Name: Ein Einzelzell-Dissoziationsansatz für die molekulare Analyse der Harnblase in der Maus nach Einer Rückenmarksverletzung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Lernen Sie einen optimierten Einzelzell-Dissoziationsansatz für die Analyse der Mausharnblase nach Rückenmarksverletzung. Diese Methode liefert hochviable Zellsuspensionen für Durchflusszytometrie und molekulare Studien.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (R01 DK077195 bis R.M.A, R01 DK104641 bis R.M.A und D.R.B) unterstützt. Wir würdigen wertvolle Beiträge von Dr. Stuart Orkin in der Abteilung für Hämatologie/Onkologie, boston Children es Hospital, Department of Pediatrics, Harvard Medical School und dem Dana-Farber Cancer Institute. Wir würdigen auch die Unterstützung von Kyle Costa bei der postoperativen Pflege von Mäusen, Mary Taglienti und Dr. Habiballah Shojaeisaadi (Dr. Yang Shi Laboratory, Dept. of Pediatrics, Division of Newborn Medicine, Dept. of Pediatrics, Division of Newborn Medicine, Boston Children es Hospital, Harvard Medical School) für technische Hilfe und hilfreiche Diskussionen.

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<li>van den Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li>
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<li>Gheinani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concordant+miRNA+and+mRNA+expression+profiles+in+humans+and+mice+with+bladder+outlet+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Urology%22%5BJournal%5D)">Concordant miRNA and mRNA expression profiles in humans and mice with bladder outlet obstruction.</a> American Journal of Clinical and Experimental Urology. 6 (6), 219-233 (2018).</li>
<li>Krishna, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+contusion+model+of+severe+spinal+cord+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A contusion model of severe spinal cord injury in rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50111(2013).</li>
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<li>Gray, C. J., Boukouvalas, J., Szawelski, R. J., Wharton, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline+p-nitroanilide+as+a+substrate+for+papain+and+other+plant+cysteine+proteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline p-nitroanilide as a substrate for papain and other plant cysteine proteinases.</a> Biochemical Journal. 219 (1), 325-328 (1984).</li>
<li>Feodorova, Y., Koch, M., Bultman, S., Michalakis, S., Solovei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+and+reliable+method+for+retina+dissociation+and+separation+of+rod+photoreceptor+perikarya+from+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Quick and reliable method for retina dissociation and separation of rod photoreceptor perikarya from adult mice.</a> MethodsX. 2, 39-46 (2015).</li>
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<li>Aitken, K. J., Bagli, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bladder+extracellular+matrix.+Part+II%3A+regenerative+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Urology%22%5BJournal%5D)">The bladder extracellular matrix. Part II: regenerative applications.</a> Nature Reviews Urology. 6 (11), 612-621 (2009).</li>
<li>The ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Yue, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome.</a> Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).</li>
<li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li>
</ol>

Es wurden keine Interessenkonflikte angemeldet.

Das hier beschriebene Modell für die Verletzung des Rückenmarks der Maus bietet eine reproduzierbare Methode, um eine funktionelle Blasenauslassverstopfung aufgrund des Koordinationsverlusts zwischen Blasenkontraktion und externer Harnröhren-Schließmuskelentspannung zu schaffen. Dies wiederum erinnert an eine tiefgreifende Umgestaltung der Blasenwand bereits 2 Wochen nach einer Verletzung, die durch die Ausdehnung der urotheliale und glatten Muskelabteilungen gekennzeichnet ist. Kritische Schritte bei der Umsetzung des SCI-Modells bei Nagetieren sind (i) die strenge Aufmerksamkeit für die manuelle Blasenexpression während der Zeit des Wirbelsäulenschocks, die sich für 10 bis 201214 Tage nach der Verletzung ergibt; ii) anreichern, um den Gewichtsverlust zu minimieren; und (iii) Abschwächung des Potenzials für Urinverbrühungen insbesondere für Experimente, die über die Rückkehr der Reflexvoidelung hinausgehen. Zu den Einschränkungen des Modells gehören das Potenzial für Harnröhrenverschluss bei Mäusen aus Blutgerinnseln während der Zeit der transienten Hämaturie und zusätzlich bei männlichen Mäusen aus Semen koagulum nach retrograde Ejakulation nach der Operation.
Der hier beschriebene Ansatz der Gewebedissoziation veranschaulicht, wie wichtig es ist, strukturelle Veränderungen in Geweben zu berücksichtigen, die sich aus der experimentellen Beleidigung ergeben, in diesem Fall eine signifikante Gewebeumgestaltung nach GG, die nachgelagerte Analysen beeinflussen kann. Mit der Zunahme der Einzelzellanalysen ist es entscheidend sicherzustellen, dass die in der Genexpression beobachteten Unterschiede nicht einfach das Ergebnis dissoziationsinduzierter Störungen sind, sondern wirklich repräsentativ für die zugrunde liegenden biologischen Veränderungen sind, die für das Krankheitsmodell relevant sind. Die Verwendung öffentlich verfügbarer Expressionsdaten ermöglichte es uns, die Formulierung von Verdauungspuffern zu modifizieren, um eine effektive Verdauung der extrazellulären Matrix zu gewährleisten und gleichzeitig die Lebensfähigkeit zu maximieren. Weitere Modifikationen, die in zukünftigen Anwendungen in Betracht gezogen werden könnten, umfassen die Hinzufügung von Actinomycin D, um die Transkription von unmittelbaren frühen Genen zu stoppen, die empfindlich auf das Dissoziationsprotokoll15reagieren.
Pipettiertechnik ist entscheidend, wenn Gewebe getrennt oder Zellen übertragen werden, die sich bereits in Suspension befinden. Um die physische Schädigung von Zellen durch Scherkräfte zu reduzieren, ist es wichtig, während der Zellresuspension sanft und langsam Pipette zu pipette. Es wird generell empfohlen, Breitbohrpipettenspitzen zu verwenden. Bei Verwendung von Standardspitzen ist es besonders wichtig, Zellsuspensionen vorsichtig zu pipetteisieren, um Scherkräfte zu vermeiden, die sonst Zellen schädigen würden. Die Verwendung von Zellsieben ist in diesem Protokoll unvermeidbar, jedoch kann die Zellkonzentration um 20 % oder mehr sinken, begleitet von einem Volumenverlust von 100 l oder mehr. Wir empfehlen, die Zellkonzentration nach der Belastung zu bestimmen, um eine genaue Zellzahl zu gewährleisten.
In der Durchflusszytometrie liefern FMO-Kontrollen ein Maß für den Hintergrund aufgrund von Signaldurchblutungen durch überlappende Emissionsspitzen. Sie sind kein Maß für unspezifische Antikörperbindung oder Hintergrundfärbung, die vorhanden sein kann, wenn ein Antikörper in diesem Kanal enthalten ist. Um die unspezifische Antikörperbindung zu berücksichtigen, muss man geeignete Isotypkontrollen einschließen; für die Hintergrundfärbung muss man negative Kontrollen einschließen. Zusammengenommen gewährleisten diese Kontrollen eine genaue Messung der Zellpopulationen.

