Verbesserte UPLC-UV-Methode zur Quantifizierung von Vitamin C in Salatsorten(Lactuca sativa L.) und Crop Wild Relatives (Lactuca spp.)

Vitamin C ist ein Indikator für den Nährwert von Obst und Gemüse. Wir brauchen eine einfache und zuverlässige Methode, um sie zu quantifizieren, insbesondere im Salat, dem weltweit am meisten konsumierten Blattgemüse. Diese Methode verhindert den Vitamin-C-Abbau und bietet eine verbesserte Extraktion und eine schnelle, zuverlässige Quantifizierung von ascorbic und dehydroascorbic Säuren, dank seiner Genauigkeit und Empfindlichkeit.

Diese Methode kann in der Lebensmitteltechnologie verwendet werden, um Nährwertkennzeichnungen zu erstellen, in der Medizin, um die Auswirkungen von Lebensmitteln auf die Gesundheit und in der Pflanzenzüchtung zu untersuchen, um den Vitamin-C-Gehalt bei verschiedenen Arten zu erhöhen. Demonstrieren das Verfahren mit Ines Medina Lozano, wird Jose Angel Aranjuelo und Arantzazu Castellanos, zwei Analysten aus meinem Labor. Zur Vorbereitung der Pflanzenproben mindestens ein äußeres und ein inneres Blatt pro Pflanze ernten und die Blätter sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren, bevor Sie sie in eine Lagerung von minus 80 Grad Celsius geben.

Um die gefrorenen Pflanzenproben lyophilisieren, legen Sie die ungekapselten Probenröhrchen auf die Schalen in die Gefriertrocknerkammer des Lyophilisators und programmieren Sie den Lyophilisator, wie angegeben. Halten Sie die Kondensatortemperatur bei minus 80,2 Grad Celsius und die Vakuumkonstante bei 112 Wenn das Material vollständig trocken ist, fügen Sie den lyophilisierten Proben 10 Millimeter Durchmesser Edelstahlkugeln in 20 Milliliter Polypropylen-Rohren hinzu. Und verwenden Sie einen Multi-Tube Vortexer, zur richtigen Zeit und Intensität, um die Proben in einen Feinstaub zu schleifen.

Um Ascorbinsäure-Standardlager und Verdünnungslösungen herzustellen, wiegen Sie genau 10 Milligramm Ascorbinsäurestandard auf einer Präzisionswaage. Und bei 90 Millilitern mobiler Phase zur Probe. Verwenden Sie einen magnetischen Rührer, um die Probe aufzulösen, und verwenden Sie einen volumetrischen Kolben, um 100 Milliliter der resultierenden Lösung genau zu messen.

Hinzufügen von zusätzlichem Reinstwasser, das bei pH-Wert zwei mit Ameisensäure versauert wird, falls erforderlich. Bereiten Sie dann fünf Verdünnungen aus dem Bestand vor, um eine Kalibrierkurve zu erhalten. Arbeiten Sie unter einer niedrigen Lichtintensität, fügen Sie eine 50 Milligramm lyophilisierte Bodenprobe und fünf Milliliter Extraktionslösungsmittel zu einem 15 Milliliter Polypropylen Zentrifugenrohr und Wirbel die Lösung für fünf Sekunden.

Nachdem Sie die Probe 10 Minuten lang auf einem Orbital-Shaker bei 2000 Umdrehungen pro Minute geschüttelt haben, übertragen Sie das Rohr für 10 Minuten bei Raumtemperatur in ein Ultraschallbad und sammeln Sie die Probe durch Zentrifugation. Dann den Überstand durch einen 0,22 Mikron regenerierten Zellulosefilter in eine fünf Milliliter Bernsteindurchstechflasche abseihen, um sowohl die ascorbic als auch die dehydroascorbic Säuren in Extrakt eins zu extrahieren. Um die Verdünnung zur Bestimmung der Ascorbinsäurekonzentration in den Blattproben vorzubereiten, fügen Sie 200 Mikroliter Extrakt eins und 800 Mikroliter Reinstwasser in eine zwei Milliliter Bernstein-Flüssigkeitschromatographie-Durchstechflasche ein und schließen Sie die Durchstechflasche mit einem PTFE/Silikonstopfen.

Für die gesamte Ascorbinsäureextraktion 200 Mikroliter des Extrakts in eine zwei Milliliter Bernstein-Flüssigkeitschromatographie-Durchstechflasche übertragen und 200 Mikroliter Reduktionslösung in die Durchstechflasche geben. Schließen Sie die Durchstechflasche mit einem Stecker und Wirbel die Lösung für fünf Sekunden. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht, verwenden Sie 200 Mikroliter 0,4 Molschwefelsäure, um die Reaktion zu stoppen und die Ascorbinsäure zu stabilisieren, zu einem sauren pH-Wert.

Um die Verdünnung zur Bestimmung der gesamten Ascorbinsäurekonzentration in den Proben vorzubereiten, fügen Sie 400 Mikroliter Reinstwasser hinzu, um den gesamten Ascorbinsäureextrakt zwei zu erhöhen. Schließen Sie die Durchstechflasche mit einem Stecker. Bestätigen Sie mindestens eine Stunde vor Beginn des Experiments, dass alle Arbeitslösungen in das UPLC-System geladen wurden, und schalten Sie die drei UPLC-Module ein.

