Name: Kultur und Assay von großflächigen Caenorhabditis elegans-Populationen im gemischten Stadium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Erfahren Sie die Kultur großflächiger Caenorhabditis elegans-Populationen für Omics-Forschung mit minimaler Manipulation. Diese Methode ermöglicht vergleichende Analysen und zuverlässige Dokumentation des Populationswachstums.

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Wir danken den Mitgliedern des Edison Lab für hilfreiche Diskussionen und Rückmeldungen zu diesem Manuskript; insbesondere B.M. Garcia. Einige Stämme wurden vom CGC zur Verfügung gestellt, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird, und ceNDR, das von NSF Living Collections CSBR 1930382 finanziert wird. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des NIH (U2CES030167) unterstützt.

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Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Eine Vielzahl von Gefäßen kann als LSCP verwendet werden. In diesem Protokoll wurde eine Standard-Glasbackform verwendet. Die verwendeten LSPCs hatten Außenmaße von 35,56 x 20,32 cm, Innenmaße von 27,94 x 17,78 cm und ca. 4,45 cm Tiefe und wurden mit einem eingebauten Deckel geliefert. Daher wurde die Menge der hier verwendeten Bakterien für ein LSCP mit den oben genannten Abmessungen optimiert, um eine große Population von Mischwurmen zu erhalten. Bakterienvolumen und -konzentration können an die experimentellen Bedürfnisse angepasst werden.
Eine Kontamination durch Schimmelpilze, Pilze oder andere Bakterienquellen kann bei jedem Schritt der LSCP-Methode auftreten, also behandeln Sie proben mit Vorsicht. Bevor Sie mit einem Schritt im Protokoll beginnen, stellen Sie sicher, dass der Arbeitsbereich mit 70% Ethanol und 10% Bleichmittel gereinigt wird. Falls verfügbar, behandeln Sie gebrauchte Bereiche 30 Minuten lang mit UV-Licht und schalten Sie 30 Minuten vor Beginn jedes Schritts einen HEPA-Luftfilter ein.
Durch den Anbau des LSCP in einer kontrollierten Umgebung(d. h.in einem CT-Raum bei 20 °C) kann der Benutzer das Wachstum der Probe leichter verfolgen und eine mögliche Kontamination dokumentieren. Wenn die Oberfläche des LSCP kontaminiert wird, schneiden Sie entweder die Kontamination nach Möglichkeit aus und lassen Sie die Probe weiter wachsen oder entsorgen Sie die Probe, wenn die Kontamination nicht kontrolliert werden kann. Es ist unerlässlich, die Kontamination schnell anzugehen, um unerwünschtes Wachstum zu reduzieren und sicherzustellen, dass es nicht mit Würmern um Ressourcen übertrifft.
Diese Methode ist für diejenigen gedacht, die großflächige Mischkulturen von C. elegans anbauen möchten. Obwohl es möglich sein könnte, synchronisierte Populationen von Würmern auf dem LSCP zu züchten, wie es auf kommerziell erhältlichen Petrischalen und in flüssiger Kultur der Fall ist, haben die Autoren diese Option nicht getestet. Wenn Benutzer in einer bestimmten Stichprobe durchschnittlich mehr als etwa 2,4 Millionen Würmer züchten möchten, wird eine andere Methode empfohlen4. Der Wachstumserfolg hängt von der Sorte ab, die in der Pipeline verarbeitet wird. Die Autoren konnten erfolgreich Populationen von etwa 2,4 Millionen Würmern in mindestens fünf biologischen Replikaten von 15 C. elegans-Stämmen züchten, was darauf hindeutet, dass die Methode robust ist.
Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, beachten Sie, dass das Alter und die Gesundheit eines bestimmten Wurms die Fruchtbarkeit und die anschließende Populationswachstumszeit beeinflussen können. Stellen Sie sicher, dass Würmer unter gesunden Bedingungen mit minimalem Stress gehalten werden, bevor sie in dieser Pipeline verwendet werden. Es wird davon ausgegangen, dass Stammproben erstellt, eingefroren und bei -80 °C gehalten wurden, um die genetische Drift im Laufe der Zeit zu reduzieren.
Abhängig von den Bedürfnissen eines bestimmten Experiments kann die Anzahl der beginnenden graviden Erwachsenen auf einem LSCP geändert werden. Die Änderung der Anzahl der beginnenden graviden Erwachsenen auf dem LSCP wird die Wachstumsrate und damit die Zeit bis zur Ernte verändern. Fünf gravidierte Erwachsene werden verwendet, um jeden LSCP aus folgenden Gründen zu säen: (1) Eine einfache, schnelle und effiziente Möglichkeit, viele C. elegans-Stämme gleichzeitig auf LSCPs zu säen, war erforderlich und (2) um die Altersunterschiede zwischen den ausgewählten graviden Erwachsenen zu reduzieren, die zu der Wachstumsheterogenität führen könnten.
