Name: Analyse des menschlichen natürlichen Killerzellstoffwechsels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Glykolyse und mitochondriale Atmung in primären menschlichen NK-Zellen mit einem extrazellulären Flux-Analysator messen. Diese hochdurchsatzfähige Methode erfordert geringe Zellmengen und ermöglicht klinische Anwendungen bei Stoffwechselerkrankungen.

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Die Autoren danken Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) für die Unterstützung und Diskussion. Diese Studie wurde von den Intramural Research Programs der National Institutes of Health, national Cancer Institute und National Heart, Lung, and Blood Institute unterstützt. JT wird durch das Ramon y Cajal-Programm (Grant RYC2018-026050-I) von MICINN (Spanien) unterstützt.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

In diesem Beitrag haben wir ein Protokoll zur effizienten Isolierung und Kultivierung reiner und lebensfähiger primärer menschlicher NK-Zellen aus peripherem Blut erstellt. Wir haben auch die Bedingungen für die Messung der Metabolischen Aktivität dieser NK-Zellen optimiert, die durch Sauerstoffverbrauch und extrazelluläre Versauerungsrate mit Hilfe eines extrazellulären Flussanalysators beurteilt werden. Im Vergleich zu anderen respirometrischen Methoden ist der extrazelluläre Flussanalysator schnell, erfordert eine ger...