Störungen der normalen Harnblasenfunktion können für viele Menschen zu einer verminderten Lebensqualität führen. Um ein besseres Verständnis dafür zu erlangen, wie Verletzungen oder Krankheiten die normale Blasenfunktion entgleisen lassen, ist es wichtig, den normalen biologischen Zustand der Zellen in der Blase zu untersuchen und zu untersuchen, wie sie sich unter experimenteller Störung verändern. Bis heute sind jedoch die spezifischen Zellpopulationen, die sich in der Harnblase befinden, und wie sie sich mit Verletzungen verändern, unvollständig charakterisiert.
Einzelzell-Profilierungsmethoden wie Durchflusszytometrie oder einzellige RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) haben das Potenzial, Licht auf bestimmte Zelltypen innerhalb der Blase zu werfen. Damit diese Ansätze jedoch informatives Gewebe sind, muss es so verdaut werden, dass die Lebensfähigkeit, die Genexpression und die repräsentativen Prozentsätze der Zellpopulation des geernteten Gewebes nicht beeinträchtigt werden. Protokolle, die enzymatische Disaggregation verwenden, können die Oberflächenmarkerexpression durch wahllose Proteaseaktivität1beeinflussen und dadurch die Zellidentifikation durch Durchflusszytometrie beeinflussen, während der Dissoziationsprozess selbst zur Induktion sofortiger früher Gene führen kann, wie kürzlich von Van den Brink und Kollegen2beschrieben. Die Autoren zeigten, dass die von der Dissoziation betroffene Subpopulation zwar gering war, aber aufgrund der hohen Expressionskonzentrationen der unmittelbaren frühen Gene ein starkes Kontaminierungssignal in Massenexpressionsstudien auslösen könnte. Darüber hinaus wirkte sich die Dauer des Dissoziationsprotokolls auf die nachgewiesenen Massenexpressionsniveaus von Genen aus, die für einige Subpopulationen eindeutig waren. Daher können Einzelzell-Datasets, die ohne Berücksichtigung der Auswirkungen des Dissoziationsprotokolls generiert werden, zu Veränderungen der Genexpression führen, die sich aus der Dissoziationsmethode ergeben, im Gegensatz zur zugrunde liegenden Biologie. Diese Beobachtungen legen nahe, dass veröffentlichte Einzelzell-Transkriptomikdaten mit Vorsicht interpretiert werden sollten und dass die Ergebnisse mit unabhängigen Methoden validiert werden sollten.
Obwohl, harte und langwierige Dissoziationsmethoden können genexpression in Zellenändern 2; eine effektive Isolierung der Zellen ist unerlässlich, um eine genaue Darstellung der vorhandenen Zelltypen zu erhalten. Da die Blase ein komplexes Organ ist, das mehrere Zelltypen umfasst, können einige Populationen wie urotheliale oder stromale Zellen relativ unterrepräsentiert sein, während andere Zelltypen wie Fibroblasten innerhalb der extrazellulären Matrix existieren und eine Herausforderung darstellen können, um zu isolieren. Die Dissoziation wird noch schwieriger, wenn die Blase eine signifikante Umgestaltung und Fibrose durchlaufen hat, wie sie bei Rückenmarksverletzungen3,4 oder Blasenauslassverstopfung 5,6beobachtet wurde.
Hier beschreiben wir eine optimierte Gewebedissoziationsmethode für die nachgeschaltete Einzelzellanalyse in der Rückenmarks-Verletzten-Mausblase. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie verglichen wir vier enzymatische Verdauungsprotokolle für ihre Fähigkeit, eine Einzelzellsuspension zu erhalten, die Zelllebensfähigkeit zu unterstützen und den richtigen Anteil der Zellpopulationen aufrechtzuerhalten. Basierend auf dieser Analyse kommen wir zu dem Schluss, dass die Minimierung des Zelltodes, zellulärer Aggregate, nichtzellulärer Nukleinsäuren und potenzieller Inhibitoren nachgelagerter Analysen entscheidend für die Erreichung qualitativ hochwertiger Daten ist.