Diese Methode ermöglicht es dem Benutzer, große Populationen von Würmern mit allen Lebenszyklusstadien zu ernten. Mit den derzeit verfügbaren Methoden erfordert das Sammeln von großräumigen Proben von C. elegans eine Bleichsynchronisation, um die Anzahl der Würmer zu erhalten, die für nachgelagerte Arbeiten gewünscht werden. Mit diesem Ansatz kann man jetzt so viele Würmer wie bisher in Fermentern oder großen Flüssigkulturen züchten, ohne die Schwierigkeiten, die mit der Bleichmittelsynchronisation und mehreren Handhabungsschritten verbunden sind. Unser Protokoll ermöglicht es, Stämme von Interesse effizient anzusprechen, minimale Handhabungszeit für das Wachstum der Probe selbst zu verwenden und Stadien von Würmern oder der Population nach Bedarf in nachgelagerten Pipelines zu isolieren.
Ein LPFC wurde als Werkzeug verwendet, um die Populationsverteilung und -größe in einem bestimmten LSCP zu dokumentieren. Das verwendete LPFC ist ein kontinuierliches Durchflusssystem, das Würmer basierend auf ihrer Größe (TOF) und optischen Dichte analysiert, sortiert und dosiert. Wenn ein bestimmter Wurm die Durchflusszelle passiert, erfasst der axiale Lichtverlustdetektor die Menge an Signallicht, die von einem 488-nm-Festkörperlaser blockiert wird, für die Dauer, die ein Wurm benötigt, um durchzufahren, und gibt dem Benutzer die TOF und optische Dichte des Wurms. Fluoreszenzsammeloptiken und -detektoren können auch verwendet werden, um die Fluoreszenzempfindlichkeit und -sammlung an jeder Probe zu maximieren. LpFC-Sammlungsparameter variieren je nach Instrument. Benutzer können eine Vielzahl von Plattformen verwenden, um die Wurmgröße zu erfassen, und sind nicht auf die Verwendung dieses Protokolls beschränkt, wenn kein LPFC verfügbar ist.
Die Autoren verwenden Proben, die in der hier beschriebenen Methode gezüchtet wurden, um unbekannte Metaboliten in verschiedenen Stämmen von C. elegans mittels Flüssigkeitschromatographie – Massenspektrometrie, NMR-Spektroskopie und RNA-Sequenzierung – zu identifizieren. Die Autoren planen, diese Methode weiterhin für das Wachstum von Proben in dieser Pipeline mit einer Vielzahl von C. elegans-Stämmen zu verwenden, da neue Stämme von Interesse mit dieser Pipeline leicht verarbeitet werden können.

C. elegans ist ein kleiner freilebender Fadenwurm, der auf der ganzen Welt in einer Vielzahl von natürlichen Lebensräumen vorkommt1. Seine relative Leichtigkeit des Wachstums, schnelle Generationszeit, Reproduktionssystem und transparenter Körper machen es zu einem leistungsstarken Modellorganismus, der in entwicklungsbiologischer, alternder, neurobiologischer und genetik weit verbreiteter2,3untersucht wurde. Die umfangreichen Arbeiten zu C. elegans machen es zu einem Hauptkandidaten für -omics-Studien, um Phänotypen umfassend mit komplexen biologischen Komponenten und ihren Beziehungen in einem bestimmten Organismus zu verknüpfen.
Um C. elegans in der kollaborativen -Omics-Forschung zu verwenden, wird eine Methode benötigt, um große gemischtstufige Populationen von Tieren zu generieren, bei denen eine einzelne Probe aufgeteilt und über verschiedene Plattformen und Instrumente für vergleichende Analysen verwendet werden kann. Die Erstellung einer Pipeline zur Generierung einer solchen Stichprobe erfordert ein ausgeprägtes Bewusstsein für Ernährung, Umwelt, Stress, Bevölkerungsstruktur sowie Probenhandhabung und -sammlung. Daher ist es entscheidend, standardisierte und reproduzierbare Kultivierungsbedingungen in große Rohrleitungen zu integrieren. In der Forschung von C. elegans werden zwei traditionelle Methoden verwendet, um Würmer zu züchten - Agar-Petrischalen und Flüssigenkultur4.
Historisch gesehen, wenn große Mengen von C. elegans benötigt werden, werden sie in flüssiger Kultur angebaut4. Die Schritte, die an der Erzeugung einer großen Population von Würmern in flüssiger Kultur beteiligt sind, erfordern mehrere Handhabungsschritte, die oft eine Bleichsynchronisation beinhalten, um gravidierte erwachsene Nagelhaut zu reißen und Embryonen freizusetzen, um die gewünschte Populationsgröße zu erreichen. Wenn jedoch Bleichsynchronisation verwendet wird, hängt das Bevölkerungswachstum von der Größe der Beginnenden Volkszählung ab und wirkt sich daher auf das nachfolgende Wachstum und die Bevölkerungszahlen aus. Darüber hinaus variieren C. elegans-Stämme in ihrer Nagelhautempfindlichkeit, Expositionszeit und Stressreaktion auf Bleichmittelsynchronisation, was es schwierigmacht,viele Stämme gleichzeitig zu bestimmen5,6,7,8,9.