Natürliche Killerzellen (NK) sind angeborene Lymphozyten, die Antitumor- und antivirale Reaktionen vermitteln. NK-Zellen machen 5-15% aller Lymphozyten im menschlichen peripheren Blut aus und können auch in Milz-, Leber-, Knochenmark- und Lymphknoten gefunden werden. NK-Zellen exprimieren keine polymorphen Clonoppic-Rezeptoren wie T-Zell-Rezeptoren (TCR) oder B-Zell-Rezeptoren (BCR). Im Gegensatz dazu wird die Aktivierung ihrer zytolytischen Funktionen durch das Eingreifen von Rezeptoren ausgelöst, die unveränderliche Liganden auf der Oberfläche einer Zielzelle1,2erkennen.
Ruhende menschliche NK-Zellen, die aus peripherem Blut isoliert sind, können mehrere Tage im Kulturmedium überleben, das mit menschlichem Serum ergänzt wird. Die Aktivierung von NK-Zellen durch Zytokine wie IL-15 oder IL-2 treibt die Zellen zur Proliferation und zu einer Erhöhung ihrer Tötungsfähigkeit, unter anderem3,4,5. Mehrere Studien haben eine direkte Korrelation zwischen NK-Zellaktivierung und Veränderungen ihrer metabolischen Aktivität gezeigt6. Diese metabolischen Veränderungen sind dazu bestimmt, die besonderen Anforderungen der Zellen in Bezug auf Energie und Biosynthese zu erfüllen.
Aerobe Zellen und Organismen erhalten Energie durch eine Reihe von chemischen Reaktionen, die den Katabolismus und die Oxidation von Kohlenhydraten, Fett und Proteinen beinhalten. Durch eine Kombination aus Glykolyse, dem Tricarbonsäurezyklus (TCA) und oxidativer Phosphorylierung erfüllen eukaryotische Zellen den Großteil ihres ATP-Bedarfs und erhalten Zwischenprodukte, die als Bausteine für Makromoleküle benötigt werden, die für das Zellwachstum und die Zellproliferation unerlässlich sind. Der Prozess der Glykolyse (Abbildung 1A) beginnt mit dem Eintrag von Glukose in der Zelle. Im Zytosol wird Glukose phosphoryliert und in Pyruvat umgewandelt (mit einer Nettoproduktion von 2 Molekülen VON ATP pro Glukosemolekül), die zu Laktat reduziert oder in die Mitochondrien transportiert werden können, um in Acetyl-CoA umgewandelt zu werden und in den TCA-Zyklus einzutreten. Der TCA-Zyklus setzt den Zyklus mit mehr Molekülen von Acetyl-CoA weiter und produziert CO2 (das schließlich außerhalb der Zelle diffundieren wird und durch Reaktion mitH2O im Medium Kohlensäure erzeugt, die zur Versauerung des Mediums führt) und NADH, dem Molekül, das für die Elektronenabgabe an die Elektronentransportkette (ETC) zuständig ist. Die Elektronen wandern durch verschiedene Proteinkomplexe und werden schließlich durch Sauerstoff akzeptiert. Diese Komplexe (I, III und IV) pumpen auch H+ aus der mitochondrialen Matrix in den Intermembranraum. Als Folge des erzeugten elektrochemischen Gradienten wird das H+ durch die komplexe V (ATP-Synthase) wieder in die Matrix eindringen und die in die ATP-Erzeugung angesammelte potentielle Energie investieren.
Sowohl die Glykolyse als auch die mitochondriale Atmung können an verschiedenen Stellen durch die Verwendung von Inhibitoren blockiert werden. Das Wissen und die Verwendung dieser Inhibitoren war die Grundlage für die Entwicklung des extrazellulären Fluss-Assays. Durch die Messung von zwei einfachen Parametern in Echtzeit wie pH und Sauerstoff leitet der extrazelluläre Flussanalysator die Rate der Glykolyse und der mitochondrialen Atmung in einer 96-Well-Platte ab. Der Glykolyse-Stresstest wird in einem Basalmedium ohne Glukose durchgeführt (Abbildung 1B)7. Die ersten Messungen der extrazellulären Versauerungsrate (ECAR) deuten auf eine glykolyseunabhängige Versauerung hin. Es wird als nicht-glykolytische Versauerung bezeichnet und korreliert mitCO2, das von der TCA produziert wird, die, wie bereits erläutert, mitH2O im Medium kombiniert wird, um H+ (TCA-verknüpftes ECAR) zu erzeugen. Die erste Injektion ist Glukose, um Glukose-Nutzung zu induzieren und DieGlykolyse zu steigern. Die zweite Injektion kombiniert sowohl Roton- als auch ein Complex-I-Hemmer und Antimycin A, ein Komplexer III-Hemmer zusammen, um den ETC zu blockieren. Zellen reagieren auf diese dramatische Abnahme der mitochondrialen ATP-Produktion durch Aktivierung der Glykolyse zur Aufrechterhaltung der zellulären ATP-Spiegel, und dies stellt die Menge an Glykolyse dar, die von der Zelle im Basalzustand nicht verwendet wird, sondern möglicherweise als Reaktion auf die Erhöhung der ATP-Nachfrage rekrutiert werden könnte. Die dritte Injektion ist die Glukose analog e2-Deoxyglucose (DG), die mit Glukose als Substrat für das Enzym Hexokinase konkurriert. Das Produkt dieser Phosphorylierung, 2-Deoxyglucose-6-Phosphat kann nicht in Pyruvat umgewandelt werden, und daher wird die Glykolyse blockiert, was das ECAR auf das Minimum senkt. Das an dieser Stelle gemessene ECAR umfasst andere Quellen der extrazellulären Versauerung, die nicht der Glykolyse oder Atemaktivität zugeschrieben werden, sowie jede verbleibende Glykolyse, die durch 2-DG (nach der 2-DG-Versauerung) nicht vollständig gehemmt wird.
