Name: Einzelzellsammlung von Trophoblastenzellen im Peri-Implantationsstadium menschliche Embryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Erfahren Sie die Einzelzellsammlung von Trophoblastenzellen zur Untersuchung menschlicher Implantation und früher Plazentabildung. Diese Methode ermöglicht die Analyse epigenetischer und transkriptomischer Veränderungen während der Embryonalentwicklung.

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Wir möchten die vielen Patienten am Colorado Center for Reproductive Medicine (CCRM) würdigen, die ihre Embryonen gnädig für die Forschung gespendet haben. Wir danken auch Karen Maruniak und dem klinischen Labor am CCRM für ihre Hilfe bei der Verarbeitung von hCG-Proben sowie Sue McCormick und ihrem klinischen IVF-Embryologie-Team bei CCRM für ihre Hilfe bei der Sammlung, Lagerung, Verfolgung und Spende von Embryonen. Die Finanzierung erfolgte intern durch CCRM.

Alle menschlichen Embryonen wurden mit Zustimmung zur Verwendung in der Forschung gespendet. Protokolle für eine erweiterte menschliche Embryokultur wurden vom Western Institutional Review Board (Studie Nr. 1179872) genehmigt und folgen internationalen Richtlinien. Jede Verwendung menschlicher Embryonen muss von den zuständigen Ethik- und Leitungsgremien überprüft werden, die mit der Forschungseinrichtung unter Verwendung dieses Protokolls verbunden sind.
1. Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie Medien und Rückgewinnungsplatten einen Tag vor der Embryoerwärmung in einer sterilen laminaren Strömungshaube vor.<ol>
<li>Bereiten Sie 2 ml Blastozystenkulturmedien (BM) mit 10% v/v Serumproteinersatz (SPS) vor. HINWEIS: Blastozystenkulturmedien können zugesetztes Protein enthalten oder auch nicht. Hier haben wir ein Medium verwendet, das mit 10% des angegebenen Albuminproteins ergänzt werden muss. Überprüfen Sie die Herstelleranleitung für Variation in dieser Supplementierung. Alle Medien sollten vor dem Ausgleich mit einem sterilen 0,22-M-M-Filter gefiltert werden.</li>
		<li>Füllen Sie zwei Mittel-Well-Organkultur-Waschschüsseln mit 500 l BM mit 10% v/v SPS, die mit 500 l embryokultursgradem Öl abgedeckt sind.</li>
		<li>In einer 60 mm Gewebekulturschale Schicht 8 ml Embryokulturöl und dann 20 L Tropfen BM mit 10% v/v SPS an der Unterseite der Kulturplatte verankern. Machen Sie 1 Tropfen für jeden embryonal ente. HINWEIS: Mehr Medien, Tropfen und Waschgeschirr können nach Bedarf hergestellt werden. Tropfen können auch der Schale hinzugefügt werden, bevor das Öl geschichtet wird. Verankerung Stropfen unter dem Öl wird dazu beitragen, Verdunstung und alle nachfolgenden Veränderungen in der Osmolalität zu reduzieren.</li>
		<li>Equilibrate BM mit 10% v/v SPS Waschgeschirr und Rückgewinnungsplatte in einem Inkubator bei 37 °C, 6%CO2, 5% O2 für mindestens 4 h.</li>
		<li>Eine Durchstechflasche des ersten Schritts der erweiterten Kulturmedien (IVC1) in 4 °C oder auf der Bankplatte auftauen.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Waschschale von 500 l IVC1 ohne Ölüberlagerung vor. Aliquot ca. 4 ml IVC1 in ein 5 ml Fangkappenrohr.</li>
		<li>Equilibrate IVC1 Waschschale und kleine Schnappkappenröhre von IVC1 in 37 °C, 6%CO2 und atmosphärischemO2 für mindestens 4 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie erweiterte Kulturplatten einen Tag vor der Embryoerwärmung in einer sterilen laminaren Strömungshaube vor.<ol>
<li>Fibronectin aus humanem Serum in Phosphatgepufferter Saline (PBS) auf 30 g/ml verdünnen. Für die Beschichtung der Kammern werden 250 l von 30 g/ml Fibronectin pro Embryo benötigt.</li>
		<li>Öffnen Sie das 8 gut gekammerte Coverslip-Paket unter der Haube und achten Sie darauf, die Brunnen nicht zu berühren. Sanfte Pipette 250 l von 30 g/ml Fibronectin in jeden Brunnen.</li>
		<li>Den Deckel auf den kammerförmigen Deckelabrutsch eitern und 20-24 h in 4 °C platzieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie erweiterte Kulturplatte am Morgen der Embryoerwärmung.<ol>
<li>Holen Sie den kammerierten Deckelmitrutsch mit Fibronectin ab und legen Sie ihn in eine laminare Durchflusshaube. Die Fibronectin-Mischung mit einer 1 ml Pipette entfernen und in den Abfallbehälter entsorgen.</li>
		<li>Abrufen erwärmter, ausgeglichener IVC1-Medien aus einem kleinen 5-ml-Snap-Cap-Rohr.</li>
		<li>Pipette 300 l gleichgestelltes IVC1 in jeden Brunnen. Achten Sie darauf, dass keine Flüssigkeit den Deckel berührt, da dies das Risiko einer Kontamination erhöht.</li>
		<li>Geben Sie den kammerierten Deckelmitrutsch mit IVC1 in 37 °C, 6% CO2 und atmosphärischemO2 zurück, bis die Zona pellucida in Schritt 4 entfernt wird.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Erwärmung verglaster D5 menschlicher Embryonen
HINWEIS: Andere Hersteller können je nach ihrer eigenen Verglasungstechnologie leicht unterschiedliche Protokolle haben. Siehe ggf. Gebrauchsanweisung des Herstellers.