<table><tbody><tr><td>2,5 x Lupenbrillen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-0 Vicryl Naht, 6,5 mm Nadel 3/8 Kreis</td><td>ETHICON</td><td>J546</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Zellsieb</td><td>Thermofisher</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Accutase in BPBS, 0,5 mM EDTA</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Aerosolfilter Pipettierspitzen mit breiter Öffnung (1000 & Mikro; L)</td><td>VWR</td><td>89049-168</td><td></td></tr><tr><td>Aerosolfilter Pipettierspitzen mit breiter Öffnung (1000 & Mikro; L)</td><td>VWR</td><td>89049-168</td><td></td></tr><tr><td>APC Anti-Maus CD326 (Ep-CAM), Ratte monoklonal, IgG2a, &kappa;, affinitätsgereinigt</td><td>BioLegend</td><td>118213</td><td></td></tr><tr><td>BB515 Ratte Anti-Maus CD45, Ratte monoklonal, IgG2b, &kappa;, Klon 30-F11</td><td>BD Biosciences</td><td>564590</td><td></td></tr><tr><td>BONN Mikro-Präparierzange, gerade, 1x2 Zähne, 3,75" Länge, 0,3 mm Spitzenbreite, 0,12 mm Zähne</td><td>ROBOZ Surgical Instrument CompanyInc.</td><td>RS-5172</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>2115-250ML</td><td></td></tr><tr><td>CASTROVIEJO Mikro-Nahtnadelhalter, gerade mit Lock, 5,75" Länge</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td><td>RS-6412</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>Zellzählkit, 30 Objektträger mit zwei Kammern, 60 Zählungen, mit Trypanblau</td><td>Biorad</td><td>1450003</td><td></td></tr><tr><td>Zellfärbepuffer</td><td>BioLegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase aus Clostridium histolyticum</td><td>Sigma</td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ I</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td></td><td></td>LS004196</tr><tr><td>Kollagenase Typ III</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004182</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase, Typ 6</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS005319</td><td></td></tr><tr><td>Dead Cell Apoptose Kit mit Annexin V Alexa Fluor 488 & Propidiumiodid (PI)</td><td>Thermofisher</td><td>V13241</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Enrofloxacin (Baytril)</td><td>Bayer Health Care LLC,NADA</td> <td># 140-913 Zugelassen von der FDA. Los-Nr.: AH01CGP</td><td>2,27% injizierbare</td></tr><tr><td>Lösung Falcon 15 ml konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>FITC Anti-Maus Ly-6A/E (Sca-1) Antikörper, monoklonal Ratte, IgG2a & kappa;, affinitätsgereinigt BioLegend</td><td></td><td>122505</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase aus Schafhoden, Typ II</td><td>Sigma</td><td>H2126</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (100 & Mikro; m)</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-110-917</td><td></td></tr><tr><td>McPHERSON-VANNAS, Mikro-Präparierfederschere, gerade, 4" Länge, 0,15 mm Spitzenbreite</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td><td>RS-5630</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-891-7959</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS003119</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5 Anti-Maus CD19 Antikörper, monoklonal Ratte, IgG2a & kappa;, affinitätsgereinigter</td><td>BioLegend</td><td>115509</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 Anti-Maus CD3 & Epsilon; Antikörper, monoklonaler armenischer Hamster, IgG, affinitätsgereinigter</td><td>BioLegend</td><td>100309</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 Anti-Maus CD4 Antikörper, Ratte monoklonal, IgG2b &kappa;, affinitätsgereinigter</td><td>BioLegend</td><td>100409</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 Anti-Maus CD8a Antikörper, Ratte monoklonal, IgG2a & kappa;, affinitätsgereinigter</td><td>BioLegend</td><td>100709</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 Anti-Maus NK-1.1 Antikörper, Maus monoklonal, IgG2a, &kappa;, affinitätsgereinigt</td><td>BioLegend</td><td>108715</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 Anti-Maus TER-119/Erythroid Zellen Antikörper, IgG2b, &kappa;, affinitätsgereinigt</td><td>BioLegend</td><td>116209</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>gereinigte Ratte Anti-Maus CD16/CD32 (Maus BD Fc Block), Ratte monoklonal, IgG2b, &kappa;, Klon 2.4G2</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer (10X)</td><td>BioLegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Lysepuffer für rote Blutkörperchen 1x</td><td>Biolegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss, 1,5 ml</td><td>VWR</td><td>89004-290</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automatisierter Zellzähler</td><td>Biorad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Dreifache antibiotische Salbe (Neomycin/Polymyxin B/ Bacitracin)</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-7216</td><td>Hautschutzmittel</td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (10X), kein Phenolrot</td><td>Thermofisher</td><td>A1217701</td><td></td></tr><tr><td>Vetropolycin Augensalbe</td><td>Dechra Veterinary Products</td><td>NADA # 065-016. Von der FDA zugelassen.</td><td>Schützen Sie die Augen während der Anästhesie</td></tr></tbody></table>

ein einzelzell-dissoziationsansatz für die molekulare analyse der harnblase in der maus nach einer rückenmarksverletzung