Wenn der interne Kalibrierungsprozess abgeschlossen ist, öffnen Sie die Software und laden Sie das Instrumentalprogramm. Sobald die Software geladen ist, klicken Sie auf Quaternary Solvent Manager und klicken Sie auf die rechte Maustaste, um Launch Console auszuwählen, um auf die UPLC-Verwaltungskonsole zuzugreifen. Klicken Sie auf System, Steuerung und Inbetriebnahme, um mit der Vorbereitung und Stabilisierung des UPLC-Instruments fortzufahren, und klicken Sie auf Prime Solvents, QSM, überprüfen Sie A, B, C, D, Seal Wash und Dauer von Prime, mehr als fünf Minuten, um alle UPLC-Leitungen für mindestens fünf Minuten zu säubern.

Klicken Sie auf SM, überprüfen Sie Wash Solvent größer als 45 Sekunden. Überprüfen Sie Lösungsmittel spülen und 35 Zyklen, um den Injektor zu reinigen und zu reinigen. Um die UPLC-Bedingungen auf Methodenbedingungen auszurichten, aktivieren Sie Equilibrate auf Methode und QSM, und legen Sie den Durchfluss auf 0,3 Milliliter pro Minute fest.

Lösungsmittel A bis 2% Lösungsmittel B bis 0%Lösungsmittel C 98% und Lösungsmittel D bis 0%Noch in Gleichgewicht auf Methode und SM und stellen Sie die Probe auf 5 Grad Celsius und die Säule auf 30 Grad Celsius. Wählen Sie in Equilibrate to Method and Other die Option Lampe Ein aus, und klicken Sie auf Start. Lassen Sie das Gerät für mindestens eine Stunde stabilisieren.

Um die Stabilität zu überprüfen, klicken Sie auf Konsolensystem und QSM starten und wählen Sie QSM-Systemdruck aus, nur um den Druck in der Spalte zu überprüfen. Wenn es keine identifizierbaren Trends in den Druckänderungen gibt und der Deltawert weniger als 10 Pfund pro Quadratzoll Druck beträgt, füllen Sie im Schnellstartbildschirm die Matrix mit den Namen der zu analysierenden Standards und Proben. Um die Ascorbinsäurekonzentration in den Normen zu bestimmen, injizieren Sie fünf Mikroliter jeder Verdünnung in das UPLC-Instrument und führen Sie die Chromatographie, beginnend mit den meisten verdünnten, bis zur konzentriertesten Lösung durch, wie in der Tabelle angegeben.

Um die Ascorbinsäure und die gesamtasebinsäureische Gesamtkonzentration in den Blattproben zu bestimmen, injizieren Sie fünf Mikroliter des verdünnten Extrakts eins bzw. extrahieren Sie zwei in das UPLC-Instrument für die chromatographische Analyse. Um die Ascorbinsäure- und Gesamt-Ascorbinsäurekonzentrationen zu berechnen, klicken Sie in der Software auf Quickstart, Browse Project, Channels, den Namen des Standards oder der Probe und PDA-Kanal eins, 245 Nanometer bei 1,2 Nanometern. Um die Standard- und Probenchromatogramme zu öffnen, klicken Sie auf den Startpunkt des Chromatogramms und ziehen Sie es an den Endpunkt, um den entsprechenden Peak in die Standards und Proben zu integrieren.

Verwenden Sie dann die Daten aus den Ascorbinsäure-Standardverdünnungen, um eine Kalibrierkurve zu erstellen, um die chromatographisch ermittelten Absorptionswerte darzustellen und die Absorptionswerte der Probe zu interpolieren, um die Ascorbinsäure und die Gesamtascorbinsäurekonzentration gemäß der Formel zu erhalten. Vitamin-C-Quantifizierung in Lactuca-Matrizen erfordert die Entwicklung eines chromatographischen Ansatzes, der zuverlässige Ergebnisse gewährleisten kann. Hierbei kann ein Chromatogramm beobachtet werden, das aus einem nicht optimierten Protokoll resultiert, das einen Ascorbinsäure-Peak darstellt, zusammen mit einer nicht identifizierten Bergmannsschulter.

Dennoch kann nach der Verbesserung der Extraktions- und chromatographischen Bedingungen ein gelöster Ascorbinsäurepeak ohne Interferenzen unbekannter Verbindungen erreicht werden. Darüber hinaus reduziert der Einsatz von UPLC-Ultraviolettgeräten anstelle von HPLC ultraviolett die Retentions- und Betriebszeiten. Interferenzen in Ascorbinsäurespitzen führen durchgängig zu einer Unterschätzung des Vitamin-C-Gehalts aufgrund einer unzureichenden Trennung während des chromatographischen Prozesses.

Da die überlappenden Spitzenbereiche durch einen vertikalen Tropfen an der tiefsten Stelle zwischen ihnen integriert werden. Darüber hinaus verhindert die Verwendung eines nicht optimierten Protokolls die Extraktion einer nützlichen Schlussfolgerung aus den Ergebnissen. Da alle Proben einen ähnlichen Vitamin-C-Gehalt zu haben scheinen, in jeder seiner Formen.

Im Gegensatz dazu ermöglicht die Verwendung des optimierten Protokolls die Erkennung statistisch signifikanter Unterschiede zwischen den verschiedenen Probentypen. Achten Sie darauf, mehrere Proben zu sammeln, um die Proben richtig zu konservieren, die Exposition der Probe gegenüber Oxidationsmitteln zu minimieren und beide Formen von Vitamin C zu quantifizieren. Der Gesamtgehalt an Vitamin C kann nicht nur in jeder Pflanzenart quantifiziert werden, sondern auch in allen Früchten in Obst und Gemüse oder sogar verarbeiteten Lebensmitteln mit wenigen Technikmodifikationen.