt in 21 Tage alte weibliche CD1-Mäuse erhalten wurde. Verwenden Sie eine 1 ml Spritze, um 50 l Lösungen mit 106 MICLD50 (Maus-infektiöse Kultur tödliche Dosis 50%) zu impfen Dosen in Mäuse22.</li>
</ol>4. RNA-Extraktion
HINWEIS: Die gesamte RNA wurde direkt aus Rinderhirnen mit einer organischen Extraktionsmethode gemäß folgendem Protokoll extrahiert.
<ol><li>Verwenden Sie 100 mg Hirngewebe aus jeder anatomischen Struktur, um die gesamte RNA mit einem kommerziell erhältlichen Reagenz zu extrahieren, das Guanidiumisothiocyanat enthält.</li>
	<li>Manuelle Homogenisierung von insgesamt 100 mg Gewebe aus jeder Struktur in 1 ml des Guanidium isothiocyanat reageimeimmittel durch Wirbeln mit einem Dounce Homogenisatmit mit einem kleinen Stößel im Mikrorohr für 15 s bei maximaler Geschwindigkeit.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Proben auf Eis für 5 min, und fügen Sie dann 200 l Chloroform hinzu. Die Proben 15 s kräftig mischen, 2 bis 3 min auf Eis brüten und dann bei 12.000 x g 15 min bei 4 °C zentrifugieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die wässrige Phase auf ein sauberes Rohr und fügen Sie 500 l Isopropylalkohol hinzu. Inkubieren Sie die Proben für 15 min bei 21 °C.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den wässrigen Überstand durch Pipettieren. Die isolierte RNA wird als Pellet in der Röhre vorhanden sein.</li>
	<li>Als nächstes waschen Sie das RNA-Pellet mit 1 ml 75% Ethanol durch Pipettieren und Zentrifugen bei 7500 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Den Überstand dekantieren und das RNA-Pellet bei Raumtemperatur (21 °C) lufttrocknen. Anschließend das Pellet in 50 l nukleasefreiem Wasser verdünnen.</li>
	<li>Bestimmen Sie die RNA-Konzentration und -Qualität bei 260 nm mit einem Spektralphotometer. RNA bis zur Anwendung bei -80 °C lagern.</li>
	<li>Entfernen Sie DNA aus RNA-Proben durch Verdauung mit DNase I. Fügen Sie 2 U DNase I pro 1 g RNA hinzu, die im vorherigen Schritt extrahiert wurde. Als nächstes fügen Sie 5 l des 10-fachen Reaktionspuffers hinzu und inkubieren Sie dann 30 min bei 37 °C. Inaktivieren Sie die DNase I, indem Sie dem Gemisch 1 L EDTA hinzufügen, gefolgt von einer Inkubation für 10 min bei 65 °C.</li>
</ol>5. cDNA-Synthese und PCR
<ol><li>Synthetisieren Sie die cDNA des ersten Strangs mit Oligo dT und Reverse-Transkriptase. Fügen Sie für jede 1 g RNA 1 l Oligo-DT (500 g/ml), 1 l 10 mM dNTP-Mix und nukleasefreies destilliertes Wasser zu einem Endvolumen von 12 l hinzu. Inkubieren Sie die Mischung bei 65 °C für 5 min.</li>
	<li>Kühlen Sie das Reaktionsgemisch auf 4 °C. Zentrifugieren Sie das Rohr für 30 s bei 1.050 x g,und fügen Sie dann 4 l Reaktionspuffer, 2 l 0,1 M DTT und 1 l Ribonuklease-Inhibitor (40 U/L) hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch bei 37 °C für 2 min, und fügen Sie dann 1 l Reverse-Transkriptase (200 U) hinzu. Anschließend das Reaktionsgemisch 50 min bei 37 °C inkubieren und dann die Reaktion bei 70 °C für 15 min inaktivieren.</li>
	<li>Bewahren Sie die cDNA vor der Anwendung bei -20 °C auf. ANMERKUNG: Um die Qualität der synthetisierten cDNA zu überprüfen, führen Sie die Amplifikation eines 761 bp-Fragments des RABV N-Gens durch, bevor Sie die Synthese in vitro durchführen. Verwenden Sie das von Loza-Rubio et al.11 beschriebene Protokoll, wie in Schritt 5.5 unten beschrieben.</li>
	<li>PCR mit Taq DNA-Polymerase unter den folgenden Bedingungen durchführen. Führen Sie die Reaktion wie folgt aus: 10x Taq-Puffer mit 20 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 1 U Taq Polymerase, 10 m jeder Grundierung (SuEli+: 5" cgtrgaycaatatgagtaca 3" und SuEli-: 5" caggctcraacattcttcttctta 3'), 2,5 l cDNA und Reinstwasser bis zu einem Endvolumen von 50 l.</li>
	<li>Führen Sie die Amplifikation in einem Thermocycler unter folgenden Fahrradbedingungen durch: 95 °C für 3 min; 35 Zyklen von 95 °C für 30 s, 60 °C für 30 s und 72 °C für 1 min; einen Zyklus von 72 °C für 7 min.</li>
	<li>Bewerten Sie das Vorhandensein der 761 bp PCR-Produkte mit einem 1% Agarose-Gel.</li>
</ol>6. In-vitro-Transkription
HINWEIS: In-vitro-Transkription erzeugt mRNA eines Zielgens. Verwenden Sie ein Primer-Paar, das das gesamte RABV N-Gen verstärkt und das als Positivkontrolle für den qRT-PCR-Assay verwendet wird. Diese Primer wurden entwickelt, um das gesamte RABV N-Gen zu verstärken und einen Promotor hinzuzufügen, der die T7-Polymerase (TAATACGACTCACTATAG) erkennt.
<ol><li>Um das gesamte N-Gen RABV zu verstärken, verwenden Sie die Primer Trans-Nrab vorwärts (5ʹ gatgagtcactcgaatatctt 3ʹ) und umgekehrt (5ʹ caataatacgactactatagggatggatgccgacaagatt 3ʹ) und ein High-Fidelity PCR-Kit.<ol>
<li>Bereiten Sie für jede Reaktion einen PCR-Master-Mix vor, indem Sie einen sauberen PCR-Rohrreaktionspuffer 10x, 2 mM DMSO, 25 mM MgCl2, 10 mM dNTPs, 10 m M jeder Grundierung, 0,5 U Hochtreuepolymerase, 1,5 l cDNA (in Schritt 5) und Reinstwasser auf ein Endvolumen von 50 l hinzufügen.</li>
		<li>Verwenden Sie einen Thermocycler,der die folgenden Bedingungen für die Amplifikation ansetzt: 94 °C für 1 min; 4 Zyklen von 94 °C für 1 min, 40 °C für 1 min und 72 °C für 2 min; 35 Zyklen von 94 °C für 1 min, 60 °C für 1 min und 72 °C für 2 min; Endverlängerung von 72 °C für 2 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Das PCR-Produkt als Vorlage für die In-vitro-Synthese zu verwenden und Komponenten der enzymatischen Reaktion aus Schritt 6.1.2 zu entfernen, das PCR-Produkt mit einem säulenbasierten Konzentrator-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu reinigen und dann mit einem Spektralphotometer zu quantifizieren.</li>
	<li>Für die RNA-Synthese verwenden Sie ein In-vitro-Transkriptionskit mit folgendem Reaktionsgemisch: 5 l T7 Transkription 5x Puffer, 1,9 l jedes Triphosphat-Nukleotids, 10 g gereinigte RABV N-DNA-VP2-DNA und 2,5 l des Enzymgemischs. Als nächstes die Mischung bei 37 °C für 4 h inkubieren. Dann fügen Sie dem Reaktionsgemisch 1 L von 1 U/g RNase-freie DNase hinzu und brüten 15 min bei 37 °C, um die DNA-Kontamination zu beseitigen.</li>
	<li>Reinigen Sie die in vitro transkribierte RNA und konzentrieren Sie sie dann mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1).</li>
	<li>Setzen Sie das gereinigte RNA-Pellet in 70 l TE-Puffer aus, und lagern Sie es dann bei -80 °C bis zur Verwendung.</li>
	<li>Wiederholen Sie das PCR-Protokoll von Schritt 6.1 bis ca. 5 g PCR-Produkt erhalten ist. Nach der Reinigung und Konzentration wird das in vitro transkribierte N-Gen mRNA in einer Konzentration von 4,711 g/l vorliegen.</li>
	<li>Bestätigen Sie, dass die in vitro transkribierte mRNA dem N-Gen nach Schritt 5 dieses Protokolls entspricht, und verwenden Sie diese als positive Kontrolle für die Echtzeit-Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR).</li>
</ol>7. Echtzeit-Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR)
<ol><li>Verwenden Sie für qRT-PCR ein in vitro mRNA-Transkript, das das gesamte N-Gen als positive Kontrolle kodiert, zusammen mit einem kommerziellen einstufigen qRT-PCR-Kit mit Hybridisierungssonden gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie die von Carneiro et al. beschriebene Sonde und Primer. (2010)23 zum Nachweis einer konservierten Region des RABV-Gens N (BRDesrot-Rev: 5" aaactcaagagaaggccacaacca 3, BRDesrot-Fwd: 5" cgtactgatgtggaagggaattg 3" und BRDesrot-Probe: 5-FAM-acaagaccctctgtttcagagcatgc-3-BHQ).</li>
	<li>Verwenden Sie die folgenden thermischen Radfahrbedingungen: 1 Zyklus von 50 °C für 10 min und 95 °C für 2 min; 40 Zyklen von 95 °C für 15 s und 50 °C für 30 s.</li>
</ol>8. Kalibrierkurve oder Standardkurve
<ol><li>Führen Sie serielle Verdünnungen der in vitro transkribierten mRNA durch serielle Pipettierung von 1 g/l mRNA in Dier durch, bis sechs Dekuperlutionen erhalten sind. Bereiten Sie Rohre mit einem Volumen von 100 l in dreifacher Ausfertigung für die Erstellung der Standardkurve vor. Führen Sie qRT-PCR wie in Schritt 7 beschrieben durch.</li>
	<li>Führen Sie qRT-PCR in einem Thermocycler mit einem Rotor durch, indem Sie die verschiedenen Gehirnproben gleichzeitig mit den laufenden Reaktionen verarbeiten, um die Standardkurve zu erstellen und positive Steuerungen, Negativkontrollen und überzählige Stoffe zu verwenden, die aus der Zellkultur isoliert sind.</li>
	<li>Um die Nachweisgrenze, die Testwirksamkeit und die Empfindlichkeit des Tests zu bewerten, verwenden Sie eine Standardkurve in Dreifacharbeit unter den gleichen Bedingungen.</li>
</ol>9. qRT-PCR biologischer Proben
<ol><li>Verwenden Sie für den Nachweis des RABV-Gens N die RNA aus Feldproben, Positivkontrollen, Negativkontrollen und Zellkulturübersprechern, um qRT-PCR mit dem in Schritt 7 beschriebenen PCR-Kit durchzuführen.</li>
	<li>Um die Anzahl der Kopien des RABV-Genoms in den Rinderhirnproben zu bestimmen, erhalten Sie Ct-Daten aus der Standardkurve und biologischen Proben sowie aus den interpolierten aus der Kalibrierkurvengleichung.</li>
</ol>

