Name: Visualisierung der DNA-Reparaturproteine Interaktion durch Immunfluoreszenz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Erfahren Sie die indirekte Immunfluoreszenz zur Visualisierung von DNA-Reparaturproteinen in HeLa-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Analyse räumlicher und zeitlicher Proteinrekrutierung nach DNA-Schäden.

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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der San Antonio Area Foundation unterstützt. Das Mays Cancer Center wird vom NCI Cancer Center Support Core Grant P30 CA054174 unterstützt. Wir danken Stephen Holloway für seine Hilfe bei der Beschaffung der Reagenzien und dem Sung-Labor für die Bereitstellung von Platz- und Mikroskopiekapazitäten.

1. HeLa Zellkultur
<ol><li>Rundglasabdeckungen mit 1 M HCl bei 50 °C für 16-18 Stunden vorbehandeln. Mit ddH2O abspülen und in 100% EtOH lagern.</li>
	<li>Zellkulturmedium vorbereiten: 10% (v/v) FBS zu DMEM medium hinzufügen.</li>
	<li>4,0 x 104 Zellen/gut in steriler 12-Well-Platte mit einem 18 mm runden Glasdeckel bei 37 °C und 5%CO2 in einem befeuchteten Inkubator anbauen. Wachsen Sie Zellen bis zu 80% Koninfluenza (ca. 24 Stunden).</li>
</ol>2. Zellbehandlung mit Strahlung (IR)
<ol><li>Um die Bildung von Doppelstrangbrüchen zu induzieren, setzen Sie die Zellen einer 4 Gy-Bestrahlung aus (Kontrolle: Keine Bestrahlung, t=0). In der Gamma-Zelle -40 entspricht dies 4,54 min bei 0,815 Gy pro min.</li>
	<li>Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C und 5%CO2 in einem befeuchteten Inkubator für die entsprechende Zeitdauer (hier gewählte Zeitpunkte t=1, 2, 4, 16 h).</li>
</ol>3. Kernextraktion und Zellfixierung
<ol><li>Lagerlösungen vorbereiten: 0,2 M PIPES (pH 6,8), 5 M NaCl, 2 M Saccharose, 1 M MgCl2, 0,1 M EGTA (pH 8,0).</li>
	<li>Nukleare Extraktionspuffer (NEB) vorbereiten: 10 mM PIPES (pH 6.8), 100 mM NaCl, 300 mM Saccharose, 3 mM MgCl2,1 mM EGTA (pH 8,0) und 0,5% (v/v) Triton X-100 in ddH2O. Mix vollständig auflösen.</li>
	<li>4% (v/v) Paraformaldehyd (PFA) vorbereiten: 10 ml 16% PFA wässrige Lösung in 30 ml PBS auflösen. Mischen, bis vollständig aufgelöst.</li>
	<li>Zu einem geeigneten Zeitpunkt (t=0, 1, 2, 4, 16 h), Waschen Sie Zellen zweimal mit 1 ml PBS. Entfernen Sie PBS vollständig.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Brunnen 200 L NEB für die Zellkernextraktion hinzu (Zytoplasma ist abgebaut, nur Kern restiert) (Abbildung 2). 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und vollständig entfernen. HINWEIS: Nicht mehr als 2 Minuten.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61447/61447fig02.jpg"> Abbildung 2: Kerngewinnung. Repräsentative Bilder von Zellen vor (links) und Post (rechts) kernadierungsischer Extraktion. Zytoplasma sollte verdaut werden, aber die Kernstruktur sollte nach der Extraktion intakt bleiben (rechts). (A) 20-fache Vergrößerung; Skala bar = 20 m und (B) 40x Vergrößerung; Skalenbalken = 10 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61447/61447fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="6"><li>Waschen Sie Zellen mit 1 ml PBS. Entfernen Sie PBS vollständig. Fügen Sie PBS sorgfältig hinzu, Zellen sind bei diesem Schritt sehr zerbrechlich.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Bohrkörper 200 l von 4% (v/v) PFA für die Zellfixierung hinzu. 10 Minuten bei 4 °C inkubieren. Entfernen Sie PFA vollständig.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml PBS hinzu. HINWEIS: Zellen können in PBS bei 4 °C gelagert werden.</li>
</ol>4. Immunfluoreszenzfärbung
<ol><li>Vorbereiten der Blockierlösung: 5% BSA (w/v) in PBS auflösen und 0,3% (v/v) Triton X-100 hinzufügen. Mischen, bis vollständig aufgelöst.</li>
	<li>Verdünnungspuffer vorbereiten: 1% BSA (w/v) in PBS auflösen und 0,3% (v/v) Triton X-100 hinzufügen. Mischen, bis vollständig aufgelöst.</li>
	<li>Zum Blockieren fügen Sie jedem Bohrwert 200 L Blockierlösung hinzu. 2 Stunden bei Raumtemperatur oder 16-18 Stunden bei 4 °C inkubieren. HINWEIS: Wenn Ziegenantikörper verwendet werden, fügen Sie 5% Ziegenserum zur Blockierlösung hinzu.</li>
	<li>Primären Antikörper im Verdünnungspuffer (1:500; siehe Tabelle 2 für Antikörperliste) und Wirbel bis gut gemischt verdünnen. HINWEIS: Wenn Ziegenantikörper verwendet wird, fügen Sie 1% Ziegenserum zum Verdünnungspuffer hinzu.</li>
	<li>In einer Feuchtigkeits-/Inkubationsbox ein Stück Parafilm aufkleben. Fügen Sie 10 L primären Antikörper hinzu (in einem einzigen Tropfen). Richten Sie eine Kante des Deckels mit dem Tropfen aus und senken Sie langsam auf den Parafilm, damit sich die Flüssigkeit im ganzen ausbreitet (Blasen vermeiden, wenn möglich). 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie Deckellipsen dreimal in PBS für 1 Minute.</li>
	<li>Sekundärantikörper im Verdünnungspuffer (Endkonzentration: 2 g/ml) und Wirbel bis gut vermischt verdünnen.</li>
	<li>Tragen Sie 10 L sekundären Antikörper n. A. auf, wie für die primären Antikörper beschrieben. 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. HINWEIS: Schützen Sie sich vor Licht.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antikörper</td>