<ol><li>3,0 ml Auftaulösung (TS) in 35 mm Schale auf 37 °C erwärmen. Bringen Sie 300 l Verdünnungslösung (DS) und zwei Bohrungen mit 300 l Waschlösung (WS) in einer 6-Well-Platte auf Raumtemperatur.</li>
	<li>Entfernen Sie mit Zangen vorsichtig die Hülse des Kryogeräts, während Sie sicherstellen, dass der verglaste Embryo immer unter flüssigem Stickstoff verbleibt.</li>
	<li>Bewegen Sie das Kryogerät schnell aus flüssigem Stickstoff und tauchen Sie die Spitze des Kryogeräts in TS bei 37 °C ein. Stellen Sie einen Timer für 1 min ein und halten Sie das Kryogerät unter Wasser, bis sich der Embryo in das TS löst. ANMERKUNG: Warme Embryonen nacheinander, um die Embryoidentitäten nachzuverfolgen, da sie sich auf demografische Informationen der Patienten in der nachgelagerten Analyse beziehen können.</li>
	<li>Entfernen Sie während der 1 min Inkubation in TS vorsichtig das Kryogerät und nehmen Sie den Embryo vorsichtig auf und bewegen Sie sich auf die gegenüberliegende Seite der TS-Schale. HINWEIS: Wenn Sie mehrere Embryonen kultivieren, sollten Sie sorgfältig darauf achten, Embryonen getrennt zu halten, um sicherzustellen, dass die richtige Identität erhalten bleibt.</li>
	<li>Nach 1 min, nehmen Sie den Embryo vorsichtig mit einer kleinen Menge tS, ca. 2 l. Bewegen Sie den Embryo auf den Boden des 300-L-DS-Brunnens, während Sie den Embryo in einer dünnen TS-Schicht aus der Pipette abdecken. Stellen Sie einen Timer für 3 min ein und legen Sie die 6-Well-Platte bei Raumtemperatur auf die Tischplatte.</li>
	<li>Nach 3 min nehmen Sie den Embryo mit einer kleinen Menge dS, ca. 2 l, auf und bewegen Sie den Embryo auf den Boden des nächsten Brunnens, der 300 l WS enthält. Erneut eine kleine Menge DS aus der Pipette vorsichtig über den Embryo schichten. Stellen Sie einen Timer für 5 min und kehren Sie zur Bankspitze zurück.</li>
	<li>Nach 5 min, nehmen Sie den Embryo mit minimalem Volumen von WS und bewegen Sie sich an die Spitze der letzten Bohrung von 300 L WS. Der Embryo fällt langsam und wäscht sich durch das WS nach unten. Vertreiben Sie alle zurückgehaltenen WS aus der Pipette in einen leeren Brunnen.</li>
	<li>Nehmen Sie den Embryo mit minimalem Volumen auf und kehren Sie an die Spitze des gleichen 300-L-Brunnens von WS zurück. Der Embryo fällt wieder auf den Boden des Brunnens. Stellen Sie einen Timer für 1 min und geben Sie die 6-Well-Platte an die Bankspitze zurück.</li>
</ol>3. Wiederherstellung von erwärmten Embryonen
<ol><li>Nacheinander wärmte Embryonen in eine zentrisch-gut organische Gewebeschale, die 500 l äquilibriertes BM mit 10% v/v SPS unter 500 l gleichgewichtiver embryokulturelles Öl enthält.</li>
	<li>Waschen Sie Embryonen, indem Sie jeden Embryo aufnehmen und in mehrere Bereiche der Schale bewegen, während sie zwischen den Bewegungen alte Medien ausblasen. Nehmen Sie den Embryo auf und bewegen Sie ihn zu einem individuellen 20-L-Kulturtropfen gleichgefälliger BM mit 10% v/v SPS unter Öl.</li>
	<li>Lassen Sie die erwärmten Embryonen für 2 h in einem Inkubator bei 37 °C, 6%CO2, 5%O2 erholen.