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<li>Finke, S., Cox, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+transcription+attenuation+of+rabies+virus+genes+by+intergenic+regions%3A+generation+of+recombinant+viruses+overexpressing+the+polymerase+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Differential transcription attenuation of rabies virus genes by intergenic regions: generation of recombinant viruses overexpressing the polymerase gene.</a> Journal of Virology. 74 (16), 7261-7269 (2000).</li>
<li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFooks%2C+AR+%22Rabies%22">Rabies</a>. 3, Macmillan Publishing Limited. 1-18 (2017).</li>
<li>Bingham, J., Van Der, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+rabies+antigen+in+infected+brain+material%3A+determining+the+reliability+of+different+regions+of+the+brain+for+the+rabies+fluorescent+antibody+test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Distribution of rabies antigen in infected brain material: determining the reliability of different regions of the brain for the rabies fluorescent antibody test.</a> Journal Virological Methods. 101 (1-2), 85-94 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Frühere Studien haben gezeigt, dass DFA RABV nur innerhalb von sieben Tagen nach der Lagerung der Probe bei Raumtemperatur (21 °C)14erkennen kann. Im Gegensatz dazu zeigte diese Arbeit, dass die Empfindlichkeit von RT-PCR abnimmt, nachdem die Proben 12 Tage lang der Raumtemperatur ausgesetzt waren. Daher kann das RABV-Genom mit qRT-PCR in Proben nachgewiesen werden, die bis zu 23 Tage raumtemperaturexponiert sind. Dies zeigt, dass die Empfindlichkeit von qRT-PCR bei stärker zersetzten Proben relat...