Darüber hinaus erfordert das Wurmwachstum in flüssiger Kultur ein paar Transferschritte, da es oft empfohlen wird, vor der Ernte nur eine Generation von Würmern anzubauen, da eine Überfüllung leicht auftreten kann, wenn sie über mehrere Generationen angebaut wird und trotz der Anwesenheit von Nahrung zu einer dauerhaften Bildung führt10. Dauerbildung erfolgt durch kleine Signalmoleküle wie Ascaroside, oft als "Dauerpheromone" bezeichnet11,12,13,14, werden in flüssige Medien freigesetzt und beeinflussen das Wachstum der Bevölkerung. Darüber hinaus führt das Wachstum großer Wurmpopulationen in flüssiger Kultur zu einer übermäßigen Bakterienansammlung in der Kultur, was zu Schwierigkeiten führt, wenn eine saubere Probe für nachgeschaltete phänotypische Assays benötigt wird. Schließlich, wenn eine flüssige Kultur kontaminiert wird, ist es schwieriger zu erhalten, da Pilzsporen oder Bakterienzellen leicht in den Medien verteilt werden15.
Die andere traditionelle Methode des Anbaus von C. elegans ist auf Agar Petrischalen. Kommerziell erhältliche Petrischalen ermöglichen es, problemlos mehrere Generationen von Würmern im gemischten Stadium zu züchten, ohne die schnellen Auswirkungen von Überfüllung und hoher Dauerbildung, wie sie in flüssigen Kulturen beobachtet werden. Ein Nachteil des Wurmwachstums auf herkömmlichen Agar-Petrischalen ist jedoch, dass die größte kommerziell erhältliche Petrischale keine großen Wurmpopulationen für eine -omics-Studie liefert, ohne einen Bleichmittelsynchronisationsschritt hinzuzufügen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kultivierung von Populationen von C. elegans im gemischten Stadium auf Agar-Petrischalen besser geeignet ist, um -omics-Daten zu sammeln, aber wir benötigten eine Methode, um sehr große Populationsgrößen ohne flüssige Kultivierung zu erzeugen.
Hier stellen wir eine Methode vor, um große C. elegans-Populationen im gemischten Stadium auf großräumigen Kulturplatten (LSCP) zu kulturieren und zu sammeln. Das Sammeln von Proben durch diese Pipeline liefert genügend Proben, um phänotypische und Populationsdaten zu sammeln, zusammen mit allen Daten, die für -Omics-Experimente benötigt werden(z. B.Genomik, Transkriptomik, Proteomik und Metabolomik). Darüber hinaus erfordert die LSCP-Methode eine minimale Manipulation der Tiere, weniger Vorbereitungszeit für den Benutzer, bietet eine strenge Umweltkontrolle und stellt sicher, dass die Handhabung jeder Probe während der gesamten Studie konsistent ist, um die Reproduzierbarkeit insgesamt zu gewährleisten.

<table><tbody><tr><td>10 mL sterile serologische Pipetten</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>10-ul-Pipettenspitzen</td><td>VWR</td><td>89079-438</td><td></td></tr><tr><td>100-ul-Pipettenspitzen</td><td>VWR</td><td>89079-442</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL Graduierter Zylinder</td><td>VWR</td><td>10124-380</td><td></td></tr><tr><td>1000 ul Pipettenspitzen</td><td>VWR</td><td>89079-488</td><td></td></tr><tr><td>15-mL konische Röhren</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>190 Proof Ethanol</td><td>VWR</td><td>89125-166</td><td></td></tr><tr><td>2 L Breithals-Erlenmeyer-Flasche</td><td>VWR</td><td>75804-654</td><td></td></tr><tr><td>50-mL konische Röhren</td><td>VWR</td><td>75874-294</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>05040-100G</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539-500G</td><td></td></tr><tr><td>BVC Control G Fluid Aspiration System</td><td>Vacuubrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Sigma</td><td>C3045-25G</td><td></td></tr><tr><td>Clorox-Bleichmittel</td><td>VWR</td><td>89414-502</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturraum zur Kontrollkontrolle</td><td>Viron</td><td></td><td>https://www.conviron.com/environmental-rooms</td></tr><tr><td>Corning Low Volume 384 Well Black mit klarem, flachem Boden Polystyrol TC-behandelte Mikroplatte</td><td>VWR</td><td>89089-866</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Accuspin 3R</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flachbodenplatte mit 24 Bohrlöchern</td><td>VWR</td><td>29443-952</td><td></td></tr><tr><td>Honeywell True HEPA Purifier 465 sq ft.</td><td>Home Depot</td><td>204390560</td><td></td></tr><tr><td>HT115 E. coli (DE3)</td><td>CGC</td><td>HT115(DE3)</td><td>https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3)</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR</td><td>470224-038</td><td></td></tr><tr><td>Großskalige Kulturplatte (LSCP)</td><td>Pyrex</td><td>1090948</td><td>Pyrex 2-Quart-Glasaufbereitungsform mit rotem Deckel</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Sigma</td><td>C86677-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>VWR</td><td>97062-998</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop-Plain-Objektträger</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td></td></tr><tr><td>Millipore-Filter</td><td>Millipore</td><td>1.11727.2500</td><td></td></tr><tr><td>Molekulare Geräte ImageXpress</td><td>Molekulare Bauelemente</td><td>Modellnummer: IXMConfocal</td><td>https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref verwendeten die Autoren MetaXpress Software Version 6.5.4.532</td></tr><tr><td>Nystatin (10 mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>N6261-25MU</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Sigma</td><td>P7750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen (6 cm)</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenregler</td><td>VWR</td><td>613-4180</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Fisher</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat-Monobas</td><td>VWR</td><td>0781-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potasssiumhydroxid</td><td>Fisher</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>Rote fluroszente Mikrosphären</td><td>Polywissenschaften</td><td>19507-5</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma</td><td>746398-500G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Fisher</td><td>111357</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat dibasisisch anhydriert</td><td>Fisher</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Standard-Gilson-Pipettensatz</td><td>Gilson</td><td>FA10002M, FA10004M, FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin (100 mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>S6501-25G</td><td></td></tr><tr><td>Union Biometrica COPAS BioSorter</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td>https://www.unionbio.com/biosorter/ verwendeten die Autoren: Flow Pilot Software Version 1.6.1.3.</td></tr></tbody></table>

kultur und assay von großflächigen caenorhabditis elegans-populationen im gemischten stadium

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) war und ist ein wertvoller Modellorganismus zur Untersuchung von Entwicklungsbiologie, Alterung, Neurobiologie und Genetik. Die umfangreiche Arbeit an C. elegans macht es zu einem idealen Kandidaten, um es in großpopulationige Ganztierstudien zu integrieren, um die komplexen biologischen Komponenten und ihre Beziehungen zu einem anderen Organismus zu sezieren. Um C. elegans in der kollaborativen -Omics-Forschung zu verwenden, wird eine Methode benötigt, um große Populationen von Tieren zu generieren, bei denen eine einzelne Probe auf verschiedene Plattformen für vergleichende Analysen aufgeteilt und analysiert werden kann.