</li>
</ol>4. Zona Entfernung
<ol><li>Bewerten Sie nach einer 2 h-Erholung Embryonen zur Erneutexpansion und fotografieren Sie jeden Embryo.</li>
	<li>Bewegen Sie Embryonen einzeln in 500 l einer 3-(N-Morpholino)-Propanesulfonsäure (MOPS)-gepufferten Handhabungsmedium mit 5% (v/v) fetalem Kalbsserum (FCS) vor der Behandlung mit saurer Tyrodes Lösung.</li>
	<li>Bewegen Sie einen Embryo schnell durch 300 l der erwärmten sauren Tyrodes Lösung, während Sie aktiv durch das Mikroskop beobachten. Die Zona pellucida beginnt sich optisch aufzulösen. Dies dauert ca. 5 s.</li>
	<li>Den Embryo sofort mit lösender Zona in 300 L gewärmtes MOPS-gepuffertes Medium bewegen, um die Lösung der Säure Tyrodes zu löschen.</li>
	<li>Bewegen Sie den Embryo mit minimalem Volumen von MOPS gepuffertem Medium in eine zentr-well Organgewebeschale, die 500 l äquilibierteBM mit 10% v/v SPS unter 500 l gleichgewichtiver embryokultursgrades Öl zum Waschen enthält.</li>
	<li>Bringen Sie den Embryo ab Schritt 3.2 auf den 20-L-Rückgewinnungsabfall zurück. HINWEIS: Bei einer visuellen Untersuchung nach der Zonaentfernung können Embryonen mit zurückgehaltenem Zona pellucidae gegebenenfalls mit der sauren Tyrodeslösung weiter behandelt werden, indem die Schritte 4.2-4.6 wiederholt werden. Die Minimierung der Exposition gegenüber der Tyrode-Lösung ist erwünscht.</li>
</ol>5. Blastozysten erweiterte Kultur
<ol><li>Bewegen Sie die Embryonen einzeln in die Waschschale mit ausgeglichenen IVC1-Medien ab Schritt 1.1.6. Bewegen Sie vorsichtig einen Embryo auf einen Brunnen des kammerierten Deckelslips mit ausgeglichenem IVC1 und halten Sie die Embryo-Identifikation aufrecht. HINWEIS: Dieser Schritt muss so schnell wie möglich abgeschlossen werden, um die mittlere Verdunstung zu minimieren.</li>
	<li>Zurückkammer-Coverslip zu einem Inkubator auf 37 °C, 6%CO2, atmosphärischO2 für 2 Tage. HINWEIS: Achten Sie darauf, Medien in 37 °C, 6%CO2, atmosphärischo2 für den Medienaustausch 4 h im Voraus aufzutauen und auszubessern.</li>
	<li>Bei Auswachsen D2 (D7 nach der Befruchtung), sorgfältig untersuchen, die Befestigung von Embryonen unter dem Mikroskop und führen Medienaustausch.<ol>
<li>Beachten Sie, welcher Embryo vor dem Medienaustausch an der Schale befestigt ist. Tippen Sie vorsichtig auf die Platte und untersuchen Sie, ob ein Embryo sicher an der Platte unter dem Mikroskop befestigt ist.</li>
		<li>Entfernen Sie den Deckel und entfernen Sie vorsichtig 150 l IVC1 und entsorgen Sie, ohne den angeschlossenen Embryo zu stören. Wenn ein Embryo noch nicht an der Platte befestigt ist, tauschen Sie die Medien nicht aus, da das Serum in IVC1 bei der Anhaftung des Embryos hilft.</li>
		<li>Pipette 150 L ausgeglichene erweiterte Kulturmedien, IVC2, langsam in jeden Brunnen und geben Sie den Deckel an den kammerierten Deckelabschlag zurück. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Entfernen des Deckels aus dem kammerförmigen Deckelschlupf minimiert wird, um eine mittlere Verdunstung zu vermeiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Geben Sie den kammerkammerierten Coverslip vorsichtig an den Inkubator zurück, ohne Medien auf den Deckel zu spritzen. Wiederholen Sie den Medienaustausch und die Anhaftungsprüfung jeden Tag der erweiterten Kultur, bis die Embryonen zur Fixierung oder Einzelzellverdauung bereit sind.</li>
</ol>6. Optionale Sammlung von verbrauchten Medien
<ol><li>Optional können Sie verbrauchte Medien während des Austauschs von Kulturmedien nach D7 oder einen Tag danach sammeln. In Schritt 5.3.2 werden die 150 L entfernten IVC1 für zukünftige Analysen in ein steriles, niedrig bindendes 0,5 ml-Rohr eingeschläfert, anstatt das Medium Snap-Freeze zu entsorgen.</li>