Tollwut kann ante-mortem und post-mortem durch verschiedene Techniken bestätigt werden, die den Nachweis von viralen Nukleinsäuren im Gehirn, Haut, Urin oder Speichel ermöglichen1. Der Nachweis des Tollwutvirus-Nukleoprotein (N) Wird vor allem für die Tollwutdiagnose durch molekulare Tests verwendet. Dieses Gen wird auch für die virale Genotypisierung verwendet. Tollwut kann bei Tieren mit jedem Teil des betroffenen Gehirns diagnostiziert werden; Um jedoch die Möglichkeit von Tollwut auszuschließen, muss Gewebe aus mindestens zwei Regionen im Gehirn getestet werden2. Es gibt mehrere diagnostische Methoden für den Tollwutnachweis bei Tieren; der direkte Immunfluoreszenztest bleibt jedoch die Standard-Referenztechnik3. Andere Tests umfassen biologische Tests, die Maus-Impfung, Infektion in der Gewebekultur und Polymerase-Kettenreaktion (PCR)4. Alle diese Techniken werden von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) und der Weltorganisation für Tiergesundheit (OIE) zur Diagnose von Tollwut bei Mensch und Tierempfohlen.
Nukleinsäurenachweis- und -amplifikationstechniken haben die Tollwutdiagnose in den letzten Jahren revolutioniert6 und diese Techniken spielen eine wichtige Rolle bei der Ante-mortem-Diagnose menschlicher Tollwut. Mehrere PCR-basierte Tests wurden als Ergänzung zu herkömmlichen Tests für Anti-Mortem- und Post-Mortem-Tollwut-Diagnosen 7,8,9,10ausgewertet. Die meisten Assays zielen auf das virale Nukleoproteingen tollwutium, das die am höchsten konservierte Region im viralen Genom1,11ist. In den letzten 20 Jahren wurden verschiedene molekulare Assays entwickelt, um RABV zu diagnostizieren, und einige dieser Assays wurden für die Viruscharakterisierung verwendet. Die meisten Studien zielten darauf ab, konservierte Gene innerhalb des viralen Genoms zu detektieren, am häufigsten mithilfe konventioneller oder quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) Assays12,13.
PCR ist eine hochempfindliche diagnostische Technik, die das Genom eines bestimmten Krankheitserregers im Gewebe erkennen kann, auch wenn diese Gewebe zersetzt werden. Mit PCR-basierten Ansätzen können minimale Mengen eines infektiösen Erregers in einer klinischen Probe durch die selektive und sich wiederholende Amplifikation einer DNA-Nukleotidsequenz14nachgewiesen werden. qRT-PCR, die fluoreszierende Sonden (z. B. TaqMan) oder DNA-Bindende Farbstoffe (z. B. SYBR Green) enthält, wurde in Studien zur Diagnose von RABV sowohl ante- als auch post- mortem mit hoher Empfindlichkeit verwendet; ein solcher Ansatz erfordert jedoch eine spezielle Ausrüstung. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde reverse transkription-Loop-vermittelte isothermale Amplifikation (RT-LAMP) vorgeschlagen, basierend auf seinen niedrigen Kosten, Einfachheit und wünschenswerten Eigenschaften für die Erkennung von RABV. Dieser Test ist besonders wichtig, da er in Entwicklungsländern verwendet werden kann15.
qRT-PCR basiert auf der Detektion und Quantifizierung eines Moleküls, bei dem die Fluoreszenzsignalerhöhungen in direktem Verhältnis zur Menge des PCR-Produkts in einer einzigen Reaktion stehen. Mit zunehmender Anzahl von Kopien des Nukleinsäureziels steigt auch die Fluoreszenz. Unspezifische interkalierende Farbstoffe wie der SYBR Green DNA-Bindender Farbstoff oder sequenzspezifische Oligonukleotid-Sonden mit einem Fluorophor und einem Quencher werden häufig verwendet, um die fluoreszierende Auslesung in qRT-PCR bereitzustellen. Dieser Test bietet Vorteile gegenüber herkömmlichen RT-PCR, die eine kürzere Testzeit (2–4 h), ein geringeres Kontaminationsrisiko durch das geschlossene Rohrsystem (fehlende Post-PCR-Manipulation von verstärkten Produkten) und die Fähigkeit, verschiedene Ziele gleichzeitig zuerkennen, 16umfassen. qRT-PCR kann verwendet werden, um Tollwut ante-mortem aus Speichel und anderen Proben zu diagnostizieren. Dieser Assay kann auch als universeller Echtzeittest für den Nachweis verschiedener Lyssavirus-Arten oder Abstammungen von RABV15verwendet werden. Bei diesem Combo RT-PCR-Ansatz werden zwei Reaktionen verwendet. Die erste detektiert verschiedene genetische Linages von RABV, die zweite die Lyssavirus-Arten. Beide Schritte beinhalten qRT-PCR-Assays, wobei der erste Hybridisierungssonden und der zweite Farbstoff15verwendet. Aufgrund der Vielzahl von Tests, die eine erfolgreiche molekulare Detektion von RABV mit dieser Technik nachgewiesen haben, empfiehlt das aktuelle OIE Terrestrial Manual (2018) den Einsatz von PCR für den molekularen Nachweis von RABV17.
Mexiko ist ein Land mit erheblichem Viehpotenzial. Die Staaten mit der höchsten Viehproduktion enthalten sowohl feuchte tropische Regionen als auch trockene Regionen, die durch das Vorhandensein der Vampirfledermaus Desmodus rotundus, dem Hauptsender der Tollwut, für Tollwutausbrüche gefährdet sind. Daher ist es wichtig, mehr Instrumente zur Verhütung und Bekämpfung von rinderparalytischer Tollwut (BPR) in Mexiko zu entwickeln. Auf dieser Grundlage bestand das Ziel dieser Studie darin, die quantitative qRT-PCR zu verwenden, um die Anzahl der virusfreien Partikel in verschiedenen anatomischen Strukturen von Rinderhirnen nach dem Tod durch Tollwutinfektion zu bestimmen.
Sechs Gehirne, die von RABV-positiven Rindern gewonnen wurden, wurden von einem externen Labor für den Einsatz bei der Entwicklung des unten beschriebenen qRT-PCR-Protokolls gespendet. Die Rinderstrukturproben wurden kaltkett in die INIFAP CENID-MA Laboranlage BSL-2 transportiert und bis zum Gebrauch bei -80 °C gelagert. Die Gehirne wurden von Tieren aus den Bundesstaaten Campeche, Yucatén und Querétaro gewonnen. Vor der Quittung wurden verschiedene Strukturen aus dem Gehirn seziert. Zu diesen Strukturen gehörten das Ammonhorn, Kleinhirn, Kortex, Medulla, Pons und Thalamus18,19. Genetisches Material wurde wie unten beschrieben extrahiert. Die RABV-Diagnose wurde mit direkten fluoreszierenden Antikörpern (DFA)20bestätigt. Als positiv zu steuernde, Mausgehirne, die mit RABV21 geimpft wurden, wurden verwendet. Zusätzlich wurden vier RABV-negative Rinderhirne (wie von DFA bestimmt) als Negativkontrollen verwendet.