			<td>Unternehmen</td>
			<td>Verweis</td>
			<td>Quelle</td>
		</tr>
<tr>
<td>53BP1</td>
			<td>Zellsignalisierung</td>
			<td>4937</td>
			<td>Kaninchen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-Maus IgG H&amp;L (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150103</td>
			<td>Esel</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-Phospho-Histon H2A. X (Ser139), Klon JBW301</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td>Maus</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-Rabbit IgG H&amp;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150081</td>
			<td>Ziege</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Verwendete Antikörper. Liste der in dieser Studie verwendeten Antikörper.
<ol start="9"><li>Waschen Sie Deckellipsen dreimal in PBS für 1 Minute.</li>
	<li>Abdeckungen mit H2O 1 Minute waschen.</li>
	<li>Gegenfleck-DNA mit DAPI: 10 l 300 nM DAPI (wie für Antikörper beschrieben) auftragen, 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und dann mit einem Glyzerin-basierten Montagemedium auf Glasschlitten montieren. Alternativ können Sie einen Tropfen (10 l) kommerzieller Antifade-Montagemedien, die DAPI enthalten, auf ein Schiebeblatt geben und einen Deckelzettel auftragen. Drücken Sie vorsichtig den Deckelund entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit um sie herum mit einem Papiertuch.</li>
	<li>Versiegeln Sie Deckellipsen mit transparentem Nagellack und lassen Sie sie für 20 Minuten trocknen.</li>
	<li>Dias bei 4 °C lagern.</li>
</ol>5. Bildaufnahme
<ol><li>Legen Sie einen Tropfen Tauchöl auf die 60x Objektivlinse. Verwenden Sie DAPI, um die Kerne durch das Augenstück zu lokalisieren.<ol>
<li>Für die XYZ-Bildaufnahme, öffnen Sie die Erfassungssoftware und wählen Sie Parameter aus: Scannertyp: Galvano; Scanner-Modus: Roundtrip; Bildgröße: 512 x 512; PMT-Modus: VBF; PMT-Durchschnitt: Rahmen (4-mal); PMT-Sequenzseimscan: Zeile.</li>
		<li>Wählen Sie den Farbstoff und die Detektoren: Kanal (CH1), Farbstoff (DAPI), Detektor (SD1) Kanal (CH2), Farbstoff (Alexa Fluor 488), Detektor (HSD3) Kanal (CH3), Farbstoff (Alexa Fluor 647), Detektor (HSD4)</li>
		<li>Wählen Sie ON in "Z".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passen Sie das Livebild an. Drücken Sie die Live-Taste im Live-Fenster.<ol>
<li>Passen Sie den Fokus an und stellen Sie die Laserintensität (%), Empfindlichkeit (HV), Verstärkung und Versatz auf dem Werkzeugfenster "PMT" ein.<ol>
<li>Passen Sie die Laserintensität (%): für Helligkeit und Bleichen an. Je höher die Laserintensität, desto stärker das Signal, aber die Probe wird photobleicht.</li>
			<li>Einstellen der Empfindlichkeit (HV): Geräuschpegel. Je höher der HV, desto stärker das Signal, aber das Bild wird laut, wenn zu hoch. HINWEIS: Halten Sie die Spannung immer konstant.</li>
			<li>Passen Sie den Offset: Hintergrundebene an.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Wählen Sie Start/Ende (15 Slices) für Z-Stacks aus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Starten Sie die Erfassung.<ol>
<li>Wählen Sie den Ordner zum Speichern von Bildern aus. Drücken Sie die LSM-Starttaste, um mit dem Aufnehmen des Bildes zu beginnen. Drücken Sie die Taste Series Done, um die Bildaufnahme abzuschließen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Datenanalyse
<ol><li>Öffnen Sie zur Bildanalyse die Analysesoftware.<ol>
<li>Drücken Sie das Werkzeugfenster Batch, wählen Sie die zu analysierenden Bilder aus, und wählen Sie den Ausgabeordner aus.</li>
		<li>Drücken Sie das Werkzeugfenster Analyse, und wählen Sie Projektion aus (zeigt die maximale Intensitätsprojektion aus 15 Slices an).</li>
		<li>Wählen Sie unter Eingabe-/Ausgabeeinstellungden erstellten Stapel aus.</li>
		<li>Drücken Sie Prozess für die Verarbeitung von Bildern.</li>
		<li>Exportieren Sie Bilder als .tiff-Dateien.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Für die Quantifizierung von Kernschwerpunkten, öffnen Sie CellProfiler.<ol>
<li>Öffnen Sie die Pipeline für die Quantifizierung von H2AX und 53BP1 (siehe Ergänzende Informationen).</li>
		<li>Zeichnen Sie Daten mithilfe einer Tabellensoftware.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Öffnen Sie CellProfiler für die Analyse der Co-Lokalisierung.<ol>
<li>Öffnen Sie die Colokalisierungspipeline (siehe Ergänzende Informationen). Eine Tabellenkalkulationsdatei wird erstellt und am bevorzugten Speicherort gespeichert. Diagramme selbst werden jedoch nicht automatisch gespeichert. Es wird empfohlen, eine Momentaufnahme der Fenster zu machen, um die Ergebnisse aufzuzeichnen.</li>
		<li>Zeichnen Sie Daten mithilfe einer Tabellensoftware.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Analyse des Timings und der Effizienz der Reparatur von DNA-Schäden durch Mikroskopie hat sich als wesentlich erwiesen, um zu verstehen, wie die DNA-Reparaturmaschinerie funktioniert, in normalen Zellen und in menschlichen Pathologien wie Krebs.
Die Entwicklung spezifischer Antikörper, die den Nachweis aktivierter Proteine in ihrer phosphorylierten Version ermöglichen (z. B. H2AX, pRPA, pRAD50 und andere10,23,<sup class=...