</ol>7. Optionale Fixierung auf Immunfluoreszenz
<ol><li>Verwenden Sie eine 200-L-Pipette, um Embryonen mit einem 1/2-Medienaustausch von PBS für 3x vor der Fixierung zu waschen, um außerzelluläre Ablagerungen zu entfernen. Das Wegwaschen überschüssiger Trümmer und Proteine trägt dazu bei, die Klarheit zu optimieren und den Hintergrund von Bildern zu reduzieren, die mit Immunfluoreszenz gewonnen wurden.</li>
	<li>Entfernen Sie alle Medien und fügen Sie langsam 200 l 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS in den Brunnen. Der Embryo wird an der Oberfläche der Flüssigkeit kleben wollen. Mehrere 150-L-Wässungen mit 4% PFA vor dem Entfernen aller Flüssigkeit enden dazu, Schäden am Embryo zu minimieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Embryonen in 4% PFA für 20 min zur Fixierung.</li>
	<li>Waschen Sie Embryonen 3x für 10 min pro Wäsche mit 200 l 0,1% v/v Polysorbat 20 in frischem PBS.</li>
	<li>Feste Embryonen in 0,1% v/v Polysorbat 20 in PBS bei 4 °C lagern, bevor Sie mit dem Immunfluoreszenzprotokoll fortfahren.</li>
</ol>8. Einzelzellverdauung mit Trypsin
HINWEIS: Frische (nicht fixierte) Embryonen werden für die Einzelzellverdauung verwendet.
<ol><li>Waschen Sie den Embryo einmal mit 200 l PBS und fügen Sie jedem Brunnen 200 L Trypsinlösung hinzu. Geben Sie den kammerierten Deckelrutsch für 5 min an den Inkubator zurück.</li>
	<li>Entfernen Sie den kammerierten Deckelausstrich aus dem Inkubator und untersuchen Sie die Embryonen unter einem Stereoskop. Die Zellen an der Peripherie des Embryos beginnen sich zurückzuziehen, und MTB sollte weiterhin an der Platte befestigt werden, wo sie sich entfernt vom Embryo befinden.</li>
	<li>Verwenden Sie eine kleine Pipette oder eine fein gezogene Mundpipette, um einzelne MTB aufzunehmen, bevor Sie den gesamten Embryo auseinanderbrechen. Fahren Sie mit Schritt 9.1 fort, um MTB zu speichern, und kehren Sie nach Schritt 9.3 zu Schritt 8.4 zurück.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Hand-Mikromanipulationspipette oder Mundpipette, um den Embryo sanft zu dissoziieren, indem Sie nach oben und unten ansortisieren.</li>
	<li>Die Zellen beginnen, sich vom gesamten Embryo zu lösen. Den Embryo vorsichtig und wiederholt mit einer Pipettenspitze oder Mundpipette mit kleinerem Durchmesser weiter ansaugen, bis der Embryo insgesamt 10 min in Trypsin inkubiert wurde.</li>
</ol>9. Einzelzellenauswahl und Probenentnahme
<ol><li>Mit minimalem Trypsin bewegen Sie die dissoziierten Zellen durch drei Waschtropfen von 20 L PBS + 0,1% Polyvinylpyrrolidon (PVP) unter Embryokulturöl mit Sorgfalt, um keine Zellen zu verlieren.</li>
	<li>Nachdem Sie die Zellen gewaschen haben, verwenden Sie eine fein gezogene Glaspipette, um eine Zelle auszuwählen. Pipetten Sie die Einzelzelle vorsichtig in ein steriles 0,2 ml Niedrigbindungsrohr mit minimalem PBS+0,1% PVP.</li>
	<li>Fangen Sie einzelne Zellen in flüssigem Stickstoff (LN2) einundgefrieren und lagern Sie sie in -80 °C für die zukünftige Verwendung.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Entwicklung des Protokolls zur Kultur menschlicher Embryonen durch Implantation hat es Wissenschaftlern ermöglicht, eine bisher unbekannte Entwicklungszeit zu erforschen8,9. Hier verwenden wir ein erweitertes Kultursystem, um menschliche Embryonen zu kultivieren und die frühe Trophoblastendifferenzierung vor der Bildung einer villous Plazenta zu untersuchen. Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen es uns, verschiedene TB-Unterlinien für die Nachfluss-Einz...

