Name: Super-Resolution Imaging zur Untersuchung der Kolokalisierung von Proteinen und synaptischen Markern in primärer Neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Erfahren Sie die Super-Resolution-Mikroskopie zur Untersuchung der Protein-Kolokalisierung in primären Neuronen mit strukturierter Beleuchtung. Diese Methode erreicht eine Auflösung von etwa 100 Nanometern.

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Die Autoren danken Edoardo Micotti für die konstruktive Kritik an dem Manuskript. Diese Studie wurde unterstützt von BrightFocus A2019296F, von Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), von Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) und vom Marie Skéodowska-Curie Innovative Training Network (JK).

1. Primärkulturen
<ol><li>Kultur Maus Hippocampus primäre Neuronen in kammerförmigen Abdeckungen (wie Ibidi μ-Slide 8 Well oder Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass), die die objektive Anforderung für #1,5 (0,17 mm) Abdeckung dicke entsprechen.</li>
	<li>Mantelkammer-Abdeckungen mit 100 l Poly-L-Lysin (100 g/ml).</li>
	<li>Am nächsten Tag die kammerförmigen Deckel zweimal mit steriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS) waschen.</li>
	<li>Um Maus primär neuronen zu erhalten, isolieren Hippocampi von P1-P4 Welpen23.</li>
	<li>Legen Sie sezierte hippocampi in 10 ml Dissektionsmedien (Tabelle 1) und lassen Sie sie an der Unterseite der Röhre ablagern.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einer sterilen Pipette vorsichtig die Dissektionsmedien, sodass das Hippocampi am Boden des Rohres ungestört bleibt.</li>
	<li>10 ml Medien 1 (Tabelle 1) in das Hippocampi geben und 30 Minuten bei 37 °C brüten.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einer sterilen Pipette sorgfältig Media 1, so dass das Hippocampi an der Unterseite des Rohres ungestört bleibt.</li>
	<li>10 ml Medien 2 (Tabelle 1) hinzufügen und das (gekapselte) Zentrifugenrohr horizontal für 45 Minuten unter der Haube lassen.</li>
	<li>Lassen Sie das Zentrifugenrohr vertikal stehen, damit sich das Gewebe an der Unterseite des Rohres absetzen kann.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einer sterilen Pipette sorgfältig Media 2, so dass das Hippocampi am Boden des Zentrifugenrohrs ungestört bleibt.</li>
	<li>Fügen Sie 2 ml Medien 3 hinzu (Tabelle 1).</li>
	<li>Mit einer p1000 Pipette mit gefilterter Spitze, trennen Sie zellen mechanisch vom Gewebe.</li>
	<li>Übertragen Sie den Überstand, in dem sich die isolierten Neuronen befinden, auf ein 15 ml Zentrifugenrohr.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 2 min bei 300 x g bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Nach der Zentrifugation befinden sich die Zellen am Boden des Zentrifugenrohrs. Mit einer sterilen Pipette entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>ResuspendZellen in 1 ml Von Medien 4.</li>
	<li>Verwenden Sie einen 70-mm-Filter, um nicht soziierte Zellen zu eliminieren.</li>
	<li>Zählen Sie lebensfähige Zellen in einer Bürker-Kammer, indem Sie 1 l von 0,4 % Trypan-Blaulösung zu 19 l der Zellsuspension hinzufügen.</li>
	<li>Plattenzellen bei 70.000 Zellen/Well in einem Volumen von 200 l pro Brunnen.</li>
	<li>Lassen Sie die Zellen für 2 h in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5%CO2anbringen.</li>
	<li>Nehmen Sie die kammerförmigen Abdeckungen aus dem Inkubator und ersetzen Sie das Medium sorgfältig durch 200 L Kulturmedien.</li>
	<li>Lassen Sie die kammerförmigen Abdeckungen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5%CO2.</li>
	<li>Ersetzen Sie alle 5-7 Tage ein Drittel des Mediums durch frische Kulturmedien.</li>
	<li>Warten Sie, bis die primären Neuronen des Hippocampus vollständig ausgereift sind (12-14 Tage nach der Beschichtung), um Co-Lokalisierungsstudien durchzuführen.</li>
</ol>2. Immunfluoreszenzfärbung
<ol><li>Nehmen Sie die kammerförmigen Abdeckungen aus dem Inkubator.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium.</li>
	<li>Waschen Sie die Brunnen schnell mit 200 l PBS.</li>
	<li>Fügen Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS (200 L/Well) zu Neuronen hinzu, um sie schnell zu beheben.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen für 15 min bei RT.</li>
	<li>Entfernen Sie die PFA-Lösung.</li>
	<li>Permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie PBS mit 0,2% Triton X-100 (200 l/well) hinzufügen.</li>
	<li>1 min bei RT inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung und inkubieren Sie die Proben mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS (200 l/well) für 1 h bei RT, um alle freien Bindungsflächen der Platte passiv mit einem irrelevanten Protein für die Analyse abzudecken. Ein BSA-basierter Blockierpuffer ohne Triton X-100 reduziert den Antikörperhintergrund effizienter als der gleiche Puffer mit 0,2% Triton X-100.</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung.</li>
	<li>Fügen Sie den primären Antikörper der Wahl in einer PBS-Lösung mit 1% BSA und 0,2% Triton X-100 (120-200 l/well, abhängig von der Antikörperverdünnung und Verfügbarkeit) hinzu. Inkubieren Sie die Proben für 2 h.<ol>
<li>Als Negativkontrolle, fügen Sie keinen primären Antikörper zu einem der Brunnen. Mehrere Antikörper verschiedener Arten gegen unterschiedliche Ziele können gleichzeitig verwendet werden. Verwenden Sie einen Antikörper gegen MAP2 (einen neuronalen Marker), der in Hühnern aufgezogen wird, einen Antikörper gegen PSD95 oder Synaptophysin, der in der Maus aufgezogen wird, und einen Antikörper gegen ein Zielprotein, das bei Kaninchen aufgezogen wird. Dies ermöglicht dreifarbige SIM-Analysen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie die Brunnen schnell dreimal mit PBS (200 l/well).</li>
	<li>Fügen Sie sekundäre Antikörper hinzu (dyLight und Alexa sekundäre Antikörper können beide verwendet werden), die in einer PBS-Lösung mit 1% BSA und 0,2% Triton X-100 (200 l/well) verdünnt werden. Inkubieren Sie die Proben für 1 h bei RT.</li>
	<li>Waschen Sie die Brunnen schnell dreimal mit PBS (200 l/well).</li>
	<li>Fügen Sie Hoechst-Farbstoff in einer Konzentration von 1 g/ml in PBS (200 l/well) verdünnt, um Kerne zu färben. Inkubieren Sie die Proben für 10 Minuten bei RT.</li>