Hier wird eine Methode zur Kultur und Sammlung einer reichlich vorhandenen C. elegans-Population im Mischstadium auf einer großräumigen Kulturplatte (LSCP) und anschließenden phänotypischen Daten vorgestellt. Diese Pipeline liefert eine ausreichende Anzahl von Tieren, um phänotypische und Populationsdaten zu sammeln, zusammen mit allen Daten, die für -Omics-Experimente benötigt werden (d. H. Genomik, Transkriptomik, Proteomik und Metabolomik). Darüber hinaus erfordert die LSCP-Methode eine minimale Manipulation der Tiere selbst, weniger Vorbereitungszeit für den Benutzer, bietet eine strenge Umweltkontrolle und stellt sicher, dass die Handhabung jeder Probe während der gesamten Studie konsistent ist, um die Reproduzierbarkeit insgesamt zu gewährleisten. Schließlich werden Methoden zur Dokumentation der Populationsgröße und Populationsverteilung von C. elegans Lebensstadien in einem gegebenen LSCP vorgestellt.

Das Wachstum von C. elegans mit der LSCP-Methode ergibt durchschnittlich etwa 2,4 Millionen Mischwurm pro Probe über 12,2 Tage. Das Wachstum von C. elegans mit der LSCP-Methode ermöglicht es Benutzern, große gemischtstufige Populationen von C. elegans mit wenig Handhabung und Manipulation der Tiere zu erzeugen, was ideal für groß angelegte Omics-Studien ist (Abbildung 1). Sobald ein LSCP voller erwachsener Würmer geworden ist, eine große Populationsgröße erreicht hat und nur noch minimale Bakterien übrig hat, können Benutzer die Populationsgröße ernten und schätzen. Dieser Punkt kann auch als Qualitätskontrolle dienen, indem bewertet wird, ob die Population ausreicht, um in einer -omics-Pipeline verwendet zu werden (Abbildung 2). Die Populationsdynamik hängt vom Stamm selbst, dem Verhalten des Stammes(d. H.Grabenstämme tendenziell eine geringere Wurmerholung) und dem Wachstumserfolg(d. H.Kontamination) ab. Die LSCP-Methode wurde an 15 Stämmen von C. elegans getestet, die eine Mischung aus Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Mutanten und Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource (CeNDR) Wildstämmenenthalten 25. Stammgenotypen sind in der Ergänzenden Tabelle 3beschrieben.
Die LSCP-Methode ergab Populationsgrößen von etwa 94.500 bis 9.290.000. Die mittlere Populationsgröße innerhalb des Referenzstamms PD1074 und über Stämme hinweg betrug etwa 2,4 Millionen Würmer (Abbildung 3). Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der geschätzten Populationsgröße zwischen C. elegans-Stämmen im Verlauf von durchschnittlich 12,2 LSCP-Wachstumstagen gefunden (Abbildung 4). PD1074 LSCPs brauchten zwischen 10 und 14 Tagen, um zu einer vollständigen Gemischtphasenpopulation zu wachsen. Die mittlere Wachstumszeit für PD1074 betrug 10 Tage. Die am langsamsten wachsende Sorte wuchs für maximal 20 Tage und die am schnellsten wachsende Sorte für mindestens 10 Tage (Abbildung 4).
Daher können Benutzer mit dieser LSCP-Methode neue Sorten von Interesse leicht in eine Studie integrieren, ohne über das Entwicklungszeitpunkt und die Hintergrundkenntnisse Bescheid zu wissen. Beachten Sie, dass Stämme und Phänotypen, die durch Pflücken aufrechterhalten werden müssen, Fruchtbarkeitsfehler aufweisen, heterozygot sind oder Wachstumsfehler aufweisen, in dieser Pipeline möglicherweise nicht gut funktionieren.