Der mitochondriale Stresstest wird in einem Medium mit Glukose durchgeführt (Abbildung 1C)8. Die ersten Messungen der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) entsprechen der Grundlinie der mitochondrialen Atmung (Basalatmung). Die erste Injektion ist Oligomycin, das die Rückkehr von Protonen durch die ATP-Synthase (Komplex V) hemmt, die ATP-Synthese blockiert und damit die mitochondriale Membran schnell hyperpolarisiert, was ein weiteres Protonenpumpen durch Atemkomplexe verhindert und zu einer Abnahme der OCR führt. Der Vergleich zwischen der Basisatmung und dem durch Addition von Oligomycin angegebenen Wert stellt die ATP-verknüpfte Atmung dar. Die verbleibende Oligomycin-unempfindliche Rate des Sauerstoffverbrauchs wird Protonenleck genannt, das den Fluss von Protonen durch die Lipid-Doppelschicht oder Proteine in der inneren mitochondrialen Membran wie das Adenin-Nukleotid-Translocase9darstellt. Die zweite Injektion ist der Unkoppler 2,4-Dinitrophenol (DNP), ein Ionophor, das einen massiven Eintrag von H+ in die mitochondriale Matrix induziert, was zu einer Depolarisation der mitochondrialen Membran und einer Störung der mitochondrialen ATP-Synthese führt. Zellen reagieren auf die Ableitung der Protonen-Antriebskraft, indem sie die Rate des Elektronentransports und des Sauerstoffverbrauchs auf ein Höchstmaß erhöhen, um das Membranpotenzial (maximale Atemkapazität) wiederzuerlangen. Der Unterschied zwischen der maximalen Atemfrequenz und der Basalatmung ist die freie Atemkapazität der Zelle, die die Menge der Atmung darstellt, die nicht von der Zelle verwendet wird, um ATP im Basalzustand zu erzeugen, sondern möglicherweise als Reaktion auf die Erhöhung der ATP-Nachfrage oder unter Stressbedingungen eingestellt werden könnte8. Die dritte Injektion ist eine Kombination aus Roton und Antimycin A. Diese Injektion stoppt die ETC vollständig und OCR sinkt auf den niedrigsten Stand, wobei der verbleibende Sauerstoffverbrauch nicht mitochondrial ist (verursacht durch NADPH-Oxidasen usw.).
Veränderungen der Stoffwechselwege könnten irgendwie die Funktionsweise von NK-Zellen vorhersagen, da es vorgeschlagen wurde, dass die kontinuierliche Aktivierung von NK-Zellen mit Zytokinen in vitro zu einer Erschöpfung der NK-Zellen durch die Untersuchung verschiedener Stoffwechselwege führen könnte10,11. Die Korrelation zwischen dem metabolischen Status und der Funktion der NK-Zelle ist aus der Sicht der Krebsimmuntherapie sehr wichtig. In diesem Bereich wurde die Aktivierung von NK-Zellen mit Infusion von IL-15, allein oder in Kombination mit monoklonalen therapeutischen Antikörpern getestet, um die Tumorzelltötung12,13,14zu verbessern. Das Wissen um den metabolischen Status der NK-Zellen als Reaktion auf diese Behandlungsstrategien würde einen wertvollen Prädiktor für den Aktivierungsstatus und die Tötungsfunktion der NK-Zellen liefern.
Die Untersuchung von Stoffwechselwegen in anderen myeloischen und lymphoiden Zellen wie Monozyten, T- und B-Zellen wurde beschrieben15 und optimierte Methoden wurden veröffentlicht16. In diesem Protokoll bieten wir eine Methode, die sowohl ein NK-Isolationsprotokoll kombiniert, das eine hohe Anzahl reiner und lebensfähiger NK-Zellen liefert, als auch ein optimiertes Protokoll zur Messung der metabolischen Aktivität mit einem extrazellulären Flussanalysator. Hier zeigen wir, dass dies eine gültige Methode für die Untersuchung von metabolischen Veränderungen in ruhenden und IL-15 aktivierten menschlichen NK-Zellen ist. Für den extrazellulären Flusstest wurden Parameter wie Zellzahl und Wirkstoffkonzentrationen getestet und optimiert. Im Vergleich zu anderen respirometrischen Methoden ist der extrazelluläre Flussanalysator vollautomatisch und in der Lage, in Echtzeit zu testen, mit sehr geringen Zellmengen, bis zu 92 Proben gleichzeitig, und ermöglicht somit Hochdurchsatz-Screenings (mit mehreren Proben und Replikationen) relativ schnell17.
Diese Methode kann von Forschern verwendet werden, die an der Beurteilung der NK-Zellfunktion interessiert sind, indem sie den NK-Zellstoffwechsel untersuchen. Es könnte auch auf Zellen angewendet werden, die durch andere Zytokine, Antikörper oder lösliche Reize aktiviert werden.