	<li>Waschen Sie die Brunnen schnell zweimal mit PBS.</li>
	<li>Mounten Sie Zellen mit einem SIM-kompatiblen Mountant. Verwenden Sie 10 L/Well von ProLong Glass Antifade Mountant.</li>
	<li>Bedecken und schützen Sie die Zellen mit einem Deckglas (z.B. einem runden Deckglas mit einem Durchmesser von 8 mm). Quadratische können auch verwendet werden.</li>
	<li>Bewahren Sie die kammerförmigen Abdeckungen bei RT auf und warten Sie mindestens 48 h, bevor Sie Bilder erfassen. Diamond Glass benötigt mindestens zwei Tage aushärten, bevor Super-Resolution-Akquisitionen getätigt werden.</li>
</ol>3. Antikörper-Spezifitätskontrolle
HINWEIS: Verwenden Sie zwei Strategien, um die Spezifischenität des Antikörpers zu gewährleisten. Die erste Strategie besteht darin, mindestens zwei verschiedene Antikörper zu verwenden, die auf dasselbe Substrat abzielen. Die zweite Strategie ist die Antikörperneutralisation durch Inkubation mit dem gereinigten Proteinziel oder dem Epitop, das zur Erhöhung des Antikörpers verwendet wird.
<ol><li>Inkubieren Sie den Antikörper der Wahl mit einem fünfmal mehr als dem rekombinanten Ziel oder Epitop für 1 h bei RT in 1% BSA in PBS.</li>
	<li>Verwenden Sie nach der Inkubation den neutralisierten Antikörper in der üblichen Färbungskonzentration, wie oben beschrieben ab 2.11.</li>
</ol>4. Mikroskopkalibrierung
HINWEIS: Wir verwenden routinemäßig ein N-SIM Super-Resolution Microscope System von Nikon für die Super-Resolution-Studien. Einige andere Unternehmen bieten in ihren Katalogen aber auch Hochauflösende Mikroskope an. Obwohl spezifische Indikationen für Nikons N-SIM-System beschrieben werden, können die folgenden Anweisungen auf andere Systeme verallgemeinert werden. Vor der Erfassung von SIM-Bildern erfordert das System eine ordnungsgemäße Kalibrierung mit bestimmten Fluoreszenzperlen in Subauflösungsgröße. Ein Beispiel sind die TetraSpeck-Mikrosphären. Diese Perlen sind mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt, um die Kalibrierung verschiedener Laser mit einer Probe zu ermöglichen.
<ol><li>In einem Wasserbad beschallen sie 1,8 x 108 fluoreszierende Mikrosphären für 10 Minuten. Nikons N-SIM-System benötigt für die Kalibrierung eine dünn besiedelte mehrfarbige Perlenprobe. Dies kann sich bei anderen Systemen unterscheiden, die eine dichte Einzelschicht mit fluoreszierenden Perlen in Subauflösungsgröße benötigen. Passen Sie die Anzahl der fluoreszierenden Partikel entsprechend an.</li>
	<li>Verdünnen Sie die fluoreszierenden Mikrosphären 1:500 in doppelt destilliertem Wasser.</li>
	<li>Ein zweites Mal für weitere 10 Minuten beschallen.</li>
	<li>Pipetten Sie 15 l der verdünnten Perlen in einen Brunnen eines kammerkammerigen Deckellips.</li>
	<li>Lassen Sie die Lösung für 5 Minuten bei RT trocknen.</li>
	<li>Fügen Sie 10 l der Montagelösung hinzu und legen Sie einen 8 mm Abdeckzettel darüber.</li>
	<li>Warten Sie mindestens 48 Stunden, um eine ordnungsgemäße Aushärtung zu ermöglichen.</li>
	<li>Schalten Sie das Mikroskop und die Laser ein.</li>
	<li>Lassen Sie das System aufwärmen, um das thermische Gleichgewicht aller Mikroskopkomponenten zu erreichen. Das N-SIM Super-Resolution Microscope System benötigt mindestens 3 Stunden.</li>
	<li>Wählen Sie das 100x-Ziel aus.</li>
	<li>Starten Sie die Kalibrierung, indem Sie die Laser auf die Mitte des Beugungsgitterblocks ausrichten. Im N-SIM-System ermöglichen ein Mikrometerknopf und eine spezielle Kamera die Zentrierung der Lichtstrahlen zum Ziel.</li>
	<li>Legen Sie den kammerierten Deckelschlupf in das Mikroskop ein, um ihn zu betrachten. Stellen Sie das System auf die kammerierte Deckslipdicke ein, indem Sie den Objektivkorrekturkragen anpassen. Die NIS-Software, die proprietäre Software, die mit N-SIM Super-Resolution Microscope Systemen geliefert wird, verfügt über eine automatische Funktion zur Regulierung von Korrekturhalsbändern.</li>
	<li>Passen Sie den Gitterblockfokus für jeden Kanal an, um eine fokussierte strukturierte Musterbeleuchtung auf der Probe zu gewährleisten. Die NIS-Software bietet eine automatische Funktion für diese Aufgabe.</li>
	<li>Als nächstes erwerben Sie rohe 3D-SIM-Bilder der mehrfarbigen Mikrosphären. Rekonstruieren Sie die Rohbilder, um ein super aufgelöstes Bild mit der Mikroskop-Software oder der Open-Source-Software-Plattform für die Analyse biologischer Bilder ImageJ24 und das Plugin fairSIM25zu erhalten.</li>
	<li>Berechnen Sie für jede getrennte Wellenlänge die Fourier-Transformation des superaufgelösten Bildes, das in 4.14 erhalten wurde. Wenn das transformierte Bild kein korrektes blütenähnliches Muster erhält, starten Sie die Kalibrierung ab 4.11 neu, da keine Superauflösung erreicht wurde.</li>
	<li>Wählen Sie im super aufgelösten Bild eine einzelne Mikrosphäre aus, und berechnen Sie ihr Intensitätsprofil für jeden Kanal, um die erreichte Auflösung zu messen. Es sollte jetzt in der Nähe von 100 nm seitlich sein.</li>
	<li>Führen Sie als Nächstes die Kanalregistrierung durch, indem Sie eine Mehrkanalerfassung der Mikrosphären überlagern. Ziel ist es, alle Kanalsignale seitlich und axial zu kollidieren. Dadurch werden chromatische Aberrationen aufgrund der Fehlausrichtung der verschiedenen Kanäle beseitigt und die Analyse der Kolokalisierung hilfreich.</li>
	<li>Bestätigen Sie die Qualität der Kalibrierung mit den Funktionen "Illumination Phase Steps" und "Illumination Pattern Focus" von SIMcheck26, einer Suite von Plugins für die Open-Source-Anwendung ImageJ. Zu diesem Zweck bereiten Sie einen kammerförmigen Abdeckschein vor, um eine dichte Einzelschicht von TetraSpeck-Mikrosphären zu erhalten, und erfassen Sie ein 3D-SIM-Bild der Probe. Analysieren Sie das Bild in ImageJ, und starten Sie die Mikroskopkalibrierung ab Schritt 4.11 neu, wenn Aberrationen erkannt werden.</li>
</ol>5. Erwerb
<ol><li>Beginnen Sie mit der Analyse der Probe mit einem 40-fachen Objektiv im konfokalen oder Weitfeldmodus. Dies ermöglicht die Navigation zum Beispiel, wobei gute Details und ein großes Sichtfeld beibehalten werden.</li>
	<li>Verwenden Sie das MAP2-Antikörpersignal, um einen Bereich zu identifizieren, der neuronale Prozesse darstellt.</li>
	<li>Erfassen Sie Bilder der Probe im konfokalen Modus, um die Qualität der Färbung zu bestimmen. Schlechte konfokale Qualität spiegelt sich in schlechter SIM-Qualität wider, so dass die Proben entsorgt werden müssen.</li>
