Ein Einzelzell-Dissoziationsansatz für die molekulare Analyse der Harnblase in der Maus nach Einer Rückenmarksverletzung

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es biologische Informationen verwendet, um die Erzeugung einer Einzelzellsuspension mit hoher Zellviabilität zu erleichtern. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, Einzelzellsuspensionen zu erzeugen, die eine hohe Zellviabilität und eine angemessene Repräsentation der isolierten Zelltypen aufweisen. Der chirurgische Eingriff wird von Hussein Atta, einem Mitarbeiter in meinem Labor, vorgeführt.

Das Verfahren der Gewebedissoziation wird von Ali Hashemi und der FACS-Analyse, Yaser Heshmati, demonstriert. Nach der Bestätigung einer mangelnden Reaktion auf den Pedalreflex bei einer erwachsenen anästhesierten Maus tastete der prominenteste Dornfortsatz in der Brustwirbelsäule ab. Analgesie und Antibiotika werden vor der Operation verabreicht.

Rasieren Sie ein Längsrechteck auf der Rückseite der Maus vom unteren Hals bis knapp unter den markantesten Dornfortsatz und einen Zentimeter auf jeder Seite der Mittellinie. Desinfizieren Sie die exponierte Haut dreimal nacheinander mit 10 % Povidon, Jod und 70 % Ethanol in kreisförmiger Weise, beginnend an der Stelle des Einschnitts und nach außen. Decken Sie die Maus nach dem letzten Abwischen mit einem sterilen, vier mal vier Zoll großen Stück Mullschwamm mit einem Fenster über dem Operationsfeld ab.

Um die Rückenmarksverletzung herbeizuführen, machen Sie zunächst einen 1,5 Zentimeter langen Schnitt in der Mitte des Rückens und trennen Sie mit einer scharfen, stumpfen Dissektion die Muskeln von den Dornfortsätzen und den Laminae der Wirbel T9, T10 und T11. Verwenden Sie eine feine Schere, um die interspinösen Bänder scharf zwischen T9 und T10 sowie T10 und T11 zu teilen, bevor Sie eine bilaterale Laminektomie des T10-Dornfortsatzes durchführen. Wenn die Laminae vollständig herausgeschnitten wurden, wird das Rückenmark mit der Schere durchtrennt.

Um die seitlichen Säulen vollständig abzuschneiden, streichen Sie mit der Spitze der feinen Schere auf beiden Seiten vorsichtig über die Länge. Verwenden Sie ein steriles Wattestäbchen, um Blutungen zu komprimieren. Nachdem Sie die Homöostase erreicht haben, verschließen Sie die Haut mit 7-0 Polyglactin910 kontinuierlichen Nähten und verabreichen Sie subkutan einen Milliliter Kochsalzlösung, um eine postoperative Dehydrierung zu verhindern, und bringen Sie das Tier dann in einen frischen Käfig zurück, der bis zum vollständigen Liegen überwacht wird.

Halten Sie das Tier alle 12 Stunden mit einer Hand fest und massieren Sie mit der anderen den Unterbauch, indem Sie mit Zeigefinger und Daumen die aufgeblähte Harnblase lokalisieren und sanft zusammendrücken, um die manuelle Blasenexpression zu stimulieren, bis das Tier in der Lage ist, selbstständig zu urinieren. Für die nachgelagerte Analyse der interessierenden Blasenzelltypen wird zum geeigneten Versuchszeitpunkt und sobald das Tier ausreichend anästhesiert ist, eine Mittellinien-Laparotomie vom Becken bis zum Zwerchfell durchgeführt und das Zwerchfell von den Rippen abgeschnitten. Entlang der Knochenknorpelgrenze parallel zum Brustbein den Thorax entlang der Rippen auf beiden Seiten des Tieres öffnen, beginnend am Zwerchfell bis zur ersten Rippe.

Nachdem Sie die vordere Brustwand über dem Kopf des Tieres befestigt haben, schneiden Sie mit einer feinen Schere das Perikard ab und verbinden Sie eine 23-Gauge-Nadel mit dem Perfusionsapparat. Führen Sie die Nadel in den linken Ventrikel ein und schieben Sie die Nadel langsam in die Aorta vor, ohne das Gewebe zu punktieren. Wenn die Nadel an Ort und Stelle ist, beginnen Sie, das Gewebe mit PBS mit einer Flussrate von 15 Millilitern pro Minute zu infundieren, und verwenden Sie die Spitzen einer feinen Schere, um schnell einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof zu machen.