<table><tbody><tr><td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D8375-5G</td><td>Glykolyse-Stresstest-Injektorverbindung</td></tr><tr><td>2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D198501</td><td>ETC Entkoppler / mitochondriale Stresstest-Injektorverbindung</td></tr><tr><td>96 Well Zellkulturplatte / runder Boden mit Deckel</td><td>Costar</td><td>3799</td><td>NK Zellkultur</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>MilliporeSigma</td><td>A8674</td><td>Komplex-III-Inhibitor / Glykolyse und mitochondrialer Stresstest Injektorverbindung</td></tr><tr><td>BD FACSDIVA Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Flow-Datenerfassung</td></tr><tr><td>BD LSR Fortessa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Flow-Datenerfassung</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>Zellklebstoff</td></tr><tr><td>CyQUANT Zellproliferationsassay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C7026</td><td>Zellproliferations-Assay zur DNA-Quantifizierung. Enthält Zelllysepuffer und CyQUANT GR-Farbstoff</td></tr><tr><td>EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>17851</td><td>NK-Zellisolierung aus PBMCs</td></tr><tr><td>EasySep Human NK cell Enrichment Kit</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>19055</td><td>NK-Zellisolierung aus PBMCs</td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>Stemcell technologies</td><td>18001</td><td>NK-Zellisolierung aus PBMCs</td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M,</td><td>pH 8 Qualität Biologisch</td><td>10128-446</td><td>NK verkaufen Trennpuffer</td></tr><tr><td>FACS-Röhrchen</td><td>Falcon-Fisher Scientific</td><td>352235</td><td>Durchflusszytometrie-Experiment</td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Konische Röhrchen</td><td>Falcon-Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>NK Zelltrennung</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td>NK Zelltrennungspuffer</td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Analyse von Strömungsdaten</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>MilliporeSigma</td><td>G8270</td><td>Bestandteil des mitochondrialen Stresstestmediums. Glykolyse-Stresstest-Injektor-Verbindung</td></tr><tr><td>Halt Protease-Inhibitor Cocktail</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78429</td><td>Protease-Inhibitor 100X. Verwendung in RIPA-Lysepuffer</td></tr><tr><td>Humanes IL-15</td><td>Peprotech</td><td>200-15-50ug</td><td>NK-Zellstimulation</td></tr><tr><td>Humanserum (HS)</td><td>Valley Biomedical</td><td>9C0539</td><td>NK Zellkulturmedium Ergänzung</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440053 NK-Zelle</td><td> Nährmedium</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-081</td><td>Bestandteil des Stresstestmediums</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixierbares Aqua Dead Cell Stain Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34965</td><td>Viabilitätsfarbstoff für die Durchflusszytometrie-Färbung</td></tr><tr><td>LSM</td><td>mpbio</td><td>50494X</td><td>PBMCs Trennung aus menschlichem Blut</td></tr><tr><td>Maus Anti-Human-CD3 BV711</td><td>BD Biosciences</td><td>563725</td><td>T-Zell-Durchflusszytometrie-Färbung</td></tr><tr><td>Maus Anti-Human-CD56 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>555516</td><td>NK Durchflusszytometrie-Färbung</td></tr><tr><td>Maus Anti-Human-Färbung NKp46 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>557991</td><td>NK Durchflusszytometrie-Färbung</td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>MilliporeSigma</td><td>75351</td><td>Komplex V-Inhibitor / Mitochondrien-Stresstest Injektorverbindung</td></tr><tr><td>PBS pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010-023 NK-Zelle</td><td> Trennpuffer</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td>Zur Bestimmung der Proteinkonzentration</td></tr><tr><td>RIPA Puffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-115</td><td>Zelllyse</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>MilliporeSigma</td><td>R8875</td><td>Komplex II Inhibitor / Glykolyse und mitochondrialer Stresstest Injektorverbindung</td></tr><tr><td>Seahorse Wave Controller Software</td><td>Agilent</td><td></td><td>Controller für das Seahorse XFe96 Analyzer</td></tr><tr><td>Seahorse Wave Desktop Software</td><td>Agilent</td><td></td><td>Für die Datenanalyse</td></tr><tr><td>Seahorse XF Base</td><td>Medium Agilent</td><td>102353-100</td><td>Extracellular Flux Assay Base</td></tr> Medium <tr><td>Seahorse XFe96 Analyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td>Extracellular Flux Analyzer</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102416-100</td><td>Enthält 20 XF96-Zellkulturplatten, 18 XFe96-Sensorpatronen, Ladeschablonen für die Übertragung von Verbindungen auf die Assay-Kartusche und 1 Flasche Kalibrierlösung (500 ml).</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>MilliporeSigma</td><td>S5761</td><td>Zur Herstellung der Cell-Tak-Lösung</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-070</td><td>Bestandteil des mitochondrialen Stresstestmediums</td></tr></tbody></table>