<table><tbody><tr><td>Chloroform</td><td>SIGMA</td><td>C7559</td><td>Erleichtert die Rückgewinnung der wässrigen Phase von PCRs, die mit Mineralöl überlagert wurden.</td></tr><tr><td>DNA reinigen & Concentrator-500</td><td>Zimo</td><td>D4031</td><td>Die DNA Clean & Der Concentrator-500 (DCC-500) ist für die schnelle, großformatige Reinigung und Konzentration von bis zu 500 & Mikro; g von hochwertiger DNA aus Proben, einschließlich großflächiger Restriktionsendonuklease-Verdaue und unreiner DNA-Präparate.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Amresco</td><td>193-500</td><td>Aufreinigung von Nukleinsäuren</td></tr><tr><td>FastStart High Fidelity PCR System Kit, dNTPack</td><td>Roche</td> 3553400001 <td>High-Fidelity-Enzym für die Amplifikation von PCR-Produkten zur Vermeidung zufälliger Basenänderungen</td><td></td></tr><tr><td>GelDoc XR</td><td>BioRad</td><td>XR+</td><td>Analysiert größere Protein- und DNA-Gele</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Sie sind eine neue Generation von Nukleinsäure-Gel-Färbemitteln und verfügen über neuartige chemische Eigenschaften, die die Wahrscheinlichkeit minimieren, dass die Farbstoffe mit Nukleinsäuren in lebenden Zellen interagieren.</td></tr><tr><td>iCycler Thermal Cycler Gradient</td><td>BioRad</td><td>582BR</td><td>Die Temperatur kann mit dem Gerätealgorithmus, der In-Sample-Sonde oder den Probenblockmodi überwacht und gesteuert werden</td></tr><tr><td>iTaq Universal Probes One-Step Kit</td><td>BioRad</td><td>1725141</td><td>Reaktionsgemisch zur Durchführung von PCR-Reaktionen in Echtzeit mit Hybridisierungssonden vom Typ TaqMan</td></tr><tr><td>Isopropylalkohol</td><td>Amresco</td><td>0918-500</td><td>Fällung von Nukleinsäuren</td></tr><tr><td>QIAquick Gel-Extraktionskit</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>QIAquick Kits enthalten eine Kieselsäuremembran-Anordnung für die Bindung von DNA in Puffer mit hohem Salzgehalt und die Elution mit Puffer mit niedrigem Salzgehalt oder Wasser. Das Aufreinigungsverfahren entfernt Primer, Nukleotide, Enzyme, Mineralöl, Salze, Agarose, Ethidiumbromid und andere Verunreinigungen aus</td></tr><tr><td>DNA-Proben M-MLV Reverse Transkriptase</td><td>Invitrogen</td><td>28025-021</td><td>Die Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transkriptase (M-MLV RT) verwendet einzelsträngige RNA oder DNA in Gegenwart eines Primers, um einen komplementären DNA-Strang zu synthetisieren.</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo-Scientific</td><td>ND2000</td><td>Mikrovolumen-Spektralphotometer</td></tr><tr><td>Oligo(dT)18 Primer</td><td>Invitrogen</td><td>SO132</td><td>Der Oligo (dT)18 Primer ist ein synthetisches einzelsträngiges 18-mer-Oligonukleotid mit 5'- und 3'-Hydroxylenden.</td></tr><tr><td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems Kit SP6 und T7</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td>In-vitro-Transkriptionsreaktionen werden verwendet, um Mikrogrammmengen von RNA-Sonden aus rekombinanten DNA-Templates zu synthetisieren. Die meisten Transkriptionsreaktionen, die zur Erzeugung von RNA-Sonden entwickelt wurden, sind optimiert, um den Einbau von radioaktiv markierten Ribonukleotiden zu maximieren, anstatt große Mengen an RNA zu produzieren</td></tr><tr>.<td>Taq-DNA-Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>#EP0402</td><td>Taq-DNA-Polymerase ist eine hochgradig thermostabile DNA-Polymerase des thermophilen Bakteriums Thermus aquaticus. Das Enzym katalysiert 5' und 3' Synthese von DNA &nbsp;</td></tr><tr><td>TRIzol-Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>Das TRIzol-Reagenz ist ein vollständiges, gebrauchsfertiges Reagenz, das für die Isolierung hochwertiger Gesamt-RNA oder die gleichzeitige Isolierung von RNA, DNA und Proteinen aus einer Vielzahl biologischer Proben entwickelt wurde.</td></tr></tbody></table>