Menschliche Zellen sind ständig einer Vielzahl von DNA-schädigenden Wirkstoffen unterschiedlicher Herkunft ausgesetzt. Exogene Quellen bestehen hauptsächlich aus der Exposition gegenüber Strahlungen, Chemikalien (einschließlich Chemotherapeutika und einigen Antibiotika) und Viren, während die wichtigsten endogene Quellen Fehler bei der DNA-Replikation und oxidativem Stress umfassen. Die direkten Auswirkungen einer genotoxischen Exposition können je nach Stress und Expositionsdosis von einer modifizierten Basis bis hin zu einem potenziell tödlichen DNA-Doppelstrangbruch (DSB) reichen. Letztlich können nicht reparierte oder falsch reparierte DNA-Schäden zur Anhäufung von Mutationen, genomischen Umlagerungen, Genominstabilität und schließlich zu Karzinogenese1führen. Säugetierzellen haben komplexe Wege entwickelt, um bestimmte Arten von DNA-Schäden zu erkennen2,3 und reparieren sie rechtzeitig, synchronisiert mit dem Zellzyklusprogression.
Ionisierende Strahlung (IR) schädigt die DNA-Doppelhelix und erzeugt Doppelstrangbrüche (DSBs), eine der schädlichsten Formen von DNA-Schäden. Der MRN-Komplex (MRE11, RAD50, NBS1) fungiert als Sensor der DNA endet und aktiviert die Proteinkinase ataxia telangiectasia mutiert (ATM)4,5. Nach der ersten Aktivierung von ATM durch DNA-Ende löst ATM eine Kaskade von DDR-Ereignissen am Ort der Pause aus, die mit einem Schlüsselereignis die Phosphorylierung der Histonvariante H2AX6einlöst. Die H2AX-Phosphorylierung auf Rückstand S139 aktiviert sie in die Region H2AX und spannt Regionen bis zu Megabasen um die DNA-Läsion6,7,8,9. Dieses Ereignis erhöht die Zugänglichkeit der DNA, was zur Rekrutierung und Akkumulation anderer DNA-Reparaturproteine führt7. Da h2AX reichlich und spezifisch um d.B. heruminduziert ist, kann es mit spezifischen Antikörpern leicht visualisiert werden und wird häufig als Ersatzmarker für DSBs im DNA-Reparaturfeld verwendet. Sobald der Bruch signalisiert ist, aktivieren Zellen ihre DNA-Reparaturwege und verarbeiten die DNA-Schäden. Das Protein MDC1 (Mediator des DNA-Schadens-Checkpoint-Proteins101) bindet direkt mit AtM11 und auch mit NBS112,13. Es trägt dazu bei, die Konzentration des MRN-Komplexes am DSB zu erhöhen und eine positive ATM-Rückkopplungsschleife zu starten. H2AX wird nach der Reparatur des Bruchs schnell entfernt, so dass die DSB-Freigabe überwacht werden kann. Gefolgt von der Mikroskopie, bietet die Abnahme von H2AX im Laufe der Zeit eine indirekte Messung von Restbrüchen und DNA-Reparatureffizienz.
Eukaryotische Zellen können DSBs durch mehrere Wege reparieren, wobei die beiden wichtigsten nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) und homologe Rekombination (HR)(Abbildung 1) sind. NHEJ liiert im Wesentlichen DNA-Doppelstrangenden ohne die Verwendung von erweiterter Homologie und arbeitet im gesamten Zellzyklus14,15. HR überwiegt in S- und G2-Phasen und wird ansonsten unterdrückt, da es ein Schwesterchromatid als homologe Schablone für die Reparatur14,16benötigt. Die Wahl des Weges zwischen NHEJ und HR hängt nicht nur von der physischen Nähe des Schwesterchromatids ab, sondern auch von der Ausdehnung der DNA-Endresektion17, die NHEJ hemmt.
Die homologieabhängige DSB-Reparatur initiiert durch nukleolytische Degradation des 5'-Strangs von den Bruchenden, um 3' einsträngige DNA-Schwänze (ssDNA) zu erzeugen, ein Prozess, der als 5'-3'-Resektion bezeichnet wird. Der MRN-Komplex initiiert die DNA-Endresektion und weitere Resektion wird in Kombination mit BLM/EXO1 (Bloom-Syndrom-Protein/Exonuklease 1) oder BLM/DNA2 (DNA-Replikation ATP-abhängige Helicase/Nuklease)18,19,20,21,22verarbeitet. Die DNA-Endresektion wird durch CtIP (CtBP-interagierendes Protein) durch seine direkte Interaktion mit dem MRN-Komplex23 und die Rekrutierung von BRCA1 (Brustkrebs Typ 1 Anfälligkeitsprotein)24,25verstärkt. Replikationsprotein A (RPA) bindet sich prompt an die ssDNA exponiert und wird dann durch das rekombinante Protein RAD51 zu einem Nukleoprotein-Filament verdrängt, das homologe Suche und Stranginvasion katalysiert26,27,28.
Die Einleitung der Resektion ist ein entscheidender Schritt für die Reparaturwegwahl. Sobald die Resektion eingeleitet wurde, werden die DNA-Enden zu schlechten Substraten für die Bindung durch Ku70/Ku80-Heterodimer (Komponente des NHEJ-Signalwegs) und Zellen werden HR17,29,30verschrieben. Der Ku70/Ku80 Heterodimer bindet an DSB-Enden und rekrutiert DNA-PKcs und p53 Binding Protein 1 (53BP1)29,30. 53BP1 wirkt als Hemmungshindernis in G1 und blockiert damit HR beigleichzeitigerFörderung von NHEJ 31,32, wird aber in der S-Phase in BRCA1-abhängiger Weise entfernt, so dass eine Resektion33,34möglich ist. Daher spielen 53BP1 und BRCA1 bei der DSB-Reparatur eine gegensätzliche Rolle, wobei 53BP1 ein NHEJ-Moderator ist, während BRCA1-Akte Pausen für die Reparatur durch HR ermöglichen.