Die menschliche Implantation und die Entstehung der frühen Plazenta sind historisch schwer zu untersuchen und bleiben weitgehend unbekannt, da menschliche Gewebe in diesem Stadium, in dem eine Schwangerschaft klinisch nicht nachweisbar ist, unzugänglich sind. Tiermodelle sind unzureichend, da die menschliche Platierweise ihre eigenen Einzigartigen im Vergleich zu anderen eutherischen Säugetieren hat. Zum Beispiel dringt die menschliche Plazenta tief in die Dezidua ein, wobei einige Trophoblastenzellen mindestens das innere Drittel des Uterusmyometriums erreichen, während andere Zellen die Gebärmutterspiralarterien umgestalten. Selbst unsere nächsten evolutionären Vorfahren, die nichtmenschlichen Primaten, zeigen Unterschiede in der plazentatren Morphologie und trophoblastischen Wechselwirkungen mit den mütterlichen deziduellen Geweben1,2,3. Die Beschaffung von vorderimplantationen menschlichen Embryonen in vitro war erst in den 1980er Jahren möglich, als die klinische menschliche In-vitro-Fertilisation (IVF) als Routinepraxis zur Behandlung von Unfruchtbarkeit begann4. Jetzt können menschliche Blastozysten in vitro angebaut werden, um die Auswahl lebensfähigerer Embryonen für den Transfer zu ermöglichen und sichere genetische Tests zu ermöglichen. Die Verbesserung der Embryokulturtechniken sowie der zunehmende Einsatz von IVF haben zu vielen überschüssigen Blastozysten geführt, die nach Abschluss der Behandlungszyklen des Patienten erhalten geblieben sind. Mit Zustimmung des Patienten, IRB-Zulassung, und mit bestimmten Einschränkungen, Diese Blastozysten können für Forschungsstudien verwendet werden. Sie sind zu einer unschätzbaren Ressource geworden, die für die Ableitung menschlicher embryonaler Stammzellen verwendet wurde5, das Verständnis des Übergangs der inneren Zellmasse zu embryonalen Stammzellen6,7, und in jüngerer Zeit, wurden erfolgreich bis zum Tag (D) 13 kultiviert, um die menschliche Implantationumzugestalten 8,9. Durch die Verwendung von kürzlich entwickelten einzelzelligen Omics-Ansätzen bietet der Zugang zu diesen implantationsphase menschlichen Embryogeweben einzigartige Möglichkeiten, die molekularen Mechanismen zu beschreiben, die diesen hochdynamischen Zelldifferenzierungsprozess regulieren, die bisher unmöglich zu erforschen waren10,11,12,13.
Hier beschreiben wir die Methoden, die in unserer jüngsten Publikation verwendet werden, die die Dynamik der Trophoblastendifferenzierung während der menschlichen Implantation12charakterisiert. Dieses Protokoll umfasst die Erwärmung verglaster Blastozysten, die erweiterte Embryokultur bis D12 nach DerIVF, die enzymatische Verdauung des Embryos in einzelne Zellen und die Zellentnahme für nachgeschaltete Assays (Abbildung 1). Dieses erweiterte Kultursystem unterstützt die Entwicklung des peri-implantationsstadiums menschlicher Embryonen ohne mütterlichen Input und rekapituliert die Trophoblastendifferenzierung, die mit den Beobachtungen aus histologischen Proben vor vielen Jahrenübereinstimmt 14,15,16,17. Während der Implantation besteht die Trophoblastenpopulation aus mindestens zwei Zelltypen: dem mononukleierten Vorläufer-ähnlichen Zytotrophoblasten (CTB) und dem endlos differenzierten, multinukleierten Synzytiotrophoblast (STB). Bei der Trypsinverdauung sind die CTB kleine, runde Zellen, die morphologisch nicht von anderen Zelllinien zu unterscheiden sind(Abbildung 2A, linkes Panel). Die Trennung von CTB von anderen Zelllinien, wie Epiblast und primitivem Endoderm, kann durch ihre unterschiedlichen transkriptomischen Profile erreicht werden, die durch einzellige RNA-Sequenzierung aufgedeckt werden. Syncytiotrophoblast-Zellen können leicht als unregelmäßig geformte Strukturen identifiziert werden, die deutlich größer als die anderen Zelltypen sind und sich hauptsächlich an der Peripherie des Embryos befinden(Abbildung 2A, mittleres Panel; Abbildung 2B, linkes Bedienfeld). Migratory trophoblast cells (MTB) are another trophoblast sublineage found during embryo extended culture and can be recognized as apparently moving away from the main body of the embryo (Abbildung 2A, rechtes Panel, Abbildung 2B, rechtes Panel). Migrierender Trophoblast, obwohl er viele der gleichen Marker wie extra villous trophoblast (EVT) ausdrückt, sollte nicht als EVT bezeichnet werden, da die villous Strukturen in der Plazenta in diesem sehr frühen Entwicklungsstadium nicht entstanden sind.