quantifizierung des tollwutvirus in verschiedenen rinderhirnstrukturen

Quantitation of Rabies Virus in Various Bovine Brain Structures

Rinder-Paralytische Tollwut (BPR) ist eine Form der viralen Enzephalitis, die in ganz Lateinamerika von erheblicher wirtschaftlicher Bedeutung ist und ein großes Zoonoserisiko darstellt. Hier galt es, mithilfe eines Laborprotokolls die relative Kopiernummer des Tollwutvirus-Genoms (RABV) in verschiedenen anatomischen Rinderhirnstrukturen mithilfe quantitativer Realzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) zu bestimmen. qRT-PCR quantifiziert die spezifische Anzahl der Genkopien, die in einer Probe auf der Grundlage der nach der Amplifikation emittierten Fluoreszenz vorhanden sind und direkt proportional zur Menge der in der Probe vorhandenen Zielnukleinsäure sind. Dieses Verfahren ist aufgrund seiner kurzen Dauer, des reduzierten Kontaminationsrisikos und des Potenzials, virale Nukleinsäuren in verschiedenen Proben leichter als andere Techniken zu erkennen, von Vorteil. Die Gehirne von sechs tollwütigen Tieren wurden in sechs anatomische Strukturen unterteilt, nämlich das Ammonhorn, Kleinhirn, Kortex, Medulla, Pons und Thalamus. Alle Gehirne wurden auf der Grundlage eines direkten Immunfluoreszenztests als positiv für RABV-Antigene identifiziert. Die gleichen anatomischen Strukturen aus den Gehirnen von vier RABV-negativen Rindern wurden ebenfalls bewertet. DIE RNA wurde aus jeder Struktur extrahiert und für qRT-PCR verwendet. Ein Test wurde durchgeführt, um die Kopiennummern von RABV-Genen unter Verwendung eines in vitro transkribierten Nukleoprotein-Gens zu bestimmen. Die Standardkurve zur Quantifizierung viraler RNA wies eine Effizienz von 100% und eine Linearität von 0,99 auf. Die Analyse ergab, dass der Kortex, die Medulla und der Thalamus die idealen ZNS-Portionen für den Einsatz bei der RABV-Erkennung waren, basierend auf der Beobachtung, dass diese Strukturen die höchsten RABV-Werte besaßen. Die Testspezifität betrug 100%. Alle Proben waren positiv, es wurden keine fehlpositiven Ergebnisse festgestellt. Diese Methode kann verwendet werden, um RABV in Proben zu erkennen, die während der Diagnose von BPR niedrige RABV-Spiegel enthalten.

Die DFA-Ergebnisse zeigten 100%, 100%, 83,3%, 66% und 50% Positivität für RABV im Kortex, Thalamus, Medulla, Pons und Horn. Diese Ergebnisse bestätigten die vorherigen Ergebnisse, und mindestens drei der strukturen, die von jedem Gehirn seziert wurden, waren positiv für RABV. Eine repräsentative positive DAF-Färbung ist in Abbildung 1dargestellt.
Abbildung 2 zeigt die Verstärkung eines Fragments des RABV N-Gens (Schritt 5.5) mit den P...

Dieses Protokoll stellt einen qRT-PCR-basierten Ansatz zur Bestimmung der Virus-Nukleoprotein (N)-Genkopienummer innerhalb verschiedener anatomischer Rinderhirnstrukturen unter Verwendung von In-vitro-Transkription dar.

Quantifizierung des Tollwutvirus in verschiedenen Rinderhirnstrukturen

Bovine paralytic rabies (BPR) is a form of viral encephalitis that is of substantial economic importance throughout Latin America, where it poses a major ...