Im Labor kann die DSB-Bildung durch ionisierende Strahlung (IR) induziert werden. Während dieses Beispiel eine hohe Dosis von 4 Gy verwendet, 1 Gy und 2 Gy auch eine signifikante Menge an DSBs erstellen, geeignet für die Analyse der Foci-Bildung durch reichliche Proteine. Es ist wichtig zu beachten, dass die Art und Dosis der verwendeten Strahlung zu verschiedenen Läsionen in der DNA und in der Zelle führen kann: Während IR DSBs induziert, kann es auch einzelne Strangbrüche oder Base-Modifikation verursachen (siehe35,36 für einen Verweis auf bestrahlung lineare Energieübertragung (LET) und Art der DNA-Schäden). Um die Kinetik der ionisierenden strahlungsinduzierten Brennweite (IRIF) Bildung und deren Clearance zu bestimmen, die auf die Reparatur des Schadens und die Umkehrung der aktivierten DDR8,9,37,38hinweist, kann die Brennpunktbildung zu verschiedenen Zeitpunkten nach ionisierender Strahlung überwacht werden. Timing der Aktivierung und Clearance aller wichtigen DNA-Schäden Proteine ist bekannt39, und viele werden als Ersatzmarker für Schlüsselereignisse untersucht. Beispielsweise wird pRPA, das eine hohe Affinität zu ssDNA besitzt, als Ersatz für die Bruchresektion verwendet, MRN-Proteine (MRE11, RAD50, NBS1) und Exonukleasen können auch verwendet werden, um die Resektionseffizienz zu bewerten. Während RAD51, BRCA1, BRCA2 (Brustkrebs Typ 2 Anfälligkeitsprotein) und PALB2 (Partner und Lokalisierer von BRCA2) überwacht werden können, um die HR-Effizienz zu bewerten, wird das Vorhandensein der Ku-Proteine oder 53BP1 als Marker von NHEJ(Abbildung 1)verwendet.
Während sich Proteine der DNA-Reparaturmaschinen gegenseitig bis zum Bruch rekrutieren und in Superkomplexen zusammensetzen, können DNA-Protein- und Protein-Protein-Wechselwirkungen abgeleitet werden, indem man ihrer individuellen Lokalisierung im Laufe der Zeit folgt und die Kolokalisierung von Proteinen analysiert, wie durch überlappende Signale in Zelle40,41,42visualisiert. In Zelllinien ermöglicht die Einführung von Punktmutationen oder das Löschen in bestimmten DNA-Reparaturgenen entweder durch Genombearbeitung oder durch Überexpression plasmidbasierter Mutanten die Untersuchung spezifischer Rückstände und ihre mögliche Rolle bei der Erkennung von DNA-Schäden (z. B. Kolokalisierung mit H2AX) oder komplexer Montage (Kolokalisierung mit einem anderen oder mehreren Proteinen) sowie deren Auswirkungen auf die DNA-Reparatur. Hier verwenden wir die indirekte Immunfluoreszenz als Mittel, um die Bildung und Auflösung von DSBs zu untersuchen, indem wir im Laufe der Zeit den H2AX-Brennpunkten folgen. Wir stellen auch ein Beispiel für die Foci-Bildung und Co-Lokalisierungsanalyse durch einen wichtigen Akteur in der DSB-Reparatur vor: p53 Binding Protein 1 (53BP1)32. Wie bereits erwähnt, 53BP1 gilt als zentral für DNA-Reparatur-Pfad Wahl. Nach 53BP1 Akkumulation und seine Co-Lokalisierung mit H2AX liefert wertvolle Informationen über Zellzyklusphase, DNA-Schadensakkumulation, und Weg verwendet, um DSBs zu reparieren. Der Zweck der indirekten Immunlokalisierung besteht darin, die Effizienz der REPARATUR von DNA-Schäden in Zelllinien nach IR wie in dieser Studie oder nach Exposition gegenüber verschiedenen Belastungen in der Zelle von der DNA-Vernetzung bis zur Blockierung der Replikationsgabel zu bewerten (eine Liste der DNA-schädlichen Mittel ist in Tabelle 1enthalten).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61447/61447fig1v2.jpg"> Abbildung 1: DNA Double Strand Breaks (DSB) Reparaturwege. Die DSB-Reparatur umfasst zwei Hauptwege: Homologe Rekombination (HR, links) und Non-Homologous End-Joining (NHEJ, rechts). Nach der Pause werden Proteine aktiviert, um den Bruch zu markieren (H2AX), an der Endresektion (MRN) teilnehmen, die resezierte ssDNA (pRPA) beschichten, die Rekombination fördern (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) oder die Resektion begrenzen und NHEJ (53BP1) fördern. Andere Proteine nehmen an der Schadensreparatur teil, aber die aufgeführten Proteine werden routinemäßig mit indirekter Immunfluoreszenz gefolgt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61447/61447fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>DNA-schädigendes Mittel</td>
			<td>Wirkmechanismus</td>
			<td>Empfohlene Dosis</td>
		</tr>
<tr>
<td>A-Strahlen/Röntgenstrahlen</td>
			<td>Strahlung Bildung von doppelsträngigen Brüchen mit einigen unkontrollierten zellulären Effekten</td>
			<td>1-4 Gy</td>
		</tr>
<tr>
<td>
36 Ar ionen</td>
			<td>Strahlung Bildung von Doppelstrandedpausen</td>
			<td>270 keV/m</td>
		</tr>
<tr>
<td>•Partikel</td>
			<td>Strahlung Bildung von Doppelstrandedpausen</td>
			<td>116 keV/m</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bleomycin</td>
			<td>Inhibitor der DNA-Synthese</td>
			<td>0,4-2 g/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Camptothecin</td>
			<td>Inhibitor der Topoisomerase I</td>
			<td>10-200 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cisplatin</td>
			<td>Alkylierungsmittel (induzierenintrastrande Querverbindungen)</td>
			<td>0,25-2 m</td>
		</tr>
<tr>
<td>Doxorubicin</td>
			<td>Intercalating-Agent Inhibitor der Topoisomerase II</td>
			<td>10-200 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Etoposide</td>
			<td>Inhibitor der Topoisomerase II</td>
			<td>10 m</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hydroxyurea</td>
			<td>Inhibitor der DNA-Synthese (durch Ribonukleotid-Reduktase)</td>
			<td>10-200 m</td>
		</tr>
<tr>
<td>Methylmethansulfonat</td>
			<td>Alkylierungsmittel</td>
			<td>0,25-2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mitomycin C</td>
			<td>Alkylierungsmittel</td>
			<td>0,25-2 m</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ultraviolettes (UV) Licht</td>
			<td>Bildung von Thymidin-Dimeren (Erzeugung von Verzerrungen der DNA-Kette)</td>
			<td>50-100 mJ/cm2
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Genotoxische Mittel. Beispiele für DNA-schädigende Mittel, deren Wirkmechanismus und der verursachte Schaden auf der Grundlage der vorgeschlagenen Arbeitskonzentration.