A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

Wir beschreiben die Umsetzung von Rückenmarksverletzungen bei Mäusen, um Detrusor-Sphincter-Dyssynergie, eine funktionelle Blasenauslassverstopfung und anschließende Blasenwandumbau zu entlocken. Um die Beurteilung der zellulären Zusammensetzung der Blasenwand bei nicht verletzten Kontroll- und Rückenmarks-verletzten Mäusen zu erleichtern, haben wir ein optimiertes Dissoziationsprotokoll entwickelt, das eine hohe Zelllebensfähigkeit unterstützt und die Detektion diskreter Subpopulationen durch Durchflusszytometrie ermöglicht.
Rückenmarksverletzungen entstehen durch vollständige Transsektion des Brustrückenmarks. Zum Zeitpunkt der Gewebeernte wird das Tier unter tiefer Anästhesie mit phosphatgepufferter Kochsäure durchsetzt und Blasen in Tyrodes Puffer geerntet. Gewebe werden vor der Inkubation im Verdauungspuffer gehackt, der basierend auf dem Kollagengehalt der Mausblase optimiert wurde, wie durch das Verhören öffentlich zugänglicher Genexpressionsdatenbanken bestimmt. Nach der Erzeugung einer einzelzelligen Suspension wird das Material durch Durchflusszytometrie zur Beurteilung der Zelllebensfähigkeit, der Zellzahl und spezifischer Subpopulationen analysiert. Wir zeigen, dass die Methode Zellpopulationen mit mehr als 90% Lebensfähigkeit und einer robusten Darstellung von Zellen mesenchymaler und epithelialem Ursprungs ergibt. Diese Methode ermöglicht eine genaue nachgelagerte Analyse diskreter Zelltypen in der Mausblase und möglicherweise anderen Organen.