Quantifizierung des Tollwutvirus in verschiedenen Rinderhirnstrukturen. Mexiko ist ein Land mit erheblichem Viehpotenzial. Die Staaten mit der höchsten Viehproduktion enthalten sowohl feuchte tropische Regionen als auch trockene Regionen, die durch das Vorhandensein der Vampirfledermaus Desmodus rotundus, dem Hauptsender der Tollwut, für Tollwutausbrüche gefährdet sind.Der Nachweis des Tollwutvirus Nukleoprotein N-Gen wird vor allem für die Tollwutdiagnose durch molekulare Tests verwendet. Mit PCR-basierten Ansätzen können minimale Mengen eines infektiösen Erregers in einer klinischen Probe durch die selektive und sich wiederholende Amplifikation einer DNA-Nukleotidsequenz nachgewiesen werden. qRT-PCR basiert auf der Detektion und Quantifizierung eines Moleküls, bei dem die Fluoreszenzsignalerhöhungen in direktem Verhältnis zur Menge des PCR-Produkts in einer einzigen Reaktion stehen.Mit zunehmender Anzahl von Kopien des Nukleinsäureziels steigt auch die Fluoreszenz. Auf dieser Grundlage bestand das Ziel der Studie darin, die quantitative qRT-PCR zu verwenden, um die Anzahl der virusfreien Partikel in verschiedenen anatomischen Strukturen von Rinderhirnen nach dem Tod aufgrund einer Tollwutinfektion zu bestimmen. Total RNA wurde direkt aus Rinderhirnen mit einer organischen Extraktionsmethode nach dem folgenden Protokoll extrahiert.Verwenden Sie 100 Milligramm Hirngewebe aus jeder anatomischen Struktur, um die gesamte RNA mit einem kommerziell erhältlichen Reagenz zu extrahieren, das Guanidiniumisothiocyanat enthält. Manuelle Homogenisierung von insgesamt 100 Milligramm Gewebe aus jeder Struktur in einem Milliliter des Guanidinium isothiocyanatreage reageimmittel durch Wirbeln mit einem Dounce Homogenisat mit einem kleinen Stößel im Mikrorohr für 15 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit. Die Proben fünf Minuten lang auf Eis bebrüten und dann 200 Mikroliter Chloroform hinzufügen.Mischen Sie die Proben 15 Sekunden lang kräftig. Zwei bis drei Minuten auf Eis bebrüten und dann bei 12 000 x g bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Die wässrige Phase auf ein sauberes Rohr übertragen und 500 Mikroliter Isopropylalkohol hinzufügen.Inkubieren Sie die Proben für 15 Minuten bei 21 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Aspirieren Sie den wässrigen Überstand durch Pipettieren.Die isolierte RNA wird als Pellet in der Röhre vorhanden sein. Als nächstes waschen Sie das RNA-Pellet mit einem Milliliter 75%Ethanol durch Pipettieren und Zentrifugieren bei 7, 500 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Dekantieren Sie den Überstand und trocknen Sie das RNA-Pellet bei Raumtemperatur um 21 Grad Celsius.Anschließend das Pellet in 50 Mikroliter nukleasefreiem Wasser verdünnen. Bestimmen Sie die RNA-Konzentration und -Qualität mit einem Spektralphotometer bei 260 Nanometern. In-vitro-Transkription erzeugt mRNA eines Zielgens.Verwenden Sie ein Primer-Paar, das das gesamte RABV N-Gen verstärkt, und eines, das als positiv für den qRT-PCR-Assay verwendet wird. Diese Primer wurden entwickelt, um das gesamte RABV N-Gen zu verstärken und einen Promotor hinzuzufügen, der die T7-Polymerase erkennt. Um das gesamte N-Gen RABV zu verstärken, verwenden Sie die Primer trans und RAB vorwärts und rückwärts und ein HIGH-Fidelity-PCR-Kit.Bereiten Sie für jede Reaktion einen PCR-Master-Mix vor, indem Sie einen sauberen PCR-Rohrreaktionspuffer mit 10 Mikromolaren pro Primer und 0,5 Einheiten Hochtreuepolymerase hinzufügen. Um das PCR-Produkt als Vorlage für die In-vitro-Synthese zu verwenden und Komponenten der enzymatischen Reaktion zu entfernen, reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem säulenbasierten Konzentrator-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Und dann mit einem Spektralphotometer quantifizieren.Für die RNA-Synthese verwenden Sie ein In-vitro-Transkriptionskit mit folgendem Reaktionsgemisch: fünf Mikroliter T7-Transkription 5X Puffer, 1,9 Mikroliter jedes Triphosphat-Nukleotids, 10 Mikrogramm gereinigte RABV-N-DNA und 2,5 Mikroliter des Enzymgemisches. Als nächstes, inkubieren Sie die Mischung bei 37 Grad Celsius für vier Stunden. Dann fügen Sie einen Mikroliter von einer Einheit pro Mikrogramm Rnase-Freie DNase in das Reaktionsgemisch und inkubieren für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius, um DNA-Kontamination zu beseitigen.Reinigen Sie die in vitro transkribierte RNA und konzentrieren Sie sie dann mit Phenol:Chlorform:Isoamylalkohol im Verhältnis 25:24:1. Setzen Sie das gereinigte RNA-Pellet in 70 Mikroliter TE-Puffer aus, und lagern Sie es dann bei 80 Grad Celsius bis zum Gebrauch. Wiederholen Sie das PCR-Protokoll, bis etwa fünf Mikrogramm PCR-Produkt erhalten sind.Nach der Reinigung und Konzentration wird das in vitro transkribierte N-Gen mRNA in einer Konzentration von 4,711 Mikrogramm pro Mikroliter vorhanden sein. Bestätigen Sie, dass die in vitro transkribierte mRNA dem N-Gen nach Schritt 5 dieses Protokolls entspricht, und verwenden Sie diese als positive Kontrolle für die Echtzeit-Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion, qRT-PCR. Für die Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion verwenden Sie ein In-vitro-mRNA-Transkript bei der Codierung des gesamten N-Gens als positive Kontrolle.Zusammen mit einem kommerziellen einstufigen qRT-PCR-Kit, mit Hybridisierungssonden