analyse des menschlichen natürlichen killerzellstoffwechsels

Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

Natural Killer (NK) Zellen vermitteln hauptsächlich angeborene Anti-Tumor- und antivirale Immunreaktionen und reagieren auf eine Vielzahl von Zytokinen und anderen Reizen, um das Überleben, die Zellproliferation, die Produktion von Zytokinen wie Interferongamma (IFN) und/oder Zytotoxizitätsprogramme zu fördern. Die Aktivierung von NK-Zellen durch Zytokinstimulation erfordert eine erhebliche Umgestaltung der Stoffwechselwege, um ihre bioenergetischen und biosynthetischen Anforderungen zu unterstützen. Es gibt eine große Menge von Beweisen, die darauf hindeuten, dass beeinträchtigter NK-Zellstoffwechsel mit einer Reihe von chronischen Krankheiten wie Fettleibigkeit und Krebs verbunden ist, was die klinische Bedeutung der Verfügbarkeit einer Methode zur Bestimmung des NK-Zellstoffwechsels unterstreicht. Hier beschreiben wir den Einsatz eines extrazellulären Flussanalysators, einer Plattform, die Echtzeitmessungen der Glykolyse und des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs ermöglicht, als Werkzeug zur Überwachung von Veränderungen im Energiestoffwechsel menschlicher NK-Zellen. Die hier beschriebene Methode ermöglicht auch die Überwachung von Stoffwechselveränderungen nach der Stimulation von NK-Zellen mit Zytokinen wie IL-15, einem System, das derzeit in einer Vielzahl von klinischen Studien untersucht wird.

Die Isolierung von NK-Zellen aus peripherem Blut sorgt für eine reine und lebensfähige Population
Der extrazelluläre Flusstest basiert auf der Messung der H+ undO2-Konzentration im Brunnen und unterscheidet nicht zwischen verschiedenen PopulationsvonZellen oder ihrer Lebensfähigkeit. Aus diesem Grund war die Erlangung einer sehr reinen und lebensfähigen Population der Zelle von Interesse der schlüsselfertige Schritt, um in diesen Experimenten erfolgreich ...

In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zur Messung der Glykolyse und mitochondrialen Atmung in primären menschlichen natürlichen Killerzellen (NK), die aus peripherem Blut isoliert sind, im Ruhezustand oder nach IL15-induzierter Aktivierung. Das beschriebene Protokoll könnte leicht auf primäre menschliche NK-Zellen ausgedehnt werden, die durch andere Zytokine oder lösliche Reize aktiviert werden.

Analyse des menschlichen natürlichen Killerzellstoffwechsels

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...