<table><tbody><tr><td>16 % (v/v) Paraformaldehyd (PFA) wässrige Lösung</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15710</td><td>Die Mikroskopiequalität des PFA sorgt für beste Bilder. Bei Verwendung von "hausgemachtem PFA" vor Gebrauch filtern.</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td> Es <td>wird eine Hitzeschockfraktion empfohlen, um Niederschlag/Hintergrund zu vermeiden.</td></tr><tr><td>Deckglas #1, 18 mm rund (Deckgläser)</td><td>Neuvitro</td><td>NC0308920</td><td>Deckgläser müssen vor der Verwendung mit HCl oder Ethanol gereinigt und sterilisiert werden.</td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt [(+) 4,5 g/L D-Glukose, (+) L-Glutamin, (-) Natriumpyruvat]</td><td>Gibco</td><td>11965118</td><td>Passen Sie das Kultursubstrat an die Bedürfnisse der verwendeten Zelllinie an.</td></tr><tr><td>DPBS, kein Calcium, kein Magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>PBS für die Gewebekultur.</td></tr><tr><td>Ethylenglykol-bis(&beta;-aminoethylether)-N,N,N&prim;,N&prime;-tetraessigsäure (EGTA)</td><td>Research Products International</td><td>E57060</td><td>Puffer für die nukleare Extraktion.</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>104370028</td><td>Die Qualität von FBS kann durch Testen der Bildung von gH2AX-Herden beurteilt werden. Wenn Spuren von genotoxischem Endotoxin in der Charge vorhanden sind, ist gH2AX ohne Stress positiv.</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid (MgCl2)</td><td>Research Products International</td><td>M24000</td><td>Nuklearer Extraktionspuffer.</td></tr><tr><td>Piperazin-N,N&prime;-bis(2-ethansulfonsäure) (PIPES)</td><td>Research Products International</td><td>P40150</td><td>Nuklearer Extraktionspuffer.</td></tr><tr><td>Stattdessen kann SlowFade Diamond Antifade Eindeckmittel mit DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>S36973</td><td>300 nM DAPI mit VECTASHIELD Antifade Eindeckmedium verwendet werden.</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Research Products International</td><td>S23020</td><td>Nuklearer Extraktionspuffer.</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Research Products International</td><td>S24060</td><td>Nuklearer Extraktionspuffer.</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Objektträger</td><td>Fisherbrand</td><td>1255015</td><td>Polysine Objektträger können stattdessen verwendet werden.</td></tr><tr><td>TC-behandelte Mehrfach-Well-Platten, Größe 12 Wells</td><td>Costar</td><td>3513</td><td>Die Aussaat auf Deckgläsern erfolgt in 12-Well-Platten.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AmericanBio</td><td>AB02025</td><td>Extraktionspuffer für Kernkraftwerke.</td></tr><tr><td>Stattdessen kann TrypLE Express Enzyme (1X), kein Phenolrot,</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td>Trypsin-EDTA verwendet werden.</td></tr><tr><td>Stattdessen kann Trypsin-EDTA (0,5%), kein Phenolrot</td>, <td>Gibco</td><td>15400054</td><td>TrypLE verwendet werden.</td></tr></tbody></table>