	<li>Wenn der Bereich und die Qualität der Bilder zufriedenstellend sind, schalten Sie das Ziel auf 100x.</li>
	<li>Öl auf das 100x-Objektiv auftragen.</li>
	<li>Erwerben Sie ein Weitfeld- oder Konfokalbild, das später verwendet wird, um die Qualität des super aufgelösten Bildes zu bewerten (Abbildung 1A,B).</li>
	<li>Wechseln Sie in den 3D-SIM-Modus.</li>
	<li>Wählen Sie mithilfe von Dialogfenstern, um Parameter für die Erfassung festzulegen, die höchste verfügbare Bittiefe aus, um Farbinformationen zu maximieren. In der Regel ist 16-Bit die Standardwahl. Um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, wählen Sie außerdem einen niedrigen Frequenzwert für die Erfassung, z. B. 1 MHz.</li>
	<li>Mit Histogrammfenstern können Sie die Leistung von Lasern einstellen, um eine lineare Signalantwort zu erhalten. Um Informationsverlust zu vermeiden, begrenzen Sie gesättigte Pixel in den Bildern. Das N-SIM-System verwendet eine Andor iXon3 Kamera. Wählen Sie bei 16-Bit eine Zielintensität von 16.000 aus, um das lineare Ansprechen der Kamera sicherzustellen. Alternativ können Sie einen Bereich zwischen 30.000 und 45.000 auswählen, um den Dynamikbereich der Erfassung zu maximieren.</li>
	<li>Stellen Sie die Laserleistung zwischen 0,1 % und 50 % bei der Abbildung der Proben und belichtungszeiten zwischen 50 ms und 2 s ein. Laserleistungen über 50% können zu einer schnellen Photobleichung der im Einsatz sindden Fluorophore führen.</li>
	<li>Beginnen Sie mit dem Erfassen der Bilder im 3D-SIM-Modus.</li>
	<li>Verwenden Sie SIMcheck, eine Suite von kostenlosen Plugins für ImageJ, um die Qualität der Erfassung der Rohbilder zu bewerten.</li>
	<li>Wenn SIMCheck keine Artefakte oder Qualitätsprobleme erkennt, erfassen Sie mindestens 10 Bilder aus 4 technischen Replikationen, um statistische Analysen zu ermöglichen.</li>
</ol>6. Postproduktion: Bildrekonstruktion
HINWEIS: 3D-SIM-Bilder sind Rohbilder, die verarbeitet werden müssen, um rekonstruierte, super aufgelöste Bilder zu erhalten. Eine falsche Rekonstruktion von Rohbildern kann zu Artefakten führen, die sich auf die Analyse der Proben auswirken würden. Daher sollte der richtigen Auswahl der Rekonstruktionsparameter große Aufmerksamkeit geschenkt werden.
<ol><li>Verarbeiten Sie die Rohbilder mit der Mikroskop-Rekonstruktionsanalyse-Software, um ein super aufgelöstes Bild zu erhalten (Abbildung 1C). Alternativ können Sie das frei verfügbare ImageJ-Plugin fairSIM verwenden, um Rohbilder zu rekonstruieren.</li>
	<li>Berechnen Sie die Fourier-Transformation der superaufgelösten Bilder mit der Mikroskop-Rekonstruktionssoftware oder dem ImageJ-Plugin SIMCheck. Ein gutes rekonstruiertes Bild sollte für jeden Kanal ein blumenartiges Bild zurückgeben. Wenn die rekonstruierten Bilder keine blumenähnliche Form wieder herstellen, starten Sie die Rohbilder neu und rekonstruieren Sie sie, indem Sie die Rekonstruktionsparameter wie Wiener Filterung, Apodisierung und Null-Ordnungsunterdrückung27ändern. In der NIS-Software, mit der Vorschau zu überwachen, wie das Ändern der Parameter auswirkungen sich auf das endgültige aufgelöste Bild, ändern Sie die Parameter i) Beleuchtung Modulation Kontrast, ii) High Resolution Noise Suppression und iii) Out of Focus Suppression.</li>
	<li>Als Nächstes analysieren Sie das rekonstruierte Bild, um Artefakte unvoreingenommen zu erkennen, indem Sie NanoJ-SQUIRREL28verwenden, ein ImageJ-basiertes Plugin, um die Qualität von super aufgelösten Bildern zu bewerten.</li>
	<li>Wenn NanoJ-SQUIRREL Artefakte erkennt, starten Sie die Rohbilder neu und rekonstruieren Sie sie, indem Sie die Rekonstruktionsparameter wie Wiener Filterung, Apodisierung und Unterdrückung ohne Ordnung ändern. Ändern Sie in der NIS-Software mithilfe der Vorschau, um zu überwachen, wie sich das Ändern der Parameter auf das endgültige aufgelöste Bild auswirkt, die Parameter Beleuchtungsmodulationskontrast, Rauschunterdrückung mit hoher Auflösung und Unterdrückung averfokussiert.</li>
	<li>Verwenden Sie die super aufgelösten Bilder, um das Kolokalisierungsprofil und/oder die Koeffizienten von Pearson und Mander zu berechnen.</li>
</ol>7. Co-Lokalisierung mit Profilanalyse
HINWEIS: Als ersten Schritt zur Untersuchung der Kolokalisierung zwischen synaptischen Markern und einem Protein von Interesse, nehmen Sie ein super aufgelöstes Bild und analysieren Sie einen einzelnen Ort, um Signalüberlappung zu bestimmen.
<ol><li>Identifizieren Sie einen einzelnen Standort auf dem super aufgelösten Bild.</li>
	<li>Erhalten Sie die Intensitätsprofile der fluoreszierenden Signale des Ortes von Interesse.</li>
	<li>Exportieren Sie die Daten.</li>
	<li>Verwenden Sie GraphPad Prism oder eine ähnliche Analysesoftware, um alle Signalspitzen zu normalisieren und vergleichbare Signalintensitäten für jeden Kanal zu erhalten, mit dem Endziel, die locus-spezifische Co-Lokalisierung zu bestimmen.</li>
</ol>8. Quantifizierung der Koeffizienten von Pearson und Mander
ANMERKUNG: Wenn die Profilanalyse eine Single-Locus-Kolokalisierung vorgeschlagen hat, kann eine allgemeinere Analyse des gesamten Bildes durch Berechnung der Koeffizienten von Pearson und Mander29,30durchgeführt werden.
<ol><li>Verwenden Sie JACoP31, ein ImageJ-Plug-In, um die beiden Parameter der Co-Lokalisierung zu bestimmen: Pearson es und Mander's.</li>
</ol>9. Statistische Analyse
<ol><li>Verwenden Sie GraphPad Prism oder eine ähnliche Analyse- und Grafiksoftware, um mit JACoP gesammelte Daten zu verarbeiten.</li>
	<li>Verwenden Sie mindestens 40 SIM-Bilder für jede analysierte Bedingung, um Diagramme zu erhalten und um statistische Relevanz zu erhalten.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Aufklärung der Struktur und Zusammensetzung der Synapse ist entscheidend für das Verständnis der physiologischen und pathologischen Prozesse, die Gedächtnis und Kognition regulieren. Während im normalen Zustand, Synapsen sind die Bausteine des Gedächtnisses, Sie auch zugrunde liegen komplexe neurologische Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit32. Das hier beschriebene Protokoll dient dazu, die Kolokalisierung neuronaler Proteine mit einer superhochauflösenden Mikroskopietechnik namens SIM zu unt...