Diese Methode ermöglicht die Bestimmung des natürlichen Killerzellstoffwechsels. Ein wichtiger Parameter bei der Aktivierung durch Messung von Sauerstoffverbrauch und pH-Änderungen im extrazellulären Medium. Der Vorteil des extrazellulären Flussanalysators ist, dass er vollautomatisch ist und in der Lage ist, bis zu 92 Proben in Echtzeit mit geringen Zellmengen zu testen.Somit können Bildschirme mit hohem Durchsatz angezeigt werden. Eine gültige Methode zur Bestimmung der Glykolyse und Atmung in Inky-Zellen ist in der Klinik sehr wichtig. Da gibt es viele Krankheiten einschließlich Fettleibigkeit und Krebs, wo Inky Zellstoffwechsel beeinträchtigt ist.Beginnen Sie mit der Pipettierung von 20 Milliliterlymphozytentrennmedium in ein 50 Milliliter konisches Rohr. Während Halten Sie das Rohr im 30-Grad-Winkel, sanft Pipette 20 Milliliter Blut über das Medium. Erstellen einer sichtbaren und klar definierten Schnittstelle zwischen den beiden Flüssigkeiten.Zentrifugieren Sie die Rohre für 25 Minuten bei 1000 mal G.Dann nehmen Sie die Rohre vorsichtig aus der Zentrifuge und legen Sie sie in ein Rack. Prüfen Sie, ob eine auffällige Zellschicht an der Schnittstelle zwischen LSM und Plasma auftritt. Die mononukleäre Zellschicht vorsichtig mit einer 10-Milliliter-Kunststoffpipette ansaugen und in ein neues 50-Milliliter-Konusrohr legen.Waschen Sie die mononukleären Zellen zweimal mit 45 Milliliter PBS. Und zentrifugieren Sie sie bei 800 mal G für fünf Minuten. Um die natürlichen Killerzellen oder Engaven zu isolieren, zählen Sie die PVM-Meere und setzen Sie sie im NK-Trennpuffer um einmal 10 bis acht Zellen pro Milliliter aus.Dann 10 Milliliter der Zellsuspension in ein neues 50-Milliliter-Rohr geben. Fügen Sie 500 Mikroliter NK Zellisolation Antikörper-Mix. Und 10 Mikroliter Anti-CD drei positive IsolationS-Antikörper-Mix zu den PBMCs.Und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Vortex magnetische Perlen und fügen Sie einen Milliliter zu den PBMCs und Antikörpern. Dann die MIGS für 10 Minuten bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Rühren inkubieren.Fügen Sie 35 Milliliter NK Isolationspuffer hinzu und legen Sie das Rohr 15 Minuten lang auf den Magneten. Sammeln Sie den Überstand vorsichtig mit einer 50 Milliliter Kunststoffpipette, ohne die Seiten oder den Boden des Rohres zu berühren. Zählen Sie die Zellen und zentrifugieren Sie sie bei 800 mal G für fünf Minuten.Um die NK-Zellen mit löslichem Gang 15 zu stimulieren, setzen Sie 750 000 Zellen in 100 Mikroliter IMDM, die 10%HS enthalten, in einem Brunnen einer 96-Well-Platte wieder aus. Verdünnen Sie den menschlichen Gang 15 bis ein Mikrogramm pro Milliliter im IMDM und 10%HS. Und fügen Sie 100 Mikroliter des verdünnten menschlichen Gangs 15 in die Zellen.Reparieren Sie eine Kontrollprobe mit nicht stimulierten Zellen und legen Sie beide Proben bei 37 Grad Celsius in den Inkubator. Stimulieren Sie die Zellen für 48 Stunden und führen Sie dann den extrazellulären Flusstest durch. Schalten Sie den Analysator am Tag vor dem Experiment ein und lassen Sie ihn bis zu 37 Grad Celsius erwärmen.Öffnen Sie das Zensurpatronenpaket, und trennen Sie die Patrone von der Gebrauchsschild. Dann fügen Sie 200 Mikroliter der Kalibrant-Lösung zu jedem Brunnen der Nutzplatte hinzu. Und stellen Sie die Zentralpatrone wieder ein, um sicherzustellen, dass die Sensoren vollständig unterGetaucht sind.Für optimale Ergebnisse inkubieren Sie die Kartusche über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem kohlendioxidfreien Inkubator. Was richtig befeuchtet. Zur Herstellung einer klebstoffbeschichteten Klinge, Pipette 25 Mikroliter der Zellklebstofflösung für jeden Brunnen der Platte.Und bei Raumtemperatur für 20 Minuten inkubiert. Dann entfernen Sie die Lösung und waschen Sie die Platte zweimal mit 200 Mikroliter sterilem Wasser pro Brunnen. Halten Sie die Platte 15 Minuten lang in der Zellkulturhaube offen, damit die Brunnen trocknen können.Zentrifugieren Sie die zuvor isolierten NK-Zellen für fünf Minuten 200-mal G. Dann überstand und waschen Sie die Zellen in erwärmten