nach den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie die Sonde in Primern, die von Coronado und Kollegen 2010 beschrieben wurden, um eine konservierte Region des RABV unter Verwendung der folgenden thermischen Radfahrbedingungen zu erkennen. Führen Sie serielle Verdünnungen der in vitro transkribierten mRNA durch seriellepipetierung eines Mikrogramms pro Mikroliter mRNA in Die röhrchende Röhren durch, bis sechs entkoppelte Verdünnungen erhalten sind.Bereiten Sie Rohre mit einem Volumen von 100 Mikrolitern in dreifacher Ausfertigung für die Erstellung der Standardkurve vor. Führen Sie qRT-PCR wie zuvor beschrieben aus. Führen Sie qRT-PCR in einem thermischen Cycler mit einem Rotor durch, indem Sie die verschiedenen Gehirnproben gleichzeitig mit den laufenden Reaktionen verarbeiten, um eine Standardkurve zu erstellen und positive Steuerungen, Negativkontrollen und überzählige Stoffe zu verwenden, die aus der Zellkultur isoliert sind.Um die Nachweisgrenze, die Testwirksamkeit und die Empfindlichkeit des Tests zu bewerten, verwenden Sie eine Standardkurve in Dreifacharbeit unter den gleichen Bedingungen. Verwenden Sie für den Nachweis des RABV-Gens N die RNA aus Feldproben, Positivkontrollen, Negativkontrollen und Zellkulturübersprechern, um qRT-PCR mit dem zuvor beschriebenen PCR-Kit durchzuführen. Um die Anzahl der Kopien des RABV-Genoms in den Rinderhirnproben zu bestimmen, erhalten Sie CT-Daten aus der Standardkurve und biologischen Proben und aus jenen, die aus der Kalibrierkurvengleichung interpoliert sind. Diese Abbildung zeigt Rinderhirngewebe mit positiver Färbung gemäß der direkten Immunfluoreszenz.Die Ergebnisse zeigen 100%100%83,3%66% und 50% Positivität für RABV in der Kortex, Thalamus, Medulla, Pons und Horn jeweils. Diese Ergebnisse bestätigen die vorherigen Ergebnisse, und mindestens drei der Strukturen, die von jedem Gehirn seziert wurden, waren positiv für RABV. Andererseits zeigt die Gleichung der Standardkurve den Zusammenhang zwischen der Menge des RABV-Gengehalts in der Probe und der Größe des PCR-verstärkten Fragments.Die Menge des RABV-Gengehalts in Nanogrammen wurde durch Interpolation der CT-Werte in der Kalibrierkurve unter Verwendung der in dieser Abbildung dargestellten Gleichung abgeleitet. Mit dieser Gleichung wurde festgestellt, dass die Nachweisgrenze von einem mal 10 bis fünf Mikrogramm pro Mikroliter viraler RNA 36 Kopien des RABV-Genoms entspricht. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Test empfindlich ist und verwendet werden kann, um das Virus in Proben zu erkennen, die eine geringe Anzahl von Kopien des RABV N-Gens enthalten.Der Wirkungsgrad des Assays wurde anhand der Steigung der Standardkurve berechnet, die 3,28 betrug. Die für qRT-PCR verwendeten Proben zeigten eine Amplifikation des RABV N-Gens. Um die Anzahl der vorhandenen viralen Kopien zu bestimmen, wurden die CT-Werte für jede Probe mit der Kalibrierungskurvengleichung interpoliert.Die in Nanogrammen erzielten Ergebnisse wurden in die hier beschriebene Formel substituiert. Diese Tabelle zeigt die Vergleichsergebnisse zwischen qRT-PCR und DFA. Die Ergebnisse der qRT-PCR-Assays stimmten mit denen über ein DFA überein.Nach den Ergebnissen des qRT-PCR-Tests in den Fällen C und D ist der Thalamus die Struktur, die die höchste Anzahl von Kopien des RABV N-Gens besitzt. Dies deutet darauf hin, dass eine frühe Infektion von hypothalamischen und thalamischen Neuronen wichtig für die Entwicklung der Krankheit ist, da diese Neuronen die vegetativen Funktionen eines Tieres kontrollieren. Die Kopiennummern des RABV N-Gens, die in jeder Struktur jeder Probe nachgewiesen wurden, sind: die Empfindlichkeit und Spezifität des qRT-PCR-Tests sind wir beide zu 100%, da alle Proben positiv waren.Dieses Ergebnis stimmt mit den ersten Diagnosen der Proben überein. qRT-PCR ist eine hochempfindliche Technik. Einige der Schritte sind entscheidend, um die besten Ergebnisse zu erzielen.Eine davon ist die richtige Handhabung von Proben für die RNA-Extraktion. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung, da die RNA leicht abgebaut werden kann und die Ergebnisse daher beeinflusst werden könnten. Erwägen Sie, die Probe unter kalten Bedingungen zu halten, etwa vier Grad Celsius während des Prozesses.Berücksichtigen Sie außerdem, dass mehrere Runden pcR-Anwendung durchgeführt werden, wie in der In-vitro-Transkription erwähnt. Der in dieser Studie durchgeführte qRT-PCR-Assay konnte nur 36,3 Kopien des RABV N-Gens pro Milligramm Gewebe erkennen. Zu den am besten geeigneten Hirnstrukturen für qRT-PCR gehörten der Kortex und der Thalamus.Dies basiert auf den Beobachtungen, dass in diesen Strukturen höhere Konzentrationen des RABV-N-Gens nachgewiesen wurden und dass sie auch mit dem RABV-Referenztest positiv waren. Der Test konnte sehr niedrige Konzentrationen, 0,00023 mal 10 bis die neunten Kopien des Virus in verschiedenen Proben zu erkennen. Neben der Quantifizierung der Viruspartikel in der Probe scheint der Test ein gutes alternatives Diagnose- und Forschungswerkzeug für die Erkennung von RABV zu sein, das hier vorgestellt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Das Virus infiziert pyramidale Neuronen in der Großhirnrinde, und exprimierte virale Proteine lokalisieren sich in intrazytoplasmatischen granularen Strukturen, die als Einschlusskörper bekannt sind.