Das Verständnis und die Sicht der Synapse hat sich seit ihrer ersten Beschreibung durch Foster und Sherrington im Jahre 1897 enorm verändert1. Seitdem ist unser Wissen über neuronale Kommunikation und die dahinter stehenden molekularen Prozesse exponentiell gewachsen2. Es ist klar geworden, dass Synapsen als ein Zwei-Kompartime-System gedacht werden können: ein präsynaptisches Fach mit Vesikeln für die Freisetzung von Neurotransmittern und ein postsynaptisches Fach mit Rezeptoren3. Diese vereinfachende Sichtweise hat sich in den letzten zwanzig Jahren zu einem komplexen Netzwerk von Proteinen entwickelt, die erforderlich sind, um die Senderbindung in die Signalisierung4zu transduzieren.
Die Gewinne im Verständnis sind teilweise auf Super-Resolution-Techniken zurückzuführen, die die Beugungsgrenze der konventionellen Lichtmikroskopie überschritten haben, um der Dimension der Synapsen besser5,6,7,8,9,10anzupassen. Aufgrund der Beugungsgrenze kann ein optisches Mikroskop seitlich keine Auflösung über 200 nmerreichen 11,12. Um diese Grenze zu umgehen, wurden Super-Resolution-Techniken entwickelt, die verschiedene Ansätze und verschiedene Sub-Diffraktions-Limit-Auflösungen erreichten: SIM, STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) und STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM verdoppelt die räumliche Auflösung laserbasierter Weitfeldmikroskopiesysteme, indem ein Beugungsgitter in den Anregungsstrahlpfad15eingebracht wird. Das bewegliche Gitter diffriert die Laserstrahlen, um ein bekanntes Beleuchtungsmuster zu erzeugen, in der Regel Streifen. Dieses zweckdienlich strukturierte Lichtmuster wird der unbekannten räumlichen Verteilung des Fluoreszenzfarbstoffs (der Probe) überlagert. Die Interferenzfranen, die durch die beiden Muster gebildet werden, kodieren für sonst ununterscheidbare Feine Details mit normaler Weitfeldmikroskopie. Das endgültige superaufgelöste Bild wird durch Die Kombination und Dekodierung mit mathematischen Methoden mehrere Rohbilder derselben Probe erhalten durch die Übersetzungen und Drehungen des Beugungsgitters erhalten. Die Auflösung der superaufgelösten Bilder erreicht 100 nm in der Seitlichen und 500 nm in axialen Richtungen für 2D-SIM15 oder 100 nm in der Seitlichen und 250 nm in axialen Richtungen für 3D-SIM16.
Das neue Verständnis der Synapse ist noch wichtiger angesichts der vielen neurologischen Störungen, bei denen synaptische Dysfunktion spielt eine wichtige Rolle bei Beginn und Progression17,18. Alzheimer-Krankheit, Down-Syndrom, Parkinson-Krankheit, Prion-Erkrankungen, Epilepsie, Autismus-Spektrum-Störungen und fragile x-Syndrom unter anderem wurden mit Anomalien in der synaptischen Zusammensetzung, Morphologie und Funktion19,,20,21,22verbunden.
Kürzlich haben wir mit einer Reihe von SUMO-spezifischen Antikörpern SIM verwendet, um die Kolokalisierung in primären Hippocampus-Neuronen der SUMO-Proteine mit den prä- und postsynaptischen Markern Synaptophysin und PSD95 auf Superauflösungsebene23zu zeigen. Dies ermöglichte es uns, biochemische und konfokale Mikroskopie-Beweise für die SUMO-Lokalisierung in Neuronen zu bestätigen.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Untersuchung der Lokalisierung von Proteinen in Maus-Hippocampus-Primärneuronen. Gleichzeitig kann dieses Protokoll an verschiedene Arten von primären neuronalen Kulturen angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>0,4 % Trypanblau-Lösung&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>70 & Mikro; m Filter&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>Alexa</td><td>Thermo Fisher Scientific-Antikörper</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Antikörper SENP1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-271360</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>B27 Ergänzung</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Chemisches</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin&nbsp;</td><td>Merck</td><td>5470</td><td>Chemisches</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck Life Science</td><td>21115</td><td>Chemisches</td></tr> Deckglas <tr><td></td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>DyLight</td><td>Thermo Fisher Scientific-Antikörper</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>FBS (Hyclone)</td><td>GIBCO</td><td>SH3007002 (CHA1111L)</td><td>Serum</td></tr><tr><td>FluoSpheres carboxylatmodifizierte Mikrosphären, 0,1 &mu; m, gelb&ndash; grün fluoreszierend</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F8803</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Merck Life Science</td><td>G8769</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>GIBCO</td><td>35050061</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck Life Science</td><td>H3537</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Merck Life Science&nbsp;</td><td>C6852-25g</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>Merck</td><td>AB15452</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>MEM&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>21575022</td><td>Medium</td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Merck Life Science</td><td>M8266</td><td>Chemie</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>VWR International</td><td>1,091,371,000</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Life Technologies</td><td>10888022</td><td>Medium</td></tr><tr><td>N-SIM Super Resolution Mikroskop</td><td>Nikon-Instrument</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Papain</td><td>Merck Life Science& nbsp;</td><td>P-3125</td><td>Chemisches</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Chemischer</td></tr><tr><td>Stift/Strep 10x</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Poly-L Lysin</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Glass Antifading Eindeckmittel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36970</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>PSD95&nbsp;</td><td>NeuroMab</td><td>K28/43</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Rundes Deckglas</td><td>Thermo</td><td>12052712</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>SUMO1</td><td>Abcam</td><td>ab32058</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Synaptophysin&nbsp;</td><td>Merck</td><td>S5768&nbsp;</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Merck</td><td>T8787</td><td>Chemischer</td></tr><tr><td>Trypsin-Inhibitor</td><td>Merck Life Science&nbsp;</td><td>T9003-500MG</td><td>Chemikalie</td></tr></tbody></table>