Chirurgischer Eingriff Der Erfolg der thorakalen Rückenmarkstransektion wird durch die Bewertung einer Reihe von Parametern bestimmt, von denen der offensichtlichste die Hinterbleibslähmung ist. Das Tier bewegt sich nur mit seinen Vorderbeinen und zieht seine Hinterbeine. Ansonsten sind Aktivitätsniveaus, einschließlich Fütterung, Pflege und Wachsamkeit, in der Regel normal. Darüber hinaus verlieren die Tiere die volitionale Blasenkontrolle, was dazu führt, dass der Prüfer alle 12 Stunden eine manuelle Blasenexpression benötigt, bis die Reflexenkundung nach 10 bis 14 Tagen nach der Verletzung zurückkehrt. Nach der Euthanasie beziehen sich weitere Anzeichen für den Erfolg der Verletzung in erster Linie auf die Erhöhung des Blasen-Körper-Gewichtsverhältnisses, was auf eine Umgestaltung des Gewebes hindeutet. Die histologische Analyse zeigt Hyperplasie sowohl innerhalb der urotheliale als auch der glatten Muskelabteilungen3.
Vorbereitung der einzelzelligen Suspension Anhand öffentlich zugänglicher Expressionsdaten wurde die Anreicherung von Blasengewebe für extrazelluläre Matrixproteine bestimmt (Abbildung 2) und zur Information der Formulierung des Verdauungsmixes verwendet. Da Kollagene Schlüsselkomponenten der Blasenwand11,12sind, haben wir zunächst versucht, die am häufigsten vorkommenden Kollagene in der Mausblase mithilfe von RNA-Profiling-Datensätzen zu bestimmen, die vom Mouse ENCODE-Projekt13generiert wurden. Unsere Analyse zeigte, dass Kollagen 1A1, Kollagen 3A1, Kollagen 1A2 und Kollagen 6A1 am häufigsten Kollagentypen innerhalb der Mausblase sind (Abbildung 2A). Wir verwendeten auch das Tabula Muris (ein Kompendium von einzelzelligen Transkriptomdaten aus der Maus (Mus musculus))8, um den mRNA-Expressionsgrad von Kollagenen 1, 3, 6 und Hyaluronan zu bestimmen. Die Daten ermöglichen einen direkten und kontrollierten Vergleich der Genexpression in Zelltypen, die zwischen Geweben geteilt werden. Diese Analyse ergab, dass die Expression dieser extrazellulären Matrixkomponenten bei den mesenchymalen Zelltypen häufiger ist als in Urothelium (Abbildung 2B).
Wirkung der Dissoziation auf die Lebensfähigkeit isolierter Zellen aus der Blase Die Analyse der Durchflusszytometrie zeigte, dass die enzymatische Verdauung mit den 4 verschiedenen Protokollen eine Lebensfähigkeit von 83 %, 86 %, 93 % bzw. 90 % ergab. So wurde Protokollabschnitt 3 als am wertvollsten für die Erhaltung der Zelllebensfähigkeit angesehen. Wir beobachteten auch, dass etwa 4% der Zellen nekrotisch waren (PI+/Annexin V-) (Abbildung 4A). Diese Beobachtungen unterstreichen die Effizienz des Verdauungsprotokolls und den sich daraus ergebenden Nutzen für die Zelllebensfähigkeit.
Auswirkungen der Rückenmarksverletzung auf verschiedene Zellpopulationen in der Blase Wir beobachteten einen signifikanten Anstieg der Gesamtzellzahl in Blasen von SCI-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen. Das Muster der Punktdiagramme, die aus SCI-Blasen gewonnen wurden, war auch etwas anders als die laufende Organumgestaltung aufgrund von Rückenmarksverletzungen(Abbildung 4B: erste Spalte). Im Vergleich zu Kontrollen zeigten die Blasen von SCI-Tieren einen signifikanten Anstieg der CD45-positiven Zellen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig01.jpg"> Abbildung 1: Repräsentative Perfusionsvervollständigung mit aufgehellten Farbe der Leber. (A) Zeigt die Leberfarbe zu Beginn der Perfusion. (B) Zeigt die aufgehellte Leberfarbe am Ende der Perfusion. Die Maus in (A) hatte Rückenmarkstransektion zwei Wochen vor der Perfusion, was zu Blasenhypertrophie und ihrem Vorsprung aus dem Becken im Gegensatz zur Maus in (B) führte, die keine Rückenmarksverletzung hatte; in diesem Fall ist die Blase klein und im Becken versteckt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig02.jpg"> Abbildung 2: Transkriptomische Expression von komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) in der Mausblase. (A) Balkendiagramm von 43 verschiedenen Kollagentypen. Der Ausdruck wird durch Reads Per Kilobase von Transkripten, pro Million zugeordneter Lesevorgänge (RPKM) angegeben (Daten werden aus BioProject gesammelt: PRJNA66167)14. (B) Geigenplots der Genexpression in Zelltypen, die aus mikrofluidischer Tropfen-basierter 3'-End-Zählung in einem Pool von männlichen und weiblichen dissoziierten Harnblasenproben (männlich und weiblich) gewonnen werden. Die Zählungen wurden für jede Zelle mit dem natürlichen Logarithmus von 1+ Zählungen pro Million ln (CPM+1)8protokollnormalisiert. Vor der Einnahme von Logarithmen wurde eine Pseudoanzahl von 1 CPM hinzugefügt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig03.jpg"> Abbildung 3: Gating-Strategie und FMO-Kontrollen zur Bestimmung der Fluoreszenzausbreitung. (A) Auswahl der Zellpopulation. (B) Gating-Strategie für Singlets. (C) Gating für nekrotische und frühe und späte apoptotische Zellen mit PI- und Annexin-V-Antikörpern. (D-u2012F) Ein schematisches Punktdiagramm aus mehrfarbiger Durchflusszytometrie (z. B. Antikörper konjugiert mit A, B, C, D Fluorochromen + (Annexin V und PI). Dies zeigt die Fluoreszenz, die sich in den Antikörper mit Fluorchrom-A-Kanal ausbreitet, der von der FMO-Steuerung im Vergleich zu einer ungefärbten Kontrolle gezeigt wird. Orange gepunktete Linie stellt FMO-Gating-Grenze im Vergleich zu unbefleckten Grenze in rot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig04.jpg"> Abbildung 4: Durchflusszytometrie verschiedener Zelltypen in der Blase. (A) Anhang in V/PI Doppelfärbeflussdiagramme. Die verschiedenen Kombinationen von Enzymen und Chemikalien, die für jedes Protokoll verwendet werden, werden vor dem entsprechenden Lebensfähigkeitsdiagramm dargestellt. Diese Daten belegen die höchste Lebensfähigkeit, die mit Protokollabschnitt 3 ermittelt wurde. (B) Repräsentative Histogramme, die die Intensität von Ly-6A/E (Sca-1) und CD326 (Ep-CAM) veranschaulichen, die in einzelnen Kanälen nachgewiesen werden. (C) Wirkung von SCI auf die Zellpopulation der Mausblase. Obere Platte zeigt Ergebnisse der Färbung auf drei dissoziierten Blasen aus der Kontrolle nicht-chirurgische Mäuse und untere Panel zeigt die Ergebnisse der Färbung an drei Tieren mit SCI. Die erste Spalte ist die gesamte Zellpopulation. Die zweite Spalte zeigt die Singlet-Gating-Auswahl. Die dritte Spalte zeigt die Teilpopulation von lebenden Zellen, die für B-Zellen, T-Zellen und NK-Zellen negativ sind. Die vierte Spalte zeigt die Färbung für lebende Zellen positiv für CD45. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Komponente</td>
			<td>Betrag (für 500 ml)</td>
			<td>Molarität</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>4.091 g</td>
			<td>140 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>0,186 g</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>0,0476 g</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-Glucose</td>
			<td>0,9 g</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>1,19 g</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Komponenten zur Vorbereitung der Tyrodes-Lösung. Die angegebenen Komponenten sind für die Vorbereitung von 500 ml Tyrodes Lösung.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Komponente</td>
			<td>Menge</td>
			<td>Protokollabschnitt 1</td>
			<td>Protokollabschnitt 2</td>
			<td>Protokoll Abschnitt 3</td>
			<td>ProtokollAbschnitt 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bsa</td>
			<td>5 mg</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0,03 mM</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kollagenase Typ I</td>
			<td>132,5 Stück</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kollagenase Typ III</td>
			<td>96,4 Stück</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kollagenase Typ VI</td>
			<td>50 Stück</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dnase</td>
			<td>10 Stück</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Papain</td>
			<td>115 Stück</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pan Collagenase</td>
			<td>50 Stück</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
			<td>10,5 Stück</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase II</td>
			<td>1,25 Stück</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zelldissoziationslösung</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>Ja</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rekombinantes Enzym</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Komponenten zur Herstellung des Verdauungspuffers. Die angegebenen Komponenten sind zur Herstellung von 2,5 ml Verdauungsmischung (1 U katalysiert die Hydrolyse von 1 mol pro Substrat pro Minute bei 37 °C. Siehe Produktdatenblatt für die Definition der Einheit jedes Enzyms).