Die Großpartikel-Durchflusszytometrie und die Bildgebung von Proben ermöglicht es Benutzern, die Populationsverteilung zu dokumentieren. Eine Vielzahl von Plattformen kann verwendet werden, um ein erfolgreiches Bevölkerungswachstum zu messen.
Für reproduzierbare -omics-Messungen ist es wichtig, konsistente Kulturen zu züchten. Die Metriken der Kulturreproduzierbarkeit sind die Anzahl der Würmer und eine konsistente Größenverteilung für einen bestimmten Stamm. Wir zeigen die Probenverteilung für den Referenzstamm PD1074 – eine Variante des ursprünglichen N2 Bristol-Stammes – unter Verwendung der LPFC23,26 und mikrokonfokalen Mikroskopbilder als Proxys für den Wachstumserfolg. Da Würmer vom L1-Stadium bis zum graviden Erwachsenen auf der LPFC-Verteilung (Abbildung 5), der anschließenden Bildgebung (Abbildung 6) und der Variation der Populationsverteilung über Die Stichproben (Abbildung 7) gemessen wurden, können wir sehen, dass diese Pipeline eine Gemischtphasenpopulation von C. elegans erzeugte.
Um einen genaueren Blick auf die Populationsverteilung unserer gemischtstufigen Proben zu werfen, haben wir uns die Verteilung von 35 PD1074-LSCPs angesehen, indem wir den Prozentsatz der Würmer betrachtet haben, die innerhalb jeder Region über die gesamte Time of Flight (TOF)(d. H.Körperlänge) Verteilung fallen (Abbildung 7A, B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig01.jpg"> Abbildung 1: Übersicht über die LSCP-Wurmwachstumspipeline. (A) Nach Erhalt im Labor wurden alle Stämme für die Langzeitlagerung bei -80 °C2vorbereitet und eingefroren. (B) Aus einem gefrorenen Wurmvorrat wurde ein "Master Chunk"-Teller hergestellt und bei 15 °C gelagert, um nicht länger als einen Monat verwendet zu werden. (C) Jede Probe durchlief vier aufeinanderfolgende Chunking-Schritte, um den Generationsstress zu reduzieren, bevor sie auf dem LSCP wuchs. (D) 5 einzelne gravidierte Erwachsene wurden aus der "Chunk 4" 6 cm Platte in Schritt (D) gepflückt und auf fünf bestimmten Bereichen des LSCP gebleicht. (E) Das LSCP wurde in einen Raum mit kontrollierter Temperatur gestellt und bei 20 °C gezüchtet, bis das LSCP voller erwachsener Würmer war, eine große Populationsgröße erreichte und nur noch minimale Bakterien übrig hatte. (F) Die Wurmpopulation wurde geerntet und für nachgelagerte Schritte gesammelt. (G) Aliquoten wurden aus dem LSCP erstellt und für nachgelagerte gewünschte Anwendungen eingefroren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig02.jpg"> Abbildung 2: Überblick über die LSCP-Ernte und Die Schätzung der Populationsgröße. (A) 50 ml M9 wurden verwendet, um Würmer von der NGMA-Oberfläche zu waschen. Die Schneckensuspension wurde in ein 50 mL konisches Rohr pipettiert. Schritt (A) wurde zweimal wiederholt. (B) 15 ml Schneckensuspension wurden in ein neues 15 mL konisches Rohr gegossen. Würmer wurden durch Zentrifugieren pelletiert. M9 + Trümmer wurden abgesaugt, ohne störende Wurmpellets zu stören. Schritt (B) wurde wiederholt, bis alle 150 ml Wurmsuspension gesammelt waren. (C) Das Wurmpellet wurde dreimal gewaschen und mit M9 zentrifugiert, um verbleibende Ablagerungen zu beseitigen. Sobald die Probe sauber war, wurde das Wurmpellet in 10 ml ddH2O resuspendiert. (D) Eine serielle Verdünnung der Probe wurde erstellt, um die Größe der Wurmpopulation zu schätzen. Die Verdünnungsfaktoren, die es ermöglichten, Würmer genau zu zählen, wurden verwendet. Die verwendeten Verdünnungsfaktoren änderten sich in Abhängigkeit von der Populationsgröße des LSCP. (E) Sobald der/die Verdünnungsfaktor(e) gewählt wurde(n), wurden alle Würmer aus allen drei aliquoten Replikaten dieser Verdünnung auf einen sauberen Objektträger pipettiert und Würmer unter einem Seziermikroskop gezählt. (F) Die Stichprobe wurde in Aliquoten geeigneter Größe aufgeteilt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig03.jpg"> Abbildung 3: Die LSCP-Methode erzeugte im Durchschnitt eine Population von 2,4 Millionen Würmern im gemischten Stadium. Die LSCP ergibt Populationsgrößen bei den kleinsten Bevölkerungszuwucherungen bei rund 94.500 und bei den größten Bevölkerungszuwucherungen bei rund 9.290.000. Die mittlere Populationsgröße über alle Stämme hinweg betrug 2,4 Millionen Würmer. Balken unter den Stammnamen von C. elegans geben an, ob es sich bei einem Stamm um eine CGC-Mutante oder ein natürliches CeNDR-Isolat handelt. Die LSCP-Probengröße wird für jeden Stamm angezeigt. Es wurden Vergleiche für alle Paare mit Tukeys HSD-Test durchgeführt. Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den geschätzten Populationsgrößen zwischen den C. elegans-Stämmen beobachtet (F(14.108) = 0,7, p = 0,77). Farbige Balken zeigen Standardfarbdisplays für die jeweilige C. elegans Dehnungsdarstellung an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig04.jpg"> Abbildung 4: Die LSCP-Methode erzeugte in 10 – 20 Tagen große Würmerpopulationen im gemischten Stadium. Ein gegebener C. elegans LSCP wuchs, bis die Probe voller erwachsener Würmer war, eine große Populationsgröße erreichte und nur noch minimalen Bakterienwies übrig hatte. LSCPs brauchten je nach Sorte zwischen 10 und 20 Tagen, um zu einer vollständigen Mischphasenpopulation zu wachsen. Die mittlere Wachstumszeit über die Stämme hinweg betrug 12,2 Tage. Die LSCP-Probengröße wird für jeden Stamm angezeigt. Jeder Fehlerbalken wurde unter Verwendung von 1 Standardabweichung vom Mittelwert konstruiert. Ebenen, die nicht durch denselben Buchstaben verbunden sind, unterscheiden sich erheblich. Vergleiche für alle Paare mit Tukeys HSD-Test. Ein signifikanter Unterschied wurde in der Menge der Wachstumszeit auf LSCP gefunden, die über C. elegans-Stämme hinweg benötigt wurde (F(14.108) = 8,8, p < 0,0001*). Farbige Balken zeigen Standardfarbdisplays für die jeweilige C. elegans Dehnungsdarstellung an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2.jpg"> Abbildung 5: Gemischte Populations- und Wachstumsmessung des Wildtyp-Referenzstamms PD1074. Eine repräsentative LPFC-Verteilung eines LSCP-Wachstums des Wildtyp-Referenzstamms, einer Variante des ursprünglichen N2-Bristol-Stammes, (PD1074) dokumentiert die Größenverteilung und Ereigniszahlen einer Gemischtphasenpopulation. Die x-Achse zeigt die Länge (Time of Flight, TOF) der sortierten Würmer an. Die y-Achse zeigt die optische Dichte (optical extinction, EXT) der sortierten Würmer an. Jeder Datenpunkt ist ein Wurm, der im Beispiel dokumentiert wurde. Jeder TOF-Bereich, der für die Bildanalyse verwendet wurde, wird in einer anderen Farbe angezeigt. Es wurden zwanzig TOF-Regionen (R2 – R21) geschaffen, die von einem TOF von 50 bis 2050 reichen. Einzelheiten zu den einzelnen TOF-Regionen finden Sie in der ergänzenden Tabelle 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig06.jpg"> Abbildung 6: Bilder von Würmern, die aus TOF-Regionen von R2 bis R12 sortiert sind, zeigen die PD1074 LPFC-Verteilung. In der Region R2 können L1-Würmer identifiziert werden und in der Region R9 werden überwiegend gravidierte Erwachsene identifiziert, die die beiden Entwicklungslarvenextreme umfassen, was uns ungefähre Regionen innerhalb der Durchflusszytometerverteilung gibt, in denen Stadien in der Verteilung erwartet werden. Der Maßstabsbalken stellt 1 mm dar. Repräsentative Bilder wurden aus der in Abbildung 5dargestellten LPFC-Verteilung entnommen, und die farbigen Felder entsprechen den Bereichen aus Abbildung 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig07.jpg"> Abbildung 7: Populationsverteilung über Flugzeitregionen (TOF) im Wildtyp-Referenzstamm PD1074. Verteilung der Würmer über die gesamte TOF-Region, die die Regionen zeigt, in denen Würmer gefunden wurden. Jeder PD1074 LSCP wird als Einzelfarbe dargestellt. (A) Die x-Achse zeigt die zwanzig TOF-Bereiche (R2 – R21), die für den LSCP beobachtet und gezählt wurden, und zeigt die gesamte Größenverteilung an. Die y-Achse zeigt den Prozentsatz der Würmer aus einem bestimmten LSCP, die eine Körpergröße hatten, die in eine bestimmte TOF-Region fiel. (B) Da ein kleinerer Teil der Wurmpopulation zwischen den R7-R21-Regionen liegt, wurde das Protokoll des Prozentsatzes der Würmer, die in jede Region fielen, zur Anzeige der Populationsverteilung herangezogen. Die x-Achse zeigt die TOF-Bereiche R7-R21 an. Die y-Achse zeigt das Protokoll des Prozentsatzes der Würmer aus einem bestimmten LSCP an, der eine Körpergröße hatte, die in eine bestimmte TOF-Region fiel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: Mittlere Tagestemperatur (°C) der Wachstumsbedingungen, unter denen das LSCP angebaut und gehandhabt wurde. Die berichteten Temperaturen des CT-Raums (Controlled Temperature) wurden dokumentiert und während des sechsmonatigen Zeitraums des Probenwachstums und der Probenentnahme gesammelt. Die durchschnittliche Tagestemperatur wird hier angegeben. Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen der Temperatur beobachtet, bei der das LCSP während der Projektlaufzeit wuchs (F(5,24) = 2,59, p = 0,0524). Die gesamte Temperaturdifferenz reichte über die sechsmonatige Dauer des Probenwachstums und der Probenerzeugung nicht größer als 0,003 °C. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453supfig01.