Wenn die Drainage klar ist und eine aufgehellte Leberfarbe beobachtet werden kann, stoppen Sie die Perfusion und befreien Sie die Blase von den Gefäßstielen und der Harnröhre, dann legen Sie die Blase in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit eiskalter Tyrode-Lösung. Um eine Einzelzellsuspension herzustellen, wenn alle Blasen gesammelt wurden, reißen Sie ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 Mikrolitern Tyrode-Lösung ab. Nach dem Wiegen die Blase in einer 10 Zentimeter großen Petrischale mit 100 Mikrolitern Tyrode-Lösung zerkleinern und mit einer Pipettenspitze mit breitem Durchgang die Gewebefragmente in 2,5 Milliliter Verdauungspuffer pro Blase überführen.

Inkubieren Sie das Gewebe 40 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf einem Nutator-Mischer und verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Pipette, um die Probe eine Minute lang zu zerreiben, bevor Sie die dissoziierten Zellen und Gewebe durch Zentrifugation sammeln. Suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Zellablösungslösung und legen Sie die Zellen für weitere 10 Minuten auf den Nutator-Mischer. Am Ende der Inkubation sammeln Sie die Zellen mit einer weiteren Zentrifugation und resuspendieren das Pellet in einem Milliliter Erythrozyten-Lysepuffer

Nach einer Minute stoppen Sie die Lyse mit der Zugabe von neun Millilitern PBS und filtrieren Sie die Zellen durch ein 70-Mikrometer-Sieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen, zentrifugieren Sie die Zellen erneut und resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern Färbepuffer, der mit dem FC-Block ergänzt ist. Nach einer 10-minütigen Inkubation auf Eis werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und das Pellet in dem entsprechenden Volumen des Fluorophor-konjugierten Antikörper-Mastermixes für 20 Minuten auf lichtgeschütztem Eis resuspendiert. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter Zellfärbepuffer und resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern frischem Zellfärbepuffer, der mit fünf Mikrolitern FITC Annexin V und einem Mikroliter Propidiumiodid ergänzt wird.

Nach 15 Minuten bei Raumtemperatur 400 Mikroliter Annexin-Bindungspuffer in die Zellen geben und durch Inversion mischen. Um die Zellen mittels Durchflusszytometrie zu analysieren, verwenden Sie zunächst eine ungefärbte Zellprobe, um die Seiten- und Vorwärtsstreuparameter der Zellen einzustellen, und messen Sie dann die Fluoreszenzemission bei 530 Nanometern und mehr als 575 Nanometern, um die toten Zellen auszuschließen. Verwenden Sie die Gitter auf jedem Dot-Blot, um die negative Population im ersten Zerfall zu definieren, und verwenden Sie die Fluoreszenz-Minus-Eins-Regler, um die spektrale Überlappung zu korrigieren, bis das Medium der negativen und positiven Population ausgerichtet ist.

Messen Sie dann 100.000 Ereignisse der Zellen mit den spezifischen interessierenden Markern und erstellen Sie bei Bedarf Gates für die interessierenden Zellpopulationen. Wenn alle Proben entnommen wurden, analysieren Sie die Daten mit der entsprechenden durchflusszytometrischen Analysesoftware. Kollagen 1A1, Kollagen 3A1, Kollagen 1A2 und Kollagen 6A1 sind die am häufigsten vorkommenden Kollagentypen, die in der Blase der Maus vorkommen.

Die Analyse zur Bestimmung der mRNA-Expressionsniveaus der Kollagene eins, drei, sechs und Hyaluronan zeigt, dass die Expression dieser extrazellulären Matrixkomponenten in mesenchymalen Zellpopulationen häufiger vorkommt als im Urothel. Die durchflusszytometrische Analyse zeigt, dass mehrere verschiedene enzymatische Verdauprotokolle zu hochlebensfähigen Zellpopulationen führen, wobei das dritte in dieser Analyse verwendete Verdauprotokoll als das effektivste bei der Zellkonservierung eingestuft wurde. Mit dieser Methode kann eine signifikante Erhöhung der Gesamtzahl der aus der Blase von Mäusen mit Rückenmarksverletzung isolierten Zellen erzielt werden, um sie mit Kontrollblasen zu vergleichen.

Im Vergleich zu Kontrollen weisen auch die Blasen von Tieren mit Querschnittlähmung einen signifikanten Anstieg an CD45-positiven Zellen auf. Schritt 7.1 ist wichtig für die Identifizierung in der Herzpopulation. Die Gating-Strategie sollte von den interessierenden Zellen beeinflusst werden.

Die Blasen von Querschnittgelähmten haben eine ausgeprägte Zellpopulation. Dieses Protokoll kann für die Zellsortierung, primäre Zellkultur, Einzelzellsequenzierung und andere molekulare und zelluläre Downstream-Verfahren verwendet werden, die lebensfähige Einzelzellen erfordern. Dieses Protokoll bietet eine hohe Lebensfähigkeit und damit einen geringen Verlust an Zellpopulationen, was ein wichtiger Punkt für Einzelzellanalysetechniken wie die Einzelzell-RNA-Sequenzierung ist.