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein optimiertes Gewebedissoziationsprotokoll auf ein Mausmodell der Rückenmarksverletzung anzuwenden und den Ansatz für die Einzelzellanalyse durch Durchflusszytometrie zu validieren.

Ein Einzelzell-Dissoziationsansatz für die molekulare Analyse der Harnblase in der Maus nach Einer Rückenmarksverletzung

We describe the implementation of spinal cord injury in mice to elicit detrusor-sphincter dyssynergia, a functional bladder outlet obstruction, and ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es biologische Informationen verwendet, um die Erzeugung einer Einzelzellsuspension mit hoher Zellviabilität zu erleichtern. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, Einzelzellsuspensionen zu erzeugen, die eine hohe Zellviabilität und eine angemessene Repräsentation der isolierten Zelltypen aufweisen. Der chirurgische Eingriff wird von Hussein Atta, einem Mitarbeiter in meinem Labor, vorgeführt.Das Verfahren der Gewebedissoziation wird von Ali Hashemi und der FACS-Analyse, Yaser Heshmati, demonstriert. Nach der Bestätigung einer mangelnden Reaktion auf den Pedalreflex bei einer erwachsenen anästhesierten Maus tastete der prominenteste Dornfortsatz in der Brustwirbelsäule ab. Analgesie und Antibiotika werden vor der Operation verabreicht.Rasieren Sie ein Längsrechteck auf der Rückseite der Maus vom unteren Hals bis knapp unter den markantesten Dornfortsatz und einen Zentimeter auf jeder Seite der Mittellinie. Desinfizieren Sie die exponierte Haut dreimal nacheinander mit 10 % Povidon, Jod und 70 % Ethanol in kreisförmiger Weise, beginnend an der Stelle des Einschnitts und nach außen. Decken Sie die Maus nach dem letzten Abwischen mit einem sterilen, vier mal vier Zoll großen Stück Mullschwamm mit einem Fenster über dem Operationsfeld ab.Um die Rückenmarksverletzung herbeizuführen, machen Sie zunächst einen 1,5 Zentimeter langen Schnitt in der Mitte des Rückens und trennen Sie mit einer scharfen, stumpfen Dissektion die Muskeln von den Dornfortsätzen und den Laminae der Wirbel T9, T10 und T11. Verwenden Sie eine feine Schere, um die interspinösen Bänder scharf zwischen T9 und T10 sowie T10 und T11 zu teilen, bevor Sie eine bilaterale Laminektomie des T10-Dornfortsatzes durchführen. Wenn die Laminae vollständig herausgeschnitten wurden, wird das Rückenmark mit der Schere durchtrennt.Um die seitlichen Säulen vollständig abzuschneiden, streichen Sie mit der Spitze der feinen Schere auf beiden Seiten vorsichtig über die Länge. Verwenden Sie ein steriles Wattestäbchen, um Blutungen zu komprimieren. Nachdem Sie die Homöostase erreicht haben, verschließen Sie die Haut mit 7-0 Polyglactin910 kontinuierlichen Nähten und verabreichen Sie subkutan einen Milliliter Kochsalzlösung, um eine postoperative Dehydrierung zu verhindern, und bringen Sie das Tier dann in einen frischen Käfig zurück, der bis zum vollständigen Liegen überwacht wird.Halten Sie das Tier alle 12 Stunden mit einer Hand fest und massieren Sie mit der anderen den Unterbauch, indem Sie mit Zeigefinger und Daumen die aufgeblähte Harnblase lokalisieren und sanft zusammendrücken, um die manuelle Blasenexpression zu stimulieren, bis das Tier in der Lage ist, selbstständig zu urinieren. Für die nachgelagerte Analyse der interessierenden Blasenzelltypen wird zum geeigneten Versuchszeitpunkt und sobald das Tier ausreichend anästhesiert ist, eine Mittellinien-Laparotomie vom Becken bis zum Zwerchfell durchgeführt und das Zwerchfell von den Rippen abgeschnitten. Entlang der Knochenknorpelgrenze parallel zum Brustbein den Thorax entlang der Rippen auf beiden Seiten des Tieres öffnen, beginnend am Zwerchfell bis zur ersten Rippe.Nachdem Sie die vordere Brustwand über dem Kopf des Tieres befestigt haben, schneiden Sie mit einer feinen Schere das Perikard ab und verbinden Sie eine 23-Gauge-Nadel mit dem Perfusionsapparat. Führen Sie die Nadel in den linken Ventrikel ein und schieben Sie die Nadel langsam in die Aorta vor, ohne das Gewebe zu punktieren. Wenn die Nadel an Ort und Stelle ist, beginnen Sie, das Gewebe mit PBS mit einer Flussrate von 15 Millilitern pro Minute zu infundieren, und verwenden Sie die Spitzen einer feinen Schere, um schnell einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof zu machen.Wenn die Drainage klar ist und eine aufgehellte Leberfarbe beobachtet werden kann, stoppen Sie die Perfusion und befreien Sie die Blase von den Gefäßstielen und der Harnröhre, dann legen Sie die Blase in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit eiskalter Tyrode-Lösung. Um eine Einzelzellsuspension herzustellen, wenn alle Blasen gesammelt