Nachweis von viralen Proteinen in mit Tollwutviren infiziertem Hirngewebe von Mäusen

Dieses Video zeigt die immunhistochemische Färbung für den Nachweis von Tollwutvirus-Antigenen in infiziertem Hirngewebe von Mäusen. Der Prozess umfasst die Entparaffinisierung und Alkoholbehandlung, gefolgt von einer proteolytischen Behandlung, um die Antigenzugänglichkeit zu verbessern. Die immunhistochemische Färbung zeigt rote Ausfällungen, die das Vorhandensein von Tollwutantigenen im Gewebeschnitt bestätigen.

Eine immunhistochemische Färbung zum Nachweis von Tollwutvirus-Antigenen

Quelle: Zaeck, L., et al. Hochauflösende 3D-Bildgebung von Tollwutvirusinfektionen in lösungsmittelfreiem Hirngewebe. J. Vis. exp. (2019).  Dieses Video zeigt den Prozess der Aufbereitung und Bildgebung von mit dem Tollwutvirus (RABV) infiziertem Hirngewebe von Mäusen, um das Fortschreiten der Infektion zu bewerten. Es werden die wichtigsten Schritte beschrieben, einschließlich der Gewebefärbung mit fluoreszierenden Markern, der Dehydratisierung, der Reinigung und der Montage für die konfokale...

Dreidimensionale Visualisierung einer Tollwutvirusinfektion im Hirngewebe von Mäusen

Neuartige, immunstaining-kompatible Gewebeclearing-Techniken wie die ultimative 3D-Bildgebung von lösungsmittelgereinigten Organen ermöglichen die 3D-Visualisierung von Tollwutvirus-Hirninfektionen und ihrer komplexen zellulären Umgebung. Dicke, antikörperbeschriftete Hirngewebescheiben werden optisch transparent gemacht, um die Bildtiefe zu erhöhen und eine 3D-Analyse durch konfokale Laserscanmikroskopie zu ermöglichen.

Hochauflösende 3D-Bildgebung der Tollwut-Virusinfektion im lösungsmittelfreien Hirngewebe

Der direkte schnelle immunhistochemische Test (DRIT) bietet eine anerkannte Alternative zur direkten fluoreszierenden Antikörper-Diagnose (World Organization for Animal Health and World Health Organization(Who). Dieser Test ermöglicht feldbasierte Anwendungen, die bei Hirnabdrücken mit Hilfe der Lichtmikroskopie in ca. 1 h durchgeführt werden können.

Verbesserte Tollwutüberwachung mit einem direkten schnellen immunhistochemischen Test

Ziel dieses Protokolls ist es, sichere Nekropsietechniken bei kleinen und großen Tieren zu demonstrieren, um zufriedenstellende Gewebeproben für Tollwuttests zu erhalten.

Tollwut-Nekropsie-Techniken bei großen und kleinen Tieren

Wir präsentieren ein vollständiges Protokoll zur postmortalen Diagnose von Tiertollwut unter Feldbedingungen mit Hilfe eines schnellen immunchromatographischen diagnostischen Tests (RIDT), von der Probenahme der Hirnbiopsie bis zur endgültigen Interpretation. Wir beschreiben auch weitere Anwendungen mit dem Gerät für molekulare Analyse und virale Genotypisierung.

Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromatographischer Diagnostischer Test für ressourcenbegrenzte Einstellungen mit weiteren molekularen Anwendungen

Hier stellen wir ein immunhistochemisches Testprotokoll zum Nachweis von Tollwutvirus-Antigen als alternativen diagnostischen Test für formalinfixierte Gewebe vor.

Immunhistochemischer Test für den Lyssavirus-Antigennachweis aus formalinfixierten Geweben

Hier stellen wir einen schnellen und kostengünstigen Workflow zur Charakterisierung von Tollwutvirusgenomen (RABV) mit Hilfe der Nanoporentechnologie vor. Der Arbeitsablauf soll die genomikgestützte Überwachung auf lokaler Ebene unterstützen und Informationen über zirkulierende RABV-Linien und deren Einordnung in regionale Phylogenien liefern, um Maßnahmen zur Tollwutbekämpfung zu steuern.

Sequenzierung des gesamten Genoms zur schnellen Charakterisierung des Tollwutvirus mittels Nanoporentechnologie

Dieses Protokoll demonstriert den Echtzeit-Assay für die Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) des Pan-Lyssavirus LN34 von der Gewebeentnahme bis zur Ergebnisinterpretation, einschließlich Aktualisierungen von Primersequenzen und Formulierungen zur Verbesserung der Assay-Leistung für einige Nicht-Tollwut-Lyssaviren und Hasentiere. Wir demonstrieren auch den Assay-Aufbau für ein Single-Well-LN34-Multiplexformat (LN34M).

Postmortale Diagnose von Tollwut bei Tieren mit dem aktualisierten, multiplexierten LN34 Echtzeit-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktionsassay

Lernen Sie eine qRT-PCR-basierte Methode zur Quantifizierung des Tollwutvirus-N-Gens in verschiedenen Rinderhirnstrukturen. Dieses Protokoll ermöglicht die zuverlässige Detektion niedriger Viruslasten für die Forschung.

Quantifizierung des Tollwutvirus in verschiedenen Rinderhirnstrukturen

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