visualisierung der dna-reparaturproteine interaktion durch immunfluoreszenz

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Säugetierzellen sind ständig Chemikalien, Strahlungen und natürlich vorkommenden metabolischen Nebenprodukten ausgesetzt, die bestimmte Arten von DNA-Beleidigungen erzeugen. Genotoxische Wirkstoffe können das DNA-Rückgrat beschädigen, es brechen oder die chemische Natur einzelner Basen verändern. Nach DNA-Beleidigung werden DNA-Schadensreaktionen (DDR) aktiviert und an der Reparatur beteiligte Proteine rekrutiert. Eine Vielzahl von Faktoren sind beteiligt, um die Art des Schadens zu erfassen und die entsprechende Reparaturreaktion zu aktivieren. Wenn DDR-Faktoren nicht richtig aktiviert und rekrutiert werden, kann dies zu genomischer Instabilität führen, die vielen menschlichen Pathologien einschließlich Krebs zugrunde liegt. Studien mit DDR-Proteinen können Einblicke in die genotoxische Arzneimittelreaktion und zelluläre Mechanismen der Arzneimittelresistenz liefern.
Es gibt zwei Hauptmethoden zur Visualisierung von Proteinen in vivo:direkte Beobachtung, indem das Protein von Interesse mit einem fluoreszierenden Protein getagt und ihm durch Live-Bildgebung oder indirekte Immunfluoreszenz auf festen Proben folgt. Während die Visualisierung fluoreszierender Proteine eine präzise Überwachung im Laufe der Zeit ermöglicht, kann die direkte Kennzeichnung in N- oder C-Terminus die Proteinlokalisierung oder -funktion beeinträchtigen. Die Beobachtung von Proteinen in ihrer unveränderten, endogenen Version wird bevorzugt. Wenn DNA-Reparaturproteine zur DNA-Beleidigung rekrutiert werden, erhöht sich ihre Konzentration lokal und sie bilden Gruppen oder "Foci", die durch indirekte Immunfluoreszenz mit spezifischen Antikörpern visualisiert werden können.
Obwohl der Nachweis von Proteinschwerpunkten keinen endgültigen Beweis für eine direkte Wechselwirkung liefert, weist die Kolokalisierung von Proteinen in Zellen darauf hin, dass sie sich an die Schadensstelle gruppieren und über die Abfolge der Ereignisse informieren können, die für eine komplexe Bildung erforderlich sind. Eine sorgfältige Analyse der räumlichen Überlappung von Brennpunkten in Zellen, die Wildtyp- oder mutierte Versionen eines Proteins exdrücken, kann wertvolle Hinweise auf funktionelle Domänen liefern, die für die DNA-Reparaturfunktion wichtig sind. Schließlich weist die Kolokalisierung von Proteinen auf mögliche direkte Wechselwirkungen hin, die durch Ko-Immunpräzipation in Zellen oder direkten Pulldown mit gereinigten Proteinen verifiziert werden können.

Am Tag 2 oder 24 h nach der Aussaat von Zellen auf Deckellips haben die Zellen eine Teilung durchlaufen und sind zu 80% konfluent. Spezifische Knockdowns oder Mutationen in DNA-Reparaturproteinen können die Verdoppelungszeit erhöhen oder Zellen für eine genotoxische Behandlung sensibilisieren, und die Saatdichte sowie die Behandlungsdosen sollten entsprechend angepasst werden. Um die besten Arbeitsbedingungen zu bestimmen, kann der Zeitpunkt der Reaktion auf DNA-Schäden durch Western-Blotting von H2AX im Laufe der Zeit e...

Nach DNA-Schäden aktivieren menschliche Zellen wichtige Reparaturwege, um die Integrität ihres Genoms wiederherzustellen. Hier beschreiben wir die Methode der indirekten Immunfluoreszenz als Mittel, um DNA-Reparaturproteine zu erkennen, ihre räumliche und zeitliche Rekrutierung zu analysieren und die Protein-Protein-Interaktion an den Stellen von DNA-Schäden zu begutachten.