wurden, reißen Sie ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 Mikrolitern Tyrode-Lösung ab. Nach dem Wiegen die Blase in einer 10 Zentimeter großen Petrischale mit 100 Mikrolitern Tyrode-Lösung zerkleinern und mit einer Pipettenspitze mit breitem Durchgang die Gewebefragmente in 2,5 Milliliter Verdauungspuffer pro Blase überführen.Inkubieren Sie das Gewebe 40 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf einem Nutator-Mischer und verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Pipette, um die Probe eine Minute lang zu zerreiben, bevor Sie die dissoziierten Zellen und Gewebe durch Zentrifugation sammeln. Suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Zellablösungslösung und legen Sie die Zellen für weitere 10 Minuten auf den Nutator-Mischer. Am Ende der Inkubation sammeln Sie die Zellen mit einer weiteren Zentrifugation und resuspendieren das Pellet in einem Milliliter Erythrozyten-Lysepuffer.Nach einer Minute stoppen Sie die Lyse mit der Zugabe von neun Millilitern PBS und filtrieren Sie die Zellen durch ein 70-Mikrometer-Sieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen, zentrifugieren Sie die Zellen erneut und resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern Färbepuffer, der mit dem FC-Block ergänzt ist. Nach einer 10-minütigen Inkubation auf Eis werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und das Pellet in dem entsprechenden Volumen des Fluorophor-konjugierten Antikörper-Mastermixes für 20 Minuten auf lichtgeschütztem Eis resuspendiert. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter Zellfärbepuffer und resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern frischem Zellfärbepuffer, der mit fünf Mikrolitern FITC Annexin V und einem Mikroliter Propidiumiodid ergänzt wird.Nach 15 Minuten bei Raumtemperatur 400 Mikroliter Annexin-Bindungspuffer in die Zellen geben und durch Inversion mischen. Um die Zellen mittels Durchflusszytometrie zu analysieren, verwenden Sie zunächst eine ungefärbte Zellprobe, um die Seiten- und Vorwärtsstreuparameter der Zellen einzustellen, und messen Sie dann die Fluoreszenzemission bei 530 Nanometern und mehr als 575 Nanometern, um die toten Zellen auszuschließen. Verwenden Sie die Gitter auf jedem Dot-Blot, um die negative Population im ersten Zerfall zu definieren, und verwenden Sie die Fluoreszenz-Minus-Eins-Regler, um die spektrale Überlappung zu korrigieren, bis das Medium der negativen und positiven Population ausgerichtet ist.Messen Sie dann 100.000 Ereignisse der Zellen mit den spezifischen interessierenden Markern und erstellen Sie bei Bedarf Gates für die interessierenden Zellpopulationen. Wenn alle Proben entnommen wurden, analysieren Sie die Daten mit der entsprechenden durchflusszytometrischen Analysesoftware. Kollagen 1A1, Kollagen 3A1, Kollagen 1A2 und Kollagen 6A1 sind die am häufigsten vorkommenden Kollagentypen, die in der Blase der Maus vorkommen.Die Analyse zur Bestimmung der mRNA-Expressionsniveaus der Kollagene eins, drei, sechs und Hyaluronan zeigt, dass die Expression dieser extrazellulären Matrixkomponenten in mesenchymalen Zellpopulationen häufiger vorkommt als im Urothel. Die durchflusszytometrische Analyse zeigt, dass mehrere verschiedene enzymatische Verdauprotokolle zu hochlebensfähigen Zellpopulationen führen, wobei das dritte in dieser Analyse verwendete Verdauprotokoll als das effektivste bei der Zellkonservierung eingestuft wurde. Mit dieser Methode kann eine signifikante Erhöhung der Gesamtzahl der aus der Blase von Mäusen mit Rückenmarksverletzung isolierten Zellen erzielt werden, um sie mit Kontrollblasen zu vergleichen.Im Vergleich zu Kontrollen weisen auch die Blasen von Tieren mit Querschnittlähmung einen signifikanten Anstieg an CD45-positiven Zellen auf. Schritt 7.1 ist wichtig für die Identifizierung in der Herzpopulation. Die Gating-Strategie sollte von den interessierenden Zellen beeinflusst werden.Die Blasen von Querschnittgelähmten haben eine ausgeprägte Zellpopulation. Dieses Protokoll kann für die Zellsortierung, primäre Zellkultur, Einzelzellsequenzierung und andere molekulare und zelluläre Downstream-Verfahren verwendet werden, die lebensfähige Einzelzellen erfordern. Dieses Protokoll bietet eine hohe Lebensfähigkeit und damit einen geringen Verlust an Zellpopulationen, was ein wichtiger Punkt für Einzelzellanalysetechniken wie die Einzelzell-RNA-Sequenzierung ist.

a-single-cell-dissociation-approach-for-molecular-analysis-urinary

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Isolating adulten Stammzellen aus Muskel-Skelett Weichteile auf der Grundlage der Zelle Einhaltung Geschwindigkeit Kolben.

