Differenzierung und Charakterisierung neuronaler Vorläufer und Neuronen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Neben dem Protokoll für die Differenzierung embryonaler Stammzellen der Maus in Neuronenzellen zeigen wir auch eine Reihe von Experimenten, die den Differenzierungsprozess umfassend analysieren können. Diese Techniken sind für die frühe ektodermale Embryonalentwicklung relevant und bieten Forschern die Möglichkeit, die Differenzierung von Neuronenzellen zu analysieren. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, mit Stammzellen in optimalem Zustand zu beginnen.

Daher ist es wichtig, dass die EBs, MPCs und Neuronen in frischen und optimalen Medien kultiviert werden. Die visuelle Demonstration dieses Protokolls ist wichtig, da es winzige Details enthält, die seinen Erfolg und seine Wirksamkeit beeinflussen können, insbesondere den Differenzierungsteil. Beginnen Sie mit der Einrichtung einer hängenden Tropfenzellkultur.

Für eine 10 Zentimeter große Zellkulturplatte stellen Sie die Konzentration auf 500 Zellen pro 20 Mikroliter Differenzierungsmedium ein. Bereiten Sie genügend Zellsuspension für 50 20-Mikroliter-Tröpfchen vor. Verwenden Sie eine Mikropipette oder eine Repetitionpipette, um 20 Mikroliter Zellsuspension auf den Deckel einer Gewebekulturplatte zu geben, und achten Sie darauf, dass die Tröpfchen nicht zu dicht beieinander liegen, um ein Verschmelzen zu verhindern.

Füllen Sie die Platte mit fünf bis 10 Millilitern PBS und setzen Sie den Deckel vorsichtig wieder auf die Platte. Inkubieren Sie die Kultur im 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Nach zwei Tagen sammeln Sie die Tröpfchen vom Deckel und legen Sie sie in eine 10 Zentimeter große Zellkultur-Suspensionsplatte, die mit 10 Millilitern Differenzierungsmedium gefüllt ist, und stellen Sie die Platte dann auf einen Orbitalschüttler, der im Inkubator auf niedrige Geschwindigkeit eingestellt ist.

Nach weiteren zwei Tagen zentrifugieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei 200 mal G und entfernen den Überstand. Um die Differenzierung des Embryoidkörpers in neurale Vorläuferzellen zu induzieren, suspendieren Sie die Zellen in einem Differenzierungsmedium mit fünfmikromolarer Retinsäure. Inkubieren Sie die Platte zwei Tage lang und ersetzen Sie dann die Hälfte des Mediums durch frisches Medium, indem Sie die Platte kippen und herauspipettieren.

Sammeln Sie die Zellen zwei Tage später, indem Sie sie drei Minuten lang bei 200 mal G zentrifugieren und den Überstand entfernen. Fixieren Sie die Embryoidkörper und neuralen Vorläuferzellen mit 4%PFA in PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie dann das PFA und waschen Sie die Zellen fünf Minuten lang in PBS.

Inkubieren Sie die Zellen seriell in PBS 10-, 20- und 30%igen Saccharoselösungen bei 25 bis 28 Grad Celsius, wobei jede Inkubation 30 Minuten oder länger dauert, bis sich die Zellen am Boden des Röhrchens absetzen. Und verwenden Sie es, um die Probe in die Mitte eines Kryomolds zu überführen und die überschüssige Flüssigkeit herauszupipettieren. Geben Sie vorsichtig die optimale Schnitttemperatur oder OCT-Lösung in die Form, ohne die Probe erneut zu suspendieren, und entfernen Sie dann überschüssige Blasen mit einer Pipette.