Visualisierung der DNA-Reparaturproteine Interaktion durch Immunfluoreszenz

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

Indirekte Immunfluoreszenz ermöglicht den Nachweis von DNA-Reparaturproteinen, Fotos von räumlicher und zeitlicher Rekrutierung und hilft bei der Verhör von Proteinprotein-Wechselwirkungen an der Stelle von DNA-Schäden. Nach DNA-Schäden werden DNA-Reparaturproteine zur DNA-Beleidigung rekrutiert, während ihre Konzentration lokal zunimmt, und sie bilden Gruppen, die als Brennpunkte bezeichnet werden und durch indirekte Immunfluoreszenz an festen Proben visualisiert werden können. Diese Technik kann verwendet werden, um Protein-Schwerpunkte zu erkennen, sowie um die Kolokalisierung der Gegenwart in Zellen zu quantifizieren.Dies kann helfen, die Abfolge der Ereignisse zu erklären, die für komplexe Bildung und DNA-Reparatur erforderlich sind. aus solchen Experimenten können besondere Proteinprotein-Wechselwirkungen entstehen. Demonstriert wird das Verfahren von Barbara De La Pena, einem sehr talentierten Postdoc-Foto aus meinem Labor Begin, indem es 40.000 HeLa-Zellen in jeder weit über 12 Wellplatte mit einem 18-Millimeter-Rundglasdeckel zu 80% Konfluenz anwächst.Nachdem Sie die Zellen vier grauen Gammabestrahlungen aussetzen, waschen Sie sie zweimal mit einem Milliliter PBS. Entfernen Sie dann die PBS vollständig und fügen Sie 200 Mikroliter NDB zu jedem Brunnen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für zwei Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie dann die NDB.Beachten Sie, dass die Inkubationszeit je nach Zelllinie variieren kann, aber in der Regel zwei Minuten nicht überschreiten sollte. Waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter PBS. Entfernen Sie dann die PBS vollständig und fügen Sie 200 Mikroliter 4%PFA zu jedem Brunnen für die Zellfixierung hinzu.Inkubieren Sie die Zellen für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie dann die PFA und fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter PBS hinzu. Entfernen Sie PBS vollständig und fügen Sie dann 200 Mikroliter Blockierlösung zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie die Zellen für zwei Stunden bei Raumtemperatur oder 16 bis 18 Stunden bei vier Grad Celsius.den primären Antikörper und Verdünnungspuffer verdünnen und wirbeln, bis er gut in einer Feuchtigkeitsbox vermischt ist, und hier ein Stück Parafilm und fügen Sie 10 Mikroliter Primärantikörper in einem einzigen Tropfen hinzu. Richten Sie eine Kante des Deckels aus dem Brunnen mit dem Tropfen aus und senken Sie ihn langsam auf den Parafilm, der die Flüssigkeit ausbreitet. den Deckelrutsch für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.Nach der Inkubation waschen Sie die Abdeckung rutscht dreimal in PBS für eine Minute pro Wäsche. den sekundären Antikörper und Verdünnungspuffer verdünnen und so lange verdünnen, bis gut vermischt 10 Mikroliter Sekundärantikörper auf jeden Deckelschlupf auftragen, wie zuvor beschrieben, und inkubieren Sie ihn für zwei Stunden bei lichtgeschützter Raumtemperatur. Waschen Sie die Abdeckung rutscht dreimal mit PBS und einmal mit Wasser für eine Minute pro Wäsche.Dann montieren Sie sie auf Glasschlitten mit einem Glyzerin-basierten Montagemedium mit DAPI-Dichtungsabdeckungsschlipsen mit transparentem Nagellack und lassen Sie sie 20 Minuten trocknen. Legen Sie einen Tropfen Tauchöl auf die 60 x Objektivlinse und verwenden Sie DAPI, um die Kerne durch das Okular für die XYZ-Bildaufnahme zu lokalisieren, die Erfassungssoftware zu öffnen und den Scannertyp als galvano den Scannertyp als Roundtrip und 512 x 512 Bildgröße einzustellen. Im PMT-Bedienfeld modus auf VBM Durchschnitt auf Frame und sequenzielle Scan to Line.Als nächstes stellen Sie die Farbstoffe und Wärmedetektoren Kanal eins auf DAPI und SD eins, Kanal zwei auf alexafluor 488 und HSD drei und Kanal drei auf alexafluor bei 647 und HSD vier wählen Sie auf Z.To das Live-Bild einzustellen, drücken Sie die Live-Taste auf dem Live-Fenster und den Fokus einstellen. Verwenden Sie dann das PMT-Werkzeugfenster, um die Laserintensitätsempfindlichkeit, Verstärkung und Versatz Einstellung Für z-Stacks, Start-to-Ende und 15 Slices festzulegen. Wählen Sie den Ordner aus, um Bilder zu speichern, und drücken Sie die LSM-Starttaste, um mit dem Erfassen zu beginnen.Wenn Sie fertig sind, drücken Sie die Taste "Serie getan", um die Bildaufnahme abzuschließen. Öffnen Sie die Analysesoftware, drücken Sie dann das Batch-Tool-Fenster und wählen Sie die zu analysierenden Bilder aus. Wechseln Sie zum Analysewerkzeugfenster, und wählen Sie die Projektion aus, die die maximale Intensitätsprojektion aus 15 Slices anzeigt.Wählen Sie unter der Eingabeausgabeeinstellung den erstellten Stapel und den Ausgabeordner aus. Drücken Sie den Prozess, um Bilder zu verarbeiten, und exportieren Sie die Bilder als TIFF-Dateien. Führen Sie die kerntechnische Quantifizierung mit zellprofiler nach Manuskriptrichtungen durch.Zellen, die nicht mit der Strahlung behandelt werden, weisen nur sehr wenige Gamma-H2AX-Expozeichen auf. In Ermangelung wesentlicher DNA-Reparaturproteine kann die Gamma-H2AX-Akkumulation bei DNA-Brüchen beobachtet werden. Die Akkumulation von nicht reparierten Brüchen kann dazu führen, dass Zellen durch feste Gamma-H2AX-Kerne vor hypotonisch werden.Nach der Bestrahlung weisen Die Kerne eine große Anzahl von Doppelsträngigenaufbrüchen auf, zu denen Gamma H2AX extrem schnell lokalisiert. Während in Ermangelung einer Strahlung nur wenige, wenn überhaupt, Brennpunkte beobachtet werden, wurde die Anzahl der Brennpunkte bei zwei vier und 16 Stunden nach einer Strahlung und für die NOA-Strahlungskontrolle quantifiziert. Abhängig von der erhobenen biologischen Frage und der Art der erforderlichen Daten sollten verschiedene Darstellungsoptionen als Kolokalisierung betrachtet werden, die durch Multiplexieren primärer Antikörper untersucht werden kann, die in verschiedenen Tierarten aufgezogen werden und sekundäre Antikörper verwenden, die mit ausgeprägten Fluorophoren gekennzeichnet sind.Überlagerung von grün und rot, führt zu gelben Hotspots, die beiden Proteine von Interesse sind in den gleichen Pixeln vorhanden. Quantitative Analysen der Kolokalisierung können durch einen objektbasierten Ansatz oder durch einen statistischen Ansatz erreicht werden, der auf einer Intensitätskorrelationskoeffizienten-basierten Analyse basiert. Eine Kombination von primären Antikörpern, die in verschiedenen Tierarten aufgezogen werden, kann in diesem Protokoll verwendet werden.Stellen Sie sicher, dass die Antikörper kompatibel sind und sich nicht gegenseitig stören. Sie müssen den sekundären Antikörper, der gegen jeden der primären Antikörper verwendet werden soll, entsprechend einstellen und bei der Auswahl der weniger zu verwendenden Kraft eine bestimmte spektrale Überlappung berücksichtigen. Kolokalisierung oder Proteine weisen auf mögliche direkte Wechselwirkungen hin.Dies kann durch granulare Ausfällung in Zellen oder durch direkten Absetzen mit gereinigten Proteinen in vitro überprüft werden.

visualization-of-dna-repair-proteins-interaction-by-immunofluorescence

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video beschreiben wir die Immunfluoreszenzmethode, um die Lokalisation der DNA-Reparaturproteine γH2AX und 53BP1 an den Stellen von Doppelstrang-DNA-Brüchen in bestrahlten Zellkernen sichtbar zu machen.