mitochondrialen Stresstest Medium oder Glykolyse Stresstest Medium. Pellet die Zellen wieder und resuspendieren sie auf die bevorzugte Zellkonzentration im gleichen Medium.Legen Sie 180 Mikroliter Zellsuspension pro Brunnen in die Assayplatte. Verwenden Sie die Bohrungen A eins, A 12 H eins und H 12 als Steuerbrunnen für die Hintergrundkorrektur. Wenn Sie 180 Mikroliter des Assaymediums zu diesen Wells Inkubieren, brüten Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem kohlendioxidfreien Inkubator.Zentrifugieren Sie die Platte bei 200 mal G für fünf Minuten. Beobachten Sie dann die Zellen unter dem Mikroskop, um zu überprüfen, ob sie eine Manoschicht an der Unterseite des Brunnens bilden. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 25 Minuten.Warme Arbeitslösungen bis 37 Grad Celsius. Und stellen Sie ihren pH-Wert bei Bedarf auf 7,4 um. Laden Sie die zuvor vorbereiteten Verbindungen für einen mitochondrialen Stresstest oder für einen Glykolyse-Stresstest in die Boards A, B und C der hydratisierten Zensorpatrone Legen Sie die geladene Zensorpatrone während der Einrichtung des Programms wieder in den Inkubator.Um das extrazelluläre Fluss-Assay-Protokoll einzurichten, öffnen Sie die Software und verwenden Sie Gruppendefinitionen, um die Vorbehandlungsbedingungen zu definieren. Verwenden Sie die Registerkarte Platte Karte, um die Gruppen von Brunnen, die ähnliche Bedingungen haben auch die Hintergrundkorrektur und leere Brunnen anzuzeigen. Legen Sie dann das Programm auf der Registerkarte Protokolle fest.Starten Sie das Programm und legen Sie die Sensorpatrone und die Gebrauchsschildaufteilauf dem Fach auf. Ersetzen Sie nach dem Kalibrierungsschritt die Kalibrierplatte für die Assayplatte durch die angeschlossenen Zellen. Sobald die Ausführung abgeschlossen ist, rufen Sie die Daten ab, und analysieren Sie sie.Um die Reinheit und Lebensfähigkeit der NK-Zellen zu beurteilen. Kleine Alec Watt aus PVM-Meeren und die isolierte NK-Zellpopulation wurden durch Durchflusszytometrie befleckt und analysiert. Die Reinheit der NK-Zellpopulation wurde durch doppelten Verbleib gegen CD 3 und CD 56 oder NKP 46 festgestellt.Viele mitochondriale Sauerstoffverbrauchsraten für die menschlichen NK-Zellen werden hier gezeigt. Wie erwartet zeigten I-Zellennummern höhere OCR-Werte an. Zellzahlen korrelierten auch linear mit der Menge an DNA oder Protein im Brunnen.Auf der anderen Seite waren höhere Zellzahlen nicht optimal. Denn durch Zugabe von DNP war die Sauerstoffkonzentration im Brunnen in jedem Zyklus völlig erschöpft. Was die genaue Berechnung des OCR verhinderte.In menschlichen NK-Zellen, 100 Mikromolar DNP wurde festgestellt, dass die optimale Dosis. Hier wird ein typisches mitochondriales Stresstestexperiment mit 750.000 NK-Zellen pro Brunnen gezeigt. In diesem Test oligomycin führt zu einem dramatischen Rückgang des Sauerstoffverbrauchs.Und eine Zunahme von ECAR. Dies stellt einen Wechsel zur Glykolyse und eine Anstrengung zur Aufrechterhaltung der zellulären ATP-Spiegel dar. Die Aktivierung der NK-Zellen durch Gang 15 führte zu einem Anstieg sowohl des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs als auch der extrazellulären Versauerung.Basal Maximum und ATP verknüpfte Atmung erhöht, aber nicht Protonenleck oder nicht mitochondriale Atmung. Darüber hinaus verringerte sich die OCR/ECA-Rate, was auf eine Verschiebung zu einem glykolytischen Stoffwechsel nach DER IL 15-Stimulation hindeutet. Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es sehr wichtig, eine reine und gesunde Zellpopulation zu erhalten, um die optimale Zellzahl zu bestimmen und die Konzentration von Uncablers zu tittrieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video demonstriert die Methode zur Analyse des Energiestoffwechsels in aktivierten menschlichen NK-Zellen mit einem extrazellulären Flussanalysator. Verschiedene Inhibitoren der Elektronentransportkettenkomplexe beeinflussen die ATP-Synthese, die über die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) gemessen wird und Einblicke in den Zellstoffwechsel und die Bioenergetik gibt.