Legen Sie die Form mit der Probe 15 Minuten lang bei niedriger Geschwindigkeit auf einen Labormischer, wodurch sich die Embryoidkörper und neuralen Vorläuferzellen am Boden der OCT-Lösung absetzen. Frieren Sie die Probe dann schnell ein, indem Sie die Form in flüssigen Stickstoff legen. Blockieren Sie OCT-Schnitte oder Kulturkammern mit Neuronen in 10 % normalem Eselserum und 0,1 % Triton X-100 in PBS für eine Stunde bei Raumtemperatur.

Dann inkubieren Sie die Proben in Primärantikörpern, verdünnt in 5 % normalem Eselsserum und 0,05 % Triton X-100 in PBS, bei vier Grad Celsius über Nacht. Waschen Sie am nächsten Tag die Proben in PBS mit 0,1 % Triton X-100 dreimal fünf Minuten lang pro Waschgang. Inkubieren Sie sie mit einem Sekundärantikörper, verdünnt in 5 % normalem Eselserum und 0,05 % Triton X-100 in PBS, für eine Stunde bei Raumtemperatur.

Wiederholen Sie die Waschgänge in Triton X-100 und PBS und inkubieren Sie die Probe dann in einem Mikrogramm pro Milliliter DAPI. Montieren Sie die Probe mit einem Deckglas und etwas Eindeckmedium, lassen Sie sie trocknen und bilden Sie sie mit einem Fluoreszenzmikroskop ab. Um eine Neuronendifferenzierung durchzuführen, wurden E14-Zellen auf gammabestrahlten embryonalen Fibroblasten der Maus kultiviert, bis sich die Fibroblastenpopulation verdünnt hatte.

Die Pluripotenz der E14-Zellen wurde durch alkalische Phosphatase-Färbung bestätigt. Nach der Differenzierung hatten die embryonalen Körper eine runde Form, die kontinuierlich an Größe zunahm. Am Tag 10 hatten die neuralen Vorläuferzellen, die sich in Neuronen differenzierten, eine längliche Zellform.

Immunfluoreszenzexperimente wurden an neuralen Vorläuferzellen am achten Tag und an Neuronen am 12. Tag durchgeführt. Eine positive Färbung wurde für die Verschachtelung in neuralen Vorläuferzellen und für Neurofilamente in Neuronen beobachtet. Eine embryonale Stammzelllinie der Maus, die einen Sox1-Promotor-getriebenen GFP-Reporter exprimiert, wurde differenziert und eine Durchflusszytometrie an den embryonalen Stammzellen und neuralen Vorläuferzellen durchgeführt.

Es zeigte sich, dass 58,7 % der Gesamtzellen im NPC-Stadium GFP-positiv sind, während 0 % im ESC-Stadium GFP-positiv sind. RNA-Sequenzexperimente wurden an E14-embryonalen Stammzellen, Embryoidkörpern und neuralen Vorläuferzellen durchgeführt. Die Gene in der RNA-Sequenz-Heatmap wurden nach ihren Expressionsniveaus sortiert.

Die genontologische Analyse der vier Gencluster zeigte, dass sie unterschiedlichen zellulären Funktionen oder Signalwegen entsprechen. Bei der Durchführung dieses Protokolls sollte EBS als kugelförmige, geschwärzte Zellmassen erscheinen. Um sicherzustellen, dass EBS mit solchen wachsen, wechseln Sie das Medium am ersten Tag, wenn das Medium anfängt, gelblich zu werden.

Der gleiche Ansatz ist für die MPC-Kultur wichtig, da sich sowohl EBs als auch MPCs in einer kritischen Phase der frühen Embryonalentwicklung befinden. Andere funktionelle genomische Assays, wie z. B. ChIPseek und Chromatin-Bestätigungs-Capture-Assays aus den verschiedenen Stadien der Neuronendifferenzierung, können durchgeführt werden, um die zugrunde liegenden biologischen Prozesse zu verstehen. Die Integration chemischer und funktioneller Genomik-Assays in den Prozess der Neuronendifferenzierung ermöglicht es den Forschern, die molekularen Mechanismen der frühen Embryonalentwicklung besser zu beschreiben.