Immunfluoreszenz-basierte Visualisierung von DNA-Reparaturprotein-Interaktionen

In diesem Video beschreiben wir die Immunfluoreszenzmikroskopie-Technik zum Nachweis spezifischer DNA-Schadensreaktionsproteine, die an den Stellen von DNA-Doppelstrangbrüchen in menschlichen mononukleären Zellen lokalisiert sind. Die Proteine werden von spezifischen Primärantikörpern erkannt, die wiederum an Fluorophor-markierte Sekundärantikörper binden, die während der mikroskopischen Visualisierung fluoreszieren, was die Visualisierung der Proteine als unterschiedliche Fluoreszenzherde...

Immunfluoreszenzmikroskopie zur Analyse von DNA-Doppelstrangbrüchen

Elektronenspektroskopische Bildgebung kann Nukleinsäuren und Proteine mit Nanometerauflösung abbilden und unterscheiden. Es kann mit dem miniSOG-System kombiniert werden, das in der Lage ist, markierte Proteine in Transmissionselektronenmikroskopie-Proben spezifisch zu markieren. Den Einsatz dieser Technologien veranschaulichen wir am Beispiel von Doppelstrangbruch-Reparaturschwerpunkten.

Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine ​​in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)

Hier wird gezeigt, wie der in situ Proximity Ligation Assay (PLA) verwendet werden kann, um die direkten Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen ATM und p53 in Suspensionszellkulturen, die genotoxischen Stress ausgesetzt sind, zu detektieren und zu visualisieren.

Nachweis und Visualisierung von DNA-schadeninduzierten Proteinkomplexen in Suspensionszellkulturen unter Verwendung des Proximity Ligation Assays

Laser Microirradiation ist ein nützliches Werkzeug für Studien zur DNA-Reparatur in lebenden Zellen. Ein methodischer Ansatz für die Nutzung der UVA Laser induzieren verschiedene DNA-Läsionen wird angezeigt. Wir haben eine Methode zur lokalen Microirradiation optimiert, die den normalen Zellzyklus unterhält; so fahren Sie bestrahlte Zellen durch Mitose.

Fortgeschrittene Mikroskopiertechniken der konfokalen zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und die Kinetik bei DNA-Läsionen

Diese Handschrift enthält ein Protokoll für die Analyse von DNA-Doppel-Strangbrüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1.

Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 für die Analyse der Bildung und Reparatur der DNA Double-Strand Breaks

DNA-Schäden reparieren Kinetik Studium erfordert ein System zur Läsionen an definierte Sub-atomaren Regionen zu induzieren. Wir beschreiben eine Methode zum Erstellen von lokalisierter Doppelstrang-Pausen mit einem konfokale Laserscanning-Mikroskop ausgestattet mit einem 405 nm-Laser und bieten automatisierte Verfahren zur Quantifizierung der Dynamik der Reparatur Faktoren bei dieser Läsionen.

Untersuchung von Protein-Rekrutierung, DNA-Läsionen mit 405 Nm Micro-Laserbestrahlung

Reparatur von Doppel-Strang DNA-Brüchen ist ein dynamischer Prozess, erfordern nicht nur Bildung von Reparatur-komplexen in den Pausen, sondern auch deren Auflösung nach die Läsion gerichtet ist. Hier verwenden wir Immunfluoreszenz-Mikroskopie für vorübergehende und dauerhafte Doppelstrang-Brüche als Werkzeug dieses Genom-Wartung-Mechanismus zu sezieren.

Charakterisierung von DNA-Reparaturprozesse bei Transienten und langlebige Doppel-Strang DNA-Brüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie

Die strahlungsinduzierte DNA-Schadensreaktion, die durch Neutronen-Mischstrahl aktiviert wird, das in der Bor-Neutronen-Capture-Therapie (BNCT) verwendet wird, ist nicht vollständig etabliert. Dieses Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren zum Nachweis von strahlungsinduzierten Brennpunkten (RIF) von Reparaturproteinen durch Immunfluoreszenzfärbung in menschlichen Darmkrebszelllinien nach Bestrahlung mit dem Neutronenmischstrahl.

Immunfluoreszenz Bildgebung von DNA-Schäden und Reparatur-Fozien in menschlichen Darmkrebszellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Bewertung von DNA-Schadensreparaturproteinen in von Patientinnen stammenden Ovarialkarzinom-Organoiden. Dazu gehören umfassende Plattierungs- und Färbemethoden sowie detaillierte, objektive Quantifizierungsverfahren.

Visualisierung von Proteinen zur Reparatur von DNA-Schäden in patienteneigenen Ovarialkarzinom-Organoiden mittels Immunfluoreszenz-Assays

Das folgende Protokoll zeigt den Nachweis einzelsträngiger DNA-Foci in der G1-Phase des Zellzyklus unter Verwendung von Zellzyklussynchronisation, gefolgt von RPA2-Immunfluoreszenzfärbung.

Visualisierung einzelsträngiger DNA-Herde in der G1-Phase des Zellzyklus

Erfahren Sie die indirekte Immunfluoreszenz zur Visualisierung von DNA-Reparaturproteinen in HeLa-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Analyse räumlicher und zeitlicher Proteinrekrutierung nach DNA-Schäden.

Visualisierung der DNA-Reparaturproteine Interaktion durch Immunfluoreszenz

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