Experimentell konnten wir kleine CTB und große STB sammeln, die leicht zu unterscheiden sind, nachdem Embryonen in einzelnen Zellen bei D8, D10 und D12 verdaut wurden (Abbildung 2A,B). Wandernde Trophoblasten entstehen in den späteren Stadien der erweiterten Embryokultur und können bei D12 vor der enzymatischen Verdauung des gesamten Embryos gesammelt werden (Abbildung 2A,B). Durch phäotypische Trennung dieser drei Trophoblasten-Unterlinien vor der Einzelzellanalyse können wir spezifische transkriptomische Marker identifizieren und die biologische Rolle jedes Zelltyps definieren. Cytotrophoblast sind hoch proliferativ und fungieren als Vorläuferzellen bei der Versorgung der STB und MTB differenzierten Linien10,11,12,13. Syncytiotrophoblast sind an der Herstellung von Plazentahormonen zur Aufrechterhaltung der Schwangerschaft beteiligt und können auch für die Embryonen verantwortlich sein, die sich in das Endometrium10,,11,12,13graben. Wandernder Trophoblast hat noch stärkere Merkmale eines invasiven, wandernden Phänotyps und ist wahrscheinlich für eine tiefere und umfassendere Besiedlung des Uterusendometriums10,11,12,13verantwortlich. Nach der Definition der transkriptomischen Signatur jedes Zelltyps haben Clustering-Analysen auch zwei zusätzliche Teilmengen von Zellen aufgedeckt, die morphologisch nicht von CTB zu unterscheiden waren und Transkriptome mit Merkmalen von STB und MTB bzw.12hatten. Diese Zwischenstadiumzellen sind wahrscheinlich dabei, sich von CTB auf die MTB- oder STB-Unterlinien zu differenzieren und wären übersehen worden, wenn Embryonen blind verdaut und Zellen allein durch Transkriptom getrennt worden wären.
Das hier beschriebene Protokoll verwendet ein zweidimensionales (2D) Kultursystem und ist möglicherweise nicht optimal für die Unterstützung der dreidimensionalen (3D) strukturellen Entwicklung, wie eine kürzlich erschienene Veröffentlichung zur Beschreibung eines neu entwickelten 3D-Kultursystems13. Dennoch scheint in diesem 2D-System die Differenzierung des frühen Trophoblasten mit Beobachtungen aus in vivo Proben14,15,16,17vereinbar zu sein. Dieses Protokoll kann auch leicht für den Einsatz im kürzlich beschriebenen 3D-Kultursystem13 mit minimalen Änderungen angepasst werden. Alle Schritte werden mit einer handgeführten Mikromanipulationspipette mit handelsüblichen Einwegspitzen oder einer Mundpipette aus einer fein gezogenen Glaspipette durchgeführt, die an Gummischläuchen, einem Filter und einem Mundstück befestigt ist.

<table><tbody><tr><td>NORM JECT Luer-Lock-Sterilspritze</td><td>VWR</td><td>53548-019</td><td>Packung mit 100</td></tr>, <tr><td>3130 oder 3110 Forma Serie II wasserummantelter CO2-Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-998-078</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Corning Primaria Gewebekulturschale</td><td>VWR</td><td>62406-038</td><td>Karton mit 500</td></tr> 5 <tr><td>ml Schnappverschlussröhrchen</td><td>VWR</td><td>60819-295</td><td>Packung mit 25</td></tr><tr><td>Stück 60 mm Corning Primaria Gewebe Kulturschale</td><td>VWR</td><td>25382-687</td><td>Karton mit 200</td></tr><tr><td>6-Well-Schüsseln</td><td>Agtech Inc.</td><td>D18</td><td>Packung mit 1, 10 oder 50</td></tr><tr><td>sauren Tyrodenlösung</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1788</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Biotix 1250 & micro; L Pipettenspitzen</td><td>VWR</td><td>76322-156</td><td>Packung mit 960</td></tr><tr><td>Blast, Blastozysten-Nährmedien</td><td>Origio</td><td>83060010</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Verdünnungslösung</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>1 x 4 mL</td></tr><tr><td>Einweg-Borosilikatglas Pasteur Pipets</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367820D</td><td>5,75 Zoll (146 mm); 720/Cs</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Millipore Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Paraffinöl in Embryokultur OvOil</td><td>Vitrolife</td><td>10029</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Eppendorf PCR-Röhrchen 0,2 mL</td><td>VWR</td><td>47730-598</td><td>Packung mit 1.000</td></tr><tr><td>Eppendorf PCR-Röhrchen 0,5 mL</td><td>VWR</td><td>89130-980</td><td>Karton mit 500</td></tr><tr><td>Fibronektin aus menschlichem Plasma. Flüssige .1% ige Lösung</td><td>Millipore Sigma</td><td>F0895</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>Gilson 1 mL Pipetteman</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 Pipetteman 200-1000 & Mikro; L</td></tr><tr><td>Gilson 20 & Mikro; L Pipetteman</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 Pipetteman 2-20 & micro; L</td></tr><tr><td>Gilson 