Isolating Stammzellen aus Soft-Gewebe des Bewegungsapparates

Ein optimiertes Verfahren zur Neuralleiste abgeleitet neuronalen Vorläuferzellen-aus fetalen Gewebe der Maus zu reinigen, wird beschrieben. Diese Methode nutzt die Vorteile der Ausdruck von fluoreszierenden Reporter-Allele zu diskreten Populationen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) zu isolieren. Die Technik kann angewendet, um neuronale Subpopulationen während der Entwicklung oder von adulten Geweben zu isolieren.

Eine optimierte Methode für Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) Isolierung von Autonomic neuralen Vorläuferzellen aus inneren Organen des Fötus Mäuse

Quelle: Yang, E. et al. Isolierung einzelner intrazellulärer bakterieller Gemeinschaften, die aus einem Mausmodell der Harnwegsinfektion erzeugt wurden, für eine nachgelagerte Einzelzellanalyse. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video demonstriert die manuelle Isolierung einzelner Epithelzellen, die intrazelluläre Bakteriengemeinschaften aus infizierten Mausblasen enthalten, mittels Mund-Mikropipettierung und ermöglicht so eine nachgeschaltete Einzelzellanalyse lebensfähiger, wirtsassozoziierter...

Isolierung von Mausblasenepithelzellen mit intrazellulären Bakteriengemeinschaften

Das etablierte Modell der transurethrale Katheterisierung von Mäusen ermöglicht die Untersuchung von Erkrankungen der Blase, einschließlich urinausscheidende Fläche Infektion, aber kann nur bei Frauen durchgeführt werden. Ein neues Modell der männlichen transurethrale Instillation, das hier vorgestellte wird Forschung in einem Gebiet, geprägt von starken klinischen und epidemiologischen Unterschiede zwischen den Geschlechtern zu ermöglichen.

Urinausscheidende Fläche Infektion in eine kleine Tiermodell: transurethrale Katheterisierung von männlichen und weiblichen Mäusen

Hier zeigen wir die Leistung eines minimalen Rückenmark Verletzungen Modells in einer Erwachsenen Maus, die den zentralen Kanal Nische Gehäuse endogenen neurale Stammzellen (NSCs) erspart. Wir zeigen, wie neurosphäre Assay verwendet werden kann, um Aktivierung und Migration der definitive und primitiven NSCs nach Verletzung zu quantifizieren.

Ein Neurosphäre Assay auszuwertende endogenen neurale Stammzellen Aktivierung in einem Mausmodell der minimalen Spinal Cord Injury

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Isolierung von einzelner, infizierte Blase Epithelzellen aus einem Mausmodell der urinausscheidende Fläche Infektion.

Isolierung der einzelnen intrazelluläre bakterielle Gemeinschaften erzeugt aus einem Mausmodell der urinausscheidende Fläche Infektion nachgelagerten Einzeller Analysezwecken

Dieses Protokoll versucht, ein wiederholbares Protokoll für primäre Neuronen und Gliaisolation von Rattenblase für weitere zelluläre Experimente zu etablieren.

Isolation und Kultur der primär neuronen und Glia von Adult Ratte Harnblase

Dieses neuronale Zelldissoziationsprotokoll ist für Proben mit einer geringen Menge an Ausgangsmaterial vorgesehen und liefert eine hochgradig lebensfähige Einzelzellsuspension für die nachgelagerte Analyse mit optionalen Fixations- und Färbeschritten.

Kombinierte mechanische und enzymatische Dissoziation von Hippocampusgewebe des Gehirns der Maus

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Erzeugung und Charakterisierung von Urothelorganoiden der Maus, die Deletionen in interessanten Genen beherbergen. Die Methoden umfassen die Gewinnung von Maus-Urothelzellen, die Ex-vivo-Transduktion mit Adenovirus-treibender Cre-Expression mit einem CMV-Promotor sowie die In-vitro- sowie In-vivo-Charakterisierung.

Ex vivo Organoid-Modell von Adenovirus-Cre-vermittelten Gendeletionen in Urothelzellen der Maus

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von gereinigten Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark der erwachsenen Maus und erleichtert spätere Anwendungen wie RNA-Analyse und Zellkultur. Es umfasst detaillierte Zelldissoziationsmethoden und -verfahren, die darauf ausgelegt sind, sowohl die Qualität als auch die Ausbeute isolierter Zellen zu verbessern.

Isolierung von reinen Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark adulter Mäuse für In-vitro-Assays und Transkriptomstudien

Diese Studie stellt zwei entscheidende experimentelle Techniken vor: die Konstruktion eines murinen Wundmodells zur Beurteilung des Wundverschlusses und die Herstellung von einzelligen Suspensionen aus der Haut von Mäusen, um die zelluläre Lebensfähigkeit zu erhalten.

Maus-Wundmodelle und Herstellung von Einzelzellsuspensionen

Lernen Sie einen optimierten Einzelzell-Dissoziationsansatz für die Analyse der Mausharnblase nach Rückenmarksverletzung. Diese Methode liefert hochviable Zellsuspensionen für Durchflusszytometrie und molekulare Studien.

Ein Einzelzell-Dissoziationsansatz für die molekulare Analyse der Harnblase in der Maus nach Einer Rückenmarksverletzung

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