Echtzeit-Überwachung des Energiestoffwechsels in humanen NK-Zellen mit einem extrazellulären Flussanalysator

Dieses Video zeigt die lytische Aktivität natürlicher Killerzellen gegen fluoreszenzgefärbte Zielzellen. Die Methode ermöglicht die Messung der NK-Zell-induzierten Zytotoxizität durch Färbung toter Zellen und Verwendung eines Durchflusszytometers zur Quantifizierung lebender und toter Zielzellen.

Natürlicher Killerzell-vermittelter Zytotoxizitätsassay Probenvorbereitung für die durchflusszytometrische Analyse

Eine einfache und zuverlässige Methode wird hier beschrieben eine Reihe von NK-Zellfunktionen wie Degranulierung, Zytokin und Chemokin-Produktion in verschiedenen NK-Zelluntergruppen zu analysieren.

Durchflusszytometrie-basierte Assay zur Überwachung von NK-Zell-Funktionen

Diese Arbeit beschreibt einen fortgeschrittenen Arbeitsablauf zur genauen und schnellen Bestimmung der NK-Zellzahl (Natural Killer) und der Zytotoxizität von NK-Zellen in menschlichen Blutproben.

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

Eine Flow Cytometry basierende Methode quantitativ bestimmen die zytotoxische Aktivität des menschlichen natürliche Killerzellen wird hier angezeigt.

Ein Flow Cytometry-basierte Zytotoxizität Assay für die Beurteilung der menschlichen NK-Zell-Aktivität

Die Ausweichung von natürlichen Killer (NK) zellvermittelten Ausrottungen durch Krebszellen ist wichtig für die Krebsinitiierung und Progression. Hier stellen wir zwei nicht-radioaktivitätsbasierte Protokolle zur Bewertung der mit NK zellvermittelten Zytotoxizität gegenüber lebertumorzellen vor. Darüber hinaus wird ein drittes Protokoll zur Analyse der NK-Zellmigration vorgestellt.

Messung der natürlichen Killerzell-vermittelten Zytotoxizität und Migration im Kontext von leberassoziierten Tumorzellen

Ein Protokoll zur Untersuchung von FcγRIIIa-gesteuerten Ereignissen durch therapeutische Antikörper in menschlichen natürlichen Killerzellen wird hier beschrieben. Diese künstliche Stimulationsplattform ermöglicht die Abfrage nachgeschalteter Effektorfunktionen wie Degranulation, Chemokin/Zytokin-Produktion und Signalwege, die durch die FcγRIIIa- und Fc-Anteile von Antikörpern, die an der Bindung beteiligt sind, vermittelt werden.

Bewertung menschlicher natürlicher Killerzellereignisse, die durch fcγRIIIa Engagement in Gegenwart therapeutischer Antikörper angetrieben werden

Das vorliegende Protokoll zeigt, wie CD3−/CD45+CD56+-Zellen mit leichter Zytotoxizität von humanen Stammzellen mit expandiertem Potenzial (hEPSCs) sowohl unter 3D- als auch unter 2D-Kulturbedingungen unterschieden werden können. Dies ermöglicht eine routinemäßige phänotypische Validierung, ohne die komplexe Mikroumgebung zu zerstören.

Generierung natürlicher Killerzellen aus humanen Stammzellen mit erweitertem Potenzial

Dieses Protokoll beschreibt eine markierungsfreie Methode zur schnellen Einzelzellanalyse der Anzahl und Aktivität von natürlichen Killerzellen (NK) unter Verwendung der linsenfreien Schattenbildgebungstechnologie. Diese Methode quantifiziert morphologische Veränderungen in einzelnen NK-Zellen durch computergestützte Analyse ihrer Beugungsmuster.

Vor Ort einsetzbare, linsenfreie Bildgebungsplattform für die schnelle markierungsfreie Analyse der Aktivierung natürlicher Killerzellen

Dieses Protokoll bietet einen standardisierten in-vitro. Arbeitsablauf für die konsistente Messung der natürlichen, chimerischen Antigenrezeptor-vermittelten und antikörperabhängigen Zytotoxizität menschlicher natürlicher Killerzellen mittels lebender Zellbildgebung und Durchflusszytometrie.

Quantifizierung der NK-Zell-Zytotoxizität, verstärkt durch chimerische Antigenrezeptoren und therapeutische Antikörper mittels lebender Zellbildgebung und Durchflusszytometrie

Erfahren Sie, wie Sie Glykolyse und mitochondriale Atmung in primären menschlichen NK-Zellen mit einem extrazellulären Flux-Analysator messen. Diese hochdurchsatzfähige Methode erfordert geringe Zellmengen und ermöglicht klinische Anwendungen bei Stoffwechselerkrankungen.

Analyse des menschlichen natürlichen Killerzellstoffwechsels

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