200 & Mikro; L Pipetteman</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 Pipetteman 50-200 & micro; L</td></tr><tr><td>G-MOPS Handhabungsmedien</td><td>Vitrolife</td><td>10129</td><td>125 mL</td></tr><tr><td>Handhabungsmedien</td><td>Origio</td><td>83100060</td><td>60 mL</td></tr><tr><td>Ibidi 8 gut gekammerte Deckgläser</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>15 Objektträger pro Schachtel</td></tr><tr><td>IVC1/IVC2</td><td>Zellführungssysteme</td><td>M11-25/ M12-25</td><td>5-5 ml Aliquote</td></tr><tr><td>K System T47 Warmhalteplatte</td><td>Cooper Surgical</td><td>23054</td><td></td></tr><tr><td>MilliporeSigma Millex Sterile Spritzenvorsatzfilter mit Durapore PVFD-Membran</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGVR33RS</td><td>Packung mit 50</td></tr><tr><td>Mundstücken</td><td>IVF Store</td><td>MP-001-Y</td><td>100 Stück</td></tr><tr><td>Oosafe Center Well Schale</td><td>Oosafe</td><td>OOPW-CW05-1</td><td>Etui mit 500</td></tr><tr><td>Quinn's Advantage SPS</td><td>Origio</td><td>ART-3010</td><td>12x 12 mL</td></tr><tr><td>Gummilatexschlauch für Mundstücke</td><td>IVF-Geschäft</td><td>IVFS-NRL-B-5</td><td>5 ft.</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ1270</td><td></td></tr><tr><td>Stripperspitzen</td><td>Cooper Surgical</td><td>MXL3-275</td><td>20/pk 275 &micro; m</td></tr><tr><td>Auftaulösung</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>2 x 4 mL</td></tr><tr><td>The Mikropipette</td><td>Cooper Surgical</td><td>MXL3-STR</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzym (1X), kein Phenolrot</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604013</td><td>1 x 100 mL</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1379-25ML</td><td>25 mL Flasche</td></tr><tr><td>VWR 1-20 &micro; L Pipettenspitzen</td><td>VWR</td><td>76322-134</td><td>Packung à 960</td></tr><tr><td>VWR 1-200 & micro; L Pipettenspitzen</td><td>VWR</td><td>89174-526</td><td>Packung à 960</td></tr><tr><td>Waschlösung</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>1 x 4 mL</td></tr></tbody></table>

einzelzellsammlung von trophoblastenzellen im peri-implantationsstadium menschliche embryonen

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Die menschliche Implantation, die Apposition und Haftung an der Gebärmutteroberflächenepithelie und die anschließende Invasion der Blastozyste in die mütterliche Dekliste, ist ein kritisches, aber rätselhaftes biologisches Ereignis, das aufgrund technischer und ethischer Einschränkungen historisch schwierig zu untersuchen war. Die Implantation wird durch die Entwicklung des Trophektoderms zu frühen Trophoblasten und die anschließende Differenzierung in unterschiedliche Trophoblasten-Unterlinien eingeleitet. Aberrante frühe Trophoblastendifferenzierung kann zu Implantationsversagen, Plazentapathologien, fetalen Anomalien und Fehlgeburten führen. Kürzlich wurden Methoden entwickelt, die es menschlichen Embryonen ermöglichen, bis zum Tag 13 nach der Befruchtung in vitro in Abwesenheit von mütterlichem Gewebe zu wachsen, eine Zeit, die die Implantationszeit beim Menschen umfasst. Dies hat den Forschern die Möglichkeit gegeben, die menschliche Implantation zu untersuchen und die Dynamik der Trophoblastendifferenzierung während dieser kritischen Periode zu rekapitulieren, ohne mütterliche Einflüsse zu verwirren und inhärente Hindernisse zu vermeiden, um frühe Embryodifferenzierungsereignisse in vivo zu untersuchen. Um verschiedene Trophoblast-Unterlinien während der Implantation zu charakterisieren, haben wir bestehende zweidimensionale (2D) erweiterte Kulturmethoden übernommen und ein Verfahren entwickelt, um verschiedene Arten von Trophoblastenzellen für nachgeschaltete Assays enzymatisch zu verdauen und zu isolieren. Embryonen, die in 2D-Bedingungen kultiviert werden, haben eine relativ abgeflachte Morphologie und können suboptimal bei der Modellierung dreidimensionaler (3D) embryonaler Architekturen in vivo sein. Die Trophoblastendifferenzierung scheint jedoch weniger betroffen zu sein, wie die erwarteten Veränderungen der Morphologie und der Genexpression im Laufe der erweiterten Kultur zeigen. Verschiedene Trophoblast-Unterlinien, einschließlich Cytotrophoblast, Synzytiotrophoblast und migratorischer Trophoblasten, können durch Größe, Position und zeitliche Entstehung getrennt und für weitere Charakterisierungen oder Experimente verwendet werden. Die Untersuchung dieser frühen Trophoblastenzellen kann entscheidend zum Verständnis der menschlichen Implantation, zur Behandlung von häufigen Plazentapathologien und zur Milderung der Inzidenz von Schwangerschaftsverlusten beitragen.