super-resolution imaging zur untersuchung der kolokalisierung von proteinen und synaptischen markern in primärer neuronen

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Synapsen sind die funktionellen Elemente von Neuronen und ihre Defekte oder Verluste sind die Grundlage für mehrere neurodegenerative und neurologische Erkrankungen. Bildgebende Studien werden häufig verwendet, um ihre Funktion und Plastizität unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Aufgrund ihrer Größe und Struktur erfordern Lokalisierungsstudien von Proteinen hochauflösende bildgebende Verfahren. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zur Untersuchung der Kolokalisierung von Zielproteinen mit synaptischen Markern in Primärneuronen auf einer Superauflösungsebene mittels strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (SIM). SIM ist eine gemusterte Lichtbeleuchtungstechnik, die die räumliche Auflösung der Weitfeldmikroskopie verdoppelt und ein Detail von etwa 100 nm erreicht. Das Protokoll gibt die erforderlichen Kontrollen und Einstellungen für robuste Co-Lokalisierungsstudien und einen Überblick über die statistischen Methoden zur korrekten Analyse der Bilddaten an.

Wir präsentieren hier den Standard-Workflow zur Kolokalisierung neuronaler Proteine. Wir haben zuerst das Mikroskop kalibriert und als nächstes die SIM-Analyse der Proben durchgeführt. Zur Kalibrierung des Systems verwendeten wir fluoreszierende Mikrosphären mit einem Durchmesser von 0,1 m. Nach dem Erhalt von super aufgelösten 3D-SIM-Bildern der Perlen werden die zugrunde liegenden Bilddaten Fourier-transformiert, um sie in eine räumliche Frequenzdarstellung umzuwandeln. In Abbildung 2Awird...

Dieses Protokoll zeigt, wie man eine hochauflösende Mikroskopie einsetzt, um die Proteinkolokalisierung in primären neuronalen Kulturen zu untersuchen.

Super-Resolution Imaging zur Untersuchung der Kolokalisierung von Proteinen und synaptischen Markern in primärer Neuronen