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Figur herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: TOF-gated regions used to sort worms in 384-well plates for imaging. Binned-Regionen wurden erstellt, um einen TOF von 100 über die gesamte TOF-Verteilung von 50 bis 2050 zu umfassen. Gated Regions können an Ihre Bedürfnisse angepasst und optimiert werden. Jeder TOF-Bereich, der für die Bildanalyse verwendet wurde, wird in einer anderen Farbe angezeigt. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table1_FINAL.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 2: 384-Well-Plattenvorlage von TOF-Regionen und Replikationslayout. Jede Probe wurde zur Bildgebung in eine 384-Well-Platte sortiert. Für jede region, die für die Sortierung ausgewählt wurde, wurden vier Replikate erstellt. Gated Regions können an Ihre Bedürfnisse angepasst und optimiert werden. Siehe Ergänzende Tabelle 1 für bestimmte gated Regions, die in diesem Protokoll erstellt und verwendet werden. Jeder TOF-Bereich, der für die Bildanalyse verwendet wurde, wird in einer anderen Farbe angezeigt. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table2_FINAL.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 3: Die in diesem Protokoll verwendeten C. elegans-Stämme enthalten eine Mischung aus CGC- und CeNDR-Stämmen. Der Stamm, der Genotyp, die Stammquelle und die Details sind in dieser Tabelle beschrieben. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table3_FINAL.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Um Caenorhabditis elegans (C. elegans) in der Omics-Forschung zu verwenden, wird eine Methode benötigt, um große Populationen von Würmern zu generieren, bei denen eine einzelne Probe plattformübergreifend für vergleichende Analysen gemessen werden kann. Hier wird eine Methode vorgestellt, um C. elegans Populationen auf großräumigen Kulturplatten (LSCPs) zu kulturieren und das Bevölkerungswachstum zu dokumentieren.

Kultur und Assay von großflächigen Caenorhabditis elegans-Populationen im gemischten Stadium

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Diese Technik ermöglicht es uns, große Wurmpopulationen zu sammeln, die für mehrere Omics-Plattformen mit minimaler Manipulation verwendet werden können. Diese Technik ermöglicht es uns, C.elegans-Populationen im gemischten Stadium über mehrere Omics-Experimente hinweg zu sammeln, um ein ganzheitliches Bild jeder Probe zu erhalten. Für das Spotbleichen von graviden Erwachsenen auf großflächige Kulturplatten flammen Sie einen Wurm über einen Bunsenbrenner und verwenden Sie den Pick, um frische E.coli vom Rand des Bakterienwieses auf eine großflächige Kulturplatte zu schaufeln.Wählen Sie einen einzelnen graviden Erwachsenen aus der vierten Brockenplatte zum Spotbleichen und fügen Sie fünf Mikroliter frisch zubereitete alkalische Hypochloritlösung in eine Ecke der großflächigen Kulturplatte abseits des E.coli-Rasens hinzu. Legen Sie den graviden Erwachsenen in die alkalische Hypochloritlösung und klopfen Sie den Nematoden an, um die Nagelhaut zu stören und Eier freizusetzen. Wenn insgesamt fünf Erwachsene gleichmäßig um den E.coli-Rasen herum auf die gleiche Weise platziert wurden, legen Sie den Deckel wieder auf den Teller.Um Proben von großflächigen Kulturplatten zu entnehmen, gießen Sie 50 Milliliter M9-Lösung auf eine großflächige Kulturplattenoberfläche und schwenken Sie die Platte, um sicherzustellen, dass der M9 die gesamte Oberfläche des Nematodenwachstumsmediums Agarose bedeckt. Bereiten Sie eine sterile serologische Pipette mit M9 vor und neigen Sie die Platte so, dass sich die M9- und Wurmpopulation in einer Ecke der Platte sammelt. Verwenden Sie die grundierte Pipette, um die Wurmsuspension abzusaugen, und fügen Sie die Würmer in ein 50 Milliliter konisches Rohr hinzu.Legen Sie das Röhrchen auf eine Wippe, um bakterielle Klumpen und Ablagerungen zu stören. Wenn alle Würmer von allen drei Platten gesammelt wurden, werden 15 Milliliter Würmer aus jedem Rohr in jedes der drei 15-Milliliter-Konusrohre übertragen und die Würmer in den Röhren durch Zentrifugation sedimentiert. Saugen Sie die Überstände vorsichtig an, ohne die Wurmpellets zu stören, und fügen Sie jedem Rohr 13 Milliliter Wurmsuspension hinzu.Kehren Sie die Röhrchen um, um die Pellets wieder zu regenerieren und so viele Bakterien und Ablagerungen wie möglich abzuwaschen und die Würmer wieder zu zentrifugieren. Wenn jede gesamte Wurmpopulation gesammelt wurde, waschen Sie die Wurmpellets dreimal in 10 Millilitern frischer M9-Lösung pro Waschgang. Nach der letzten Wäsche jedes gereinigte Wurmpellet in 10 Millilitern doppelt destilliertem Wasser wieder aufsorgen.Für die Schätzung der Populationsgröße verdünnen Sie schnell drei 100-Mikroliter-Aliquoten der Wurmprobe aus jedem Röhrchen in 900 MikroliterN