Gesunde Embryonen zeigten im Laufe der erweiterten Kultur eine anhaltende Proliferation (Abbildung 2B). Abnorme Embryonen begannen, sich von ihren äußeren Rändern zurückzuziehen und zerfallen (Abbildung 2C). Aus unserer Erfahrung wurden ca. 75% der Embryonen bei 48 h am Boden der fibronectinbeschichteten Schale befestigt und die Anhaftung stieg in der Kultur um ca. 90% um 72 h an. Der Erfolg der Embryo-Anhaftung kann weitgehend durch die anfängliche Qualität der...

Hier beschreiben wir eine Methode zur Erwärmung verglaster menschlicher Blastozysten, die sie durch die Implantationsphase in vitro kultivieren, sie in einzelne Zellen verdauen und frühe Trophoblastenzellen für weitere Untersuchungen sammeln.

Einzelzellsammlung von Trophoblastenzellen im Peri-Implantationsstadium menschliche Embryonen

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Viele Schwangerschaften scheitern früh in der entwicklung menschlicher Embryonen um die sieben oder acht Nachbefruchtung. Dieses Protokoll bietet den Forschern die Möglichkeit, während dieses mysteriösen Implantationsfensters menschliche Konzeptoren in vitro zu entwickeln. Dies ermöglicht es uns, die Mechanismen zu verstehen, die den Erfolg der menschlichen Implantation und frühen Plazentabildung untermauern.Die Verwendung eines erweiterten Kultursystems zum Anbau von peri-implantationsweichen menschlichen Embryonen in vitro ist wahrscheinlich die einzige Möglichkeit, authentische Materialien zu erhalten, um Implantation und frühe Tropoblastdifferenzierung zu untersuchen. Diese einfache Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das es uns ermöglicht, viele grundlegende Fragen über die frühe Entwicklung des Menschen zu beantworten. Forschung mit der Verwendung dieses Protokolls durchgeführt wird weitgehend zum Verständnis des frühen Schwangerschaftsverlusts, wiederkehrendeim implantationsversagen und der Plazentapathologien beitragen.Demonstriert wird das Verfahren von Deirdre Logsdon, dem Doktoranden eines Labors. Einen Tag vor der Erwärmung des Embryos bereiten Sie Medien und Rückgewinnungsplatten in einer sterilen laminaren Strömungshaube vor. Füllen Sie zwei Zentrum gut OrganKultur Waschgerichte mit 500 Mikroliter BM mit 10%SPS, dann decken Sie die BM mit 500 Mikroliter embryo Kultur Grade Öl.In einer 16-Millimeter-Gewebekulturschale acht Milliliter Embryokulturöl schichten und 20 Mikroliter-Tropfen BM mit 10% SPS nach unten verankern. Gleichgewichten Sie die Waschschüsseln und die Rückgewinnungsplatte in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius, 6% Kohlendioxid und 5% Sauerstoff für mindestens vier Stunden. Aliquot etwa vier Milliliter IVC 1 in einem Fünf-Milliliter-Snap-Cap-Rohr und bereiten Sie eine Waschschale mit 500 Mikroliter IVC 1 ohne Öl-Overlay zu.Die Schale und die Tube im Inkubator mindestens vier Stunden ausdemaieren. Fibronectin aus menschlichem Serum in PBS auf 30 Mikrogramm pro Milliliter verdünnen. Öffnen Sie die acht gut gekammerten Coverslip-Paket mit Pflege nicht die Brunnen berühren, dann sanft Pipette 250 Mikroliter des Fibronectin in jedem Brunnen.Ersetzen Sie den Deckel auf dem Deckel und inkubieren Sie ihn bei vier Grad Celsius für 20 bis 24 Stunden. Bereiten Sie die erweiterte Kulturplatte am Morgen der Embryoerwärmung vor. Holen Sie den kammerierten Deckelschlupf mit Fibronectin und legen Sie ihn in die laminare Strömungshaube.Dann entfernen Sie die Fibronectin-Mischung mit einer Ein-Milliliter-Pipette und entsorgen Sie sie. 300 Mikroliter des ausgeglichenen IVC 1 in jeden Brunnen geben und den Deckelinin in den