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Synapsen sind die funktionellen Elemente von Neuronen und ihre Defekte oder Verluste sind die Grundlage für mehrere neurodegenerative und neurologische Erkrankungen. Bildgebende Studien werden häufig verwendet, um ihre Funktion und Plastizität unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Aufgrund ihrer Größe und Struktur erfordern Lokalisierungsstudien von Proteinen hochauflösende bildgebende Verfahren.In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zur Untersuchung der Kolokalisierung von Zielproteinen mit synaptischen Markern in Primärneuronen auf einer Superauflösungsebene mittels strukturierter Beleuchtungsmikroskopie. SIM ist eine gemusterte Lichtbeleuchtungstechnik, die die räumliche Auflösung der Weitfeldmikroskopie verdoppelt und ein Detail von rund 100 Nanometern erreicht. Das Protokoll gibt die erforderlichen Kontrollen und Einstellungen für robuste Co-Lokalisierungsstudien und einen Überblick über die statistischen Methoden zur korrekten Analyse der Bilddaten an.Der Schlüssel zur Ermöglichung der Analyse auf einer Super-Resolution-Ebene sind jedoch die bei der Erfassung verwendeten Reagenzien, wie z. B. kammerförmige Abdeckungen und Montagelösungen, die mit dem Beugungsindex des Ziels kompatibel sind. Um eine Maus Hippocampus primäre Neuron zu erhalten, isolieren Hippocampi von P1 zu P4 Welpen. Plattenzellen bei 70.000 Zellen pro Brunnen bei einem Volumen von 200 Mikrolitern pro Brunnen.Warten Sie, bis die primären Neuronen des Hippocampus 12 bis 14 Tage nach der Beschichtung vollständig ausgereift sind, um Co-Lokalisierungsstudien durchzuführen. Fügen Sie 4%Paraformaldehyd, PFA, in PBS 200 Mikroliter pro Brunnen zu Neuronen, um sie schnell zu beheben. Entfernen Sie die Lösung und inkubieren Sie die Proben mit 1%rinderserumalbumin, BSA, in PBS bei 200 Mikroliter pro Brunnen für eine Stunde bei Raumtemperatur, um alle frei bindenden Oberflächen der Platte passiv mit einem irrelevanten Protein für die Analyse abzudecken.Ein BSA-basierter Blockierpuffer ohne Triton X-100 reduziert den Antikörperhintergrund effizienter als derselbe Puffer mit 0,2% Triton X-100. Fügen Sie den primären Antikörper hinzu. Als Negativkontrolle, fügen Sie keinen primären Antikörper zu einem der Brunnen.Mount zellen mit einem SIM-kompatiblen Mountant, z.B. ProLong Glass Antifade Mountant. Bedecken und schützen Sie die Zellen mit einem Deckglas, z.B. einem runden Deckglas mit einem Durchmesser von acht Millimetern.Quadratische können auch verwendet werden. Bewahren Sie die kammerförmigen Abdeckungen bei Raumtemperatur auf und warten Sie mindestens 48 Stunden, bevor Sie Bilder erfassen. Diamantglas erfordert mindestens zwei Tage aushärten, bevor Super-Resolution Akquisitionen.Verwenden Sie zwei Strategien, um die Spezifischenität des Antikörpers zu gewährleisten. Der erste ist die Verwendung von mindestens zwei verschiedenen Antikörpern, die auf dasselbe Substrat abzielen. Die zweite Strategie ist die Antikörperneutralisation durch Inkubation mit dem gereinigten Proteinziel oder die zur Erhöhung des Antikörpers.Wir verwenden routinemäßig ein N-SIM-Superauflösungsmikroskop von Nikon für unsere Analyse. Die folgenden Anweisungen sind für die Erfassung von SIM-Bildern unabhängig vom Einsatzmikroskop zu verwenden. Es ist auch wichtig, die Leistung des Mikroskops zu maximieren, um eine genaue Kalibrierung der Instrumente durchzuführen, einschließlich Korrekturring, Laserausrichtung und Gitterblockfokussierung.Vor der Erfassung von SIM-Bildern erfordert das System eine ordnungsgemäße Kalibrierung mit bestimmten Fluoreszenzperlen in Subauflösungsgröße. Ein Beispiel sind TetraSpeck-Mikrosphären. Diese Perlen sind mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt, um die Kalibrierung verschiedener Laser mit einer Probe zu ermöglichen.In einem Wasserbad etwa 1,8 mal 10 mal 10 Bis zu den 8. fluoreszierenden Mikrosphären für 10 Minuten beschallen. Verdünnen Sie die fluoreszierenden Mikrosphären eins zu 500 in doppelt destilliertem Wasser. Ein zweites Mal für weitere 10 Minuten beschallen.Pipette 15 Mikroliter der verdünnten Perlen in einen Brunnen eines kammerierten Deckelrutsches. Lassen Sie die Lösung fünf Minuten bei Raumtemperatur trocknen. Fügen Sie 10 Mikroliter der Montagelösung hinzu, z.B.ProLong Glass, und legen Sie einen acht Millimeter Abdeckungslip auf der Oberseite. Warten Sie mindestens 48 Stunden, um eine ordnungsgemäße Aushärtung zu ermöglichen. Schalten Sie das Mikroskop und die Laser ein.Lassen Sie das System aufwärmen, um das thermische Gleichgewicht aller Mikroskopkomponenten zu erreichen, und das SIM-Superauflösungsmikroskopsystem benötigt mindestens drei Stunden. Wählen Sie das 100X-Ziel aus. Starten Sie die Kalibrierung, indem Sie die Laser auf die Mitte des Beugungsgitterblocks ausrichten.Im N-SIM-System ermöglichen ein Mikrometerknopf und eine spezielle Kamera die Zentrierung der Lichtstrahlen zum Ziel. Legen Sie den kammerierten Deckelschlupf des Mikroskops zur Betrachtung ein. Stellen Sie das System auf die kammerierte Deckschdicke ein, indem Sie die objektive Korrekturabdeckung anpassen.NIS Software, die proprietäre Software, die mit N-SIM-Super-Auflösungsmikroskop-Systemen geliefert wird, verfügt über eine automatische Funktion, um die Korrektur von Farben zu regulieren. Passen Sie den Gitterblockfokus für jeden Kanal an, um eine fokussierte strukturierte Musterbeleuchtung auf der Probe zu gewährleisten. Die Software bietet eine automatische Funktion für diese Aufgabe.Erwerben Sie rohe 3D-SIM-Bilder der mehrfarbigen Mikrosphären. Berechnen Sie für jede einzelne Wellenlänge die Fourier-Transformation des superaufgelösten Bildes. Wenn das transformierte Bild kein korrektes blütenähnliches Muster erhält, starten Sie die Kalibrierung neu, da keine Superauflösung erreicht wurde.Wählen Sie im super aufgelösten Bild eine einzelne Mikrosphäre aus, und berechnen Sie ihr Intensitätsprofil für jeden Kanal, um die erreichte Auflösung zu messen. Es sollte nun in der Nähe von 100 Nanometern seitlich sein. Führen Sie die Kanalregistrierung durch Überlagern einer Mehrkanalerfassung der Mikrosphären durch.Ziel ist es, alle Kanalsignale seitlich und axial zu kollidieren. Dadurch werden chromatische Aberrationen aufgrund der Fehlausrichtung der verschiedenen Kanäle beseitigt und die Analyse der Kolokalisierung hilfreich. Bestätigen Sie die Qualität der Kalibrierung, indem Sie den Funktionen Beleuchtungsphasenschritt und