M9-Lösung pro Probe und verwenden Sie die Aliquoten, um serielle Verdünnungen vorzunehmen. Legen Sie die Stammwurmprobensuspensionen auf eine Wippe, um die Kulturen kontinuierlich zu bewegen, während die Aliquoten gezählt werden, und mischen Sie die Wurmverdünnungen, bis sie homogen sind. Fügen Sie fünf Mikroliter Lösung von der ersten bis 10 Wurmprobe zu einem Glasmikroskopobjektträger hinzu und zählen Sie die Würmer durch Lichtmikroskopie.Wenn sich weniger als 50 Würmer in der Probe befinden, zählen Sie die Verdünnungen 1:100 und 1:1.000. Wenn mehr als 50 Würmer vorhanden sind, fahren Sie mit der nächsten seriellen Verdünnung um. Nachdem Sie jede aliquote Replik jeder Verdünnung dreimal gezählt haben, mittelen Sie die Verdünnungszahlen, um die geschätzte Populationsgröße des Wurms zu bestimmen.Dann die Wurmproben in die entsprechenden experimentellen Aliquoten aufteilen und die Proben in flüssigem Stickstoff für eine Lagerung von minus 80 Grad Celsius einfrieren. Um eine Wurmprobe für die Großpartikel-Durchflusszytometrie vorzubereiten, verdünnen Sie ein etwa fünfmal 10 bis die vierte Mischstufe Wurm aliquot auf ein Endvolumen von 10 MilliliterN M9-Lösung und fügen Sie 200 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter E.coli und 1:50 Verdünnung von 0,5 mikromollarer roter fluoreszierender Mikrosphärenlösung zur Wurmsuspension hinzu. Nach einer 20-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur mit Schaukeln die Würmer und Mikrosphären durch Zentrifugation sammeln und die Würmer zweimal mit frischer M9-Lösung waschen, um überschüssige Bakterien und nicht internalisierte Mikrosphären zu entfernen.Nach der zweiten Wäsche wird das Pellet in fünf Milliliter M9-Lösung wieder aufschnunden. Wenn das Pellet sauber aussieht, fügen Sie fünf Milliliter M9 mit 50 Millimolar natriumazid zu den Würmern hinzu und legen Sie das Rohr auf eine Wippe, um die Würmer sowohl zu richten als auch einzuschläfern, um genau zu zählen und zu dimensionieren. Öffnen Sie für die Dokumentation der Populationsverteilung die kalibrierte 384-Well-Plattenvorlage und legen Sie die Vorlage so fest, dass 20 gated Objekte in vier Bohrungen abgegeben werden, um vier technische Replikate jeder gated Region für jeden der 20 bar-Bereiche der Probe zu erhalten.Laden Sie eine 40-Milliliter-Wurmprobe auf das große Partikel-Durchflusszytometer und beginnen Sie automatisch mit der Sortierung der Probe, während Sie die Probe kontinuierlich rühren, um zu verhindern, dass sich Objekte aus der Probe absetzen und gleichzeitig in die kalibrierte 384-Well-Platte dosieren. Sobald die gesamte Probe sortiert und die maximale Anzahl der gated Regionen in die 384-Well-Platte abgegeben wurde, entfernen Sie die Probe aus dem Zytometer und reinigen Sie das Instrument. Die groß angelegte Kulturplattenmethode wurde an 15 Stämmen von C.Elegans getestet, darunter eine Mischung aus Caenorhabditis Genetics Center Mutanten und Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource Wildstämmen.In dieser Analyse ergab die großräumige Kulturplattenmethode Populationsgrößen von etwa 94.500 bis 9.290.000. Die mittlere Populationsgröße innerhalb des Referenzstamms PD1074 und über Stämme hinweg betrug etwa 2,4 Millionen Würmer. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der geschätzten Populationsgröße zwischen C.elegans-Stämmen im Laufe von durchschnittlich 12,2 großräumigen Wachstumstagen gefunden.PD1074 großformatige Kulturplatten brauchten zwischen 10 und 14 Tagen, um zu einer vollständigen Gemischtstufenpopulation mit einer mittleren Wachstumszeit von 12,2 Tagen zu wachsen. Die am langsamsten wachsende Sorte wuchs für maximal 20 Tage und die am schnellsten wachsende Sorte für mindestens 10 Tage. In dieser Probenverteilung für PD1074 wurden Würmer vom L1-Stadium bis zum graviden Erwachsenen auf einem großen Partikel-Durchflusszytometer gemessen.Die anschließende Bildgebung und Visualisierung der Variationen in der Populationsverteilung über Stichproben hinweg zeigte, dass die Pipeline eine gemischte Population von C.elegans erzeugte. Es ist wichtig, die Würmer während der gesamten Probenentnahme genau zu zählen, damit Sie Daten erhalten, die über Wucherungen und Studien hinweg vergleichbar sind. Dieser Sammlungsansatz kann auf RNA-Sequenzierung, Genomik und andere Omics-Analysen angewendet werden, um unser Verständnis der komplizierten Dynamik zu erweitern, die in C.elegans-Populationen auftritt.Diese Technik ermöglicht es uns, gemischt gestufte C.elegans-Populationen über mehrere Omics-Experimente hinweg zu sammeln, um ein ganzheitliches Bild jeder Probe zu erhalten.

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