Beleuchtungsmusterfokus von SIMcheck verwenden, einer Suite von Plugins für die Open-Source-Anwendung ImageJ.Beginnen Sie mit der Analyse der Probe mit einem 40-fachen Objektiv im konfokalen oder Weitfeldmodus. Dies ermöglicht die Navigation der Probe, die Aufrechterhaltung guter Details und ein großes Sichtfeld. Verwenden Sie das MAP2-Antikörpersignal, um einen Bereich zu erkennen, der neuronale Prozesse darstellt.Erfassen Sie Bilder der Probe im konfokalen Modus, um die Qualität der Färbung zu bestimmen. Wechseln Sie zum Ziel 100X. Öl auf das 100X-Objektiv auftragen.Erwerben Sie ein Weitfeld- oder Konfokalbild, das später verwendet wird, um die Qualität des superaufgelösten Bildes zu bewerten. Wechseln Sie in den 3D-SIM-Modus. Wählen Sie mithilfe von Dialogfenstern, um die Parameter für die Erfassung festzulegen, die höchste verfügbare Bittiefe aus, um Farbinformationen zu maximieren.In der Regel ist 16 Bit die Standardwahl. Um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, wählen Sie außerdem einen Niederfrequenzwert für die Erfassung, z. B. einen Megahertz. Mit Histogrammfenstern, setzen Sie die Laserleistung, um eine lineare Signalantwort zu erhalten, um Informationsverlust zu vermeiden, gesättigte Pixel in den Bildern zu begrenzen.Das N-SIM-System verwendet eine Andor iXon3 Kamera. Wählen Sie bei 16 Bit eine Zielintensität von 16.000 aus, um das lineare Ansprechen der Kamera sicherzustellen. Alternativ können Sie einen Bereich zwischen 30.000 und 45 000 auswählen, um den Dynamikbereich der Akquisitionen zu maximieren.Stellen Sie die Laserleistung zwischen 0,1 % und 50 % bei der Bildgebung der Proben und der Belichtungszeiten zwischen 50 Millisekunden und zwei Sekunden ein. Laserleistungen über 50% können zu einer schnellen Photobleichung der im Einsatz sindden Fluorophore führen. Beginnen Sie mit dem Erfassen der Bilder im 3D-SIM-Modus.Verwenden Sie SIMcheck, eine Suite von kostenlosen Plugins für ImageJ, um die Qualität der Erfassungen der Rohbilder zu bewerten. Wenn SIMcheck keine Artefakte oder Qualitätsprobleme erkennt, erfassen Sie mindestens 10 Bilder aus vollständigen technischen Replikationen, um statistische Analysen zu ermöglichen. Erworbene Bilder sind Rohdaten, die verarbeitet werden müssen, um rekonstruierte SIM-Bilder zu erhalten, die für weitere Analysen verwendet werden.Im Protokoll empfehlen wir, Synaptophysin und PSD-95 als Prä- und Post-Synaptische Marker zu verwenden. Es können jedoch zusätzliche Marker verwendet werden. Ein riesiger Teil der Literatur unterstützt die Verwendung anderer Proteine, wie Drebrin und Fagott als synaptische Marker.3D-SIM-Bilder sind Rohbilder, die verarbeitet werden müssen, um rekonstruierte, super aufgelöste Bilder zu erhalten. Eine falsche Rekonstruktion von Rohbildern kann zu Artefakten führen, die sich auf die Analyse der Proben auswirken würden. Daher sollte der richtigen Auswahl der Rekonstruktionsparameter große Aufmerksamkeit geschenkt werden.Verarbeiten Sie die Rohbilder mit der Mikroskop-Rekonstruktionsanalyse-Software, um ein super aufgelöstes Bild zu erhalten. Alternativ können Sie ein frei verfügbares ImageJ-Plugin fairSIM verwenden, um die Rohbilder zu rekonstruieren. Berechnen Sie die Fourier-Transformation der superaufgelösten Bilder mit der Mikroskop-Rekonstruktionssoftware oder dem ImageJ-Plugin SIMcheck.Ein gutes rekonstruiertes Bild sollte für jeden Kanal ein blumenartiges Bild zurückgeben. Wenn die rekonstruierten Bilder keine blumenähnliche Form wieder herstellen können, starten Sie die Rohbilder neu, und rekonstruieren Sie sie, indem Sie Rekonstruktionsparameter wie lineare Filterung, Apodisierung und Unterdrückung der Nullreihenfolge ändern. In der NIS-Software können Sie mithilfe der Vorschau überwachen, wie sich das Ändern der Parameter auf das endgültige aufgelöste Bild auswirkt, ändern Sie den Kontrast zur Beleuchtungsmodulation des Parameters, die hochauflösende Rauschunterdrückung und die Unterdrückung von Fokus.Analysieren Sie das rekonstruierte Bild, um Artefakte unvoreingenommen zu erkennen, indem Sie NanoJ-SQUIRREL, ein ImageJ-basiertes Plugin, verwenden, um die Qualität von super aufgelösten Bildern zu bewerten. In unserer Analyse der Co-Lokalisierung haben wir zwei Ansätze verwendet. Der erste ist ein visueller Ansatz, der auf der Profilanalyse basiert, die einzelne Ereignisse der Kolokalisierung anzeigt und den Beitrag jedes Kanals identifiziert.In einem ersten Schritt, um die Kolokalisierung zwischen synaptischen Markern und einem Protein von Interesse zu untersuchen, nehmen Sie ein super aufgelöstes Bild und analysieren Sie einen einzelnen Ort, um Signalüberlappungen zu bestimmen. Identifizieren Sie einen einzelnen Standort auf dem super aufgelösten Bild. Erhalten Sie die Intensitätsprofile der fluoreszierenden Signale zum Ort des Interesses.Wenn die Profilanalyse eine Single-Locus-Kolokalisierung vorgeschlagen hat, kann eine allgemeinere Analyse des gesamten Bildes durch Berechnung der Koeffizienten von Pearson und Mander durchgeführt werden. Verwenden Sie JACoP, ein ImageJ-Plugin, um zwei Parameter der Co-Lokalisierung zu bestimmen, Pearson es und Mander's. Nachdem wir das System kalibriert und die Qualität der rekonstruierten Bilder bewertet hatten, begannen wir als nächstes, die primären neuronalen Kulturen zu analysieren, die mit einem Antikörper gegen MAP2, einen neuronalen Marker, PSD-95, einen postsynaptischen Marker und unser Zielprotein SUMO1 gefärbt waren.Wir analysierten zuerst die Probe, die eine vierkanalige konfokale Mikroskopie mit einem 40-Fach-Objektiv durchführte. Bei der Auswahl eines Bereichs, der neuronale Prozesse darstellt, haben wir auf ein 100-Fach-Ziel umgestellt. Wir haben sowohl Konfokal- als auch SIM-Bilder aus dem gleichen Bereich erworben, um die Qualität der Rekonstruktion mit NanoJ-SQUIRREL zu bewerten und eine Co-Lokalisierungsanalyse durchzuführen.Die Aufklärung der Struktur und Zusammensetzung der Synapse ist entscheidend für das Verständnis sowohl physiologischer als auch pathologischer Prozesse, die Gedächtnis und Kognition regulieren. Während im normalen Zustand Synapsen sind die Bausteine des Gedächtnisses, Sie sind auch die Grundlage für komplexe neurologische Erkrankungen, wie eine der häufigsten Formen der Demenz Alzheimer-Krankheit. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Untersuchung der Proteinzusammensetzung von Synapsen mit einer superauflösenden Mikroskopietechnik, der so genannten strukturierten Beleuchtungsmikroskopie.

super-resolution-imaging-to-study-co-localization-proteins-synaptic

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Protokoll beschreibt, wie zu Synapse Anzahl sowohl in dissoziierten neuronalen Kultur und in Hirnschnitten mittels Immunzytochemie quantifizieren. Mit Fach-spezifische Antikörper, label wir präsynaptischen Terminals sowie Standorte der postsynaptischen Spezialisierung. Wir definieren Synapsen als Punkte der Kolokalisation zwischen den Signalen, die von dieser Marker erzeugt.

Die Quantifizierung der Synapsen: eine Immunzytochemie-basierten Assay zur Synapse Anzahl Quantify

Dieser Bericht zeigt eine Technik zur mechanischen Isolation von einzelnen Neuronen lebensfähig halten befestigt präsynaptischen boutons. Vibrodissociated Neuronen haben die Vorteile der schnellen Produktion, ausgezeichnete pharmakologische Kontrolle und verbesserten Raum-Klemme, ohne Einfluss von benachbarten Zellen. Diese Methode kann für die Bildgebung der synaptischen Elementen und Patch-Clamp-Aufzeichnung verwendet werden.

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Es wird ein Verfahren zur Markierung von Neuronen mit Fluoreszenzfarbstoffen in vorbestimmten funktionellen Mikrodomänen des Neokortex beschrieben. Zuerst wird intrinsische Signal Abbildungsoptik verwendet werden, um eine funktionelle Karte zu erhalten. Dann Zweiphotonenmikroskopie wird Etiketts und Bild Neuronen innerhalb eines Mikro-Domäne von der Karte verwendet.

Gezielte Labeling von Neuronen in einem bestimmten Functional Micro-Domäne des Neocortex durch Kombination Intrinsic Signal-und Zwei-Photonen-Imaging

Dieser Artikel beschreibt ein Arbeitsprotokoll, um Bild dendritischen Dornen von Neuronen im Hippocampus in vitro unter Verwendung Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-Resolution-Mikroskopie mit SIM bietet Bildauflösung deutlich über der Lichtbeugungsgrenze in allen drei Raumdimensionen, so dass die Abbildung der einzelnen dendritischen Dornen mit verbesserten Details.

Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

Wir beschreiben, wie die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM)-basierte Studien von Vesikeln in festen, kultivierten Neuronen zu implementieren. Schlüsselkomponenten unseres Protokolls gehören Kennzeichnung Vesikel mit photoconvertible Chimären, sammeln spärlich abgetasteten RAW-Bilder mit einer superauflösende Mikroskopie-System, und die Verarbeitung der RAW-Bilder, eine Super-Resolution-Bild zu erzeugen.

Super-Resolution Imaging neuronaler Dense-Core-Vesikel

Dieses Video zeigt das Kraniotomieverfahren, das die chronische Bildgebung von Neuronen im retrosplenialen Kortex der Maus mittels in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie in der transgenen Thy1-GFP-Linie ermöglicht. Dieser Ansatz wird mit der Injektion von mCherry-exprimierenden Adeno-assoziierten Viren in den dorsalen Hippocampus kombiniert. Diese Techniken ermöglichen eine langfristige Überwachung der erfahrungsabhängigen strukturellen Plastizität bei RSC.

Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

Hier zeigen wir , wie die Anzahl und die räumliche Verteilung der synaptischen aktiven Zonen in Drosophila melanogaster Photorezeptoren zu quantifizieren, markiert mit einem genetisch molekularen Marker codiert und deren Modulation nach längerer Einwirkung von Licht.

Analyse Synaptische Modulation von<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Photorezeptoren nach der Einwirkung von Längerer Licht

Hier beschreiben wir eine Vorgehensweise für Gewebe, clearing, fluoreszierende Kennzeichnung und umfangreiche Darstellung der Maus Hirngewebe, die dadurch ermöglicht die Visualisierung der dreidimensionalen Organisation der Zelltypen der Großhirnrinde.

Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex

Hier beschreiben wir einen quantitativen Ansatz zur Bestimmung der Verteilung der synaptischen Protein im Verhältnis zu einer Marker Protein mit Immunfluoreszenz-Färbung, konfokalen Mikroskopie und Computer-basierte Analyse.

Quantifizierung der heterogenen Verteilung der synaptischen Protein im Gehirn Maus mit Immunfluoreszenz

Hier zeigen wir, wie die Transfektion von primären hippokampalen Nagetierneuronen mit konfokaler Bildgebung in lebenden Zellen kombiniert werden kann, um pathologische Protein-induzierte Effekte auf den axonalen Transport zu analysieren und mechanistische Signalwege zu identifizieren, die diese Effekte vermitteln.

Verwendung von Lebendzell-Imaging zur Messung der Auswirkungen pathologischer Proteine auf den axonalen Transport in primären Hippocampus-Neuronen

Erfahren Sie die Super-Resolution-Mikroskopie zur Untersuchung der Protein-Kolokalisierung in primären Neuronen mit strukturierter Beleuchtung. Diese Methode erreicht eine Auflösung von etwa 100 Nanometern.

Super-Resolution Imaging zur Untersuchung der Kolokalisierung von Proteinen und synaptischen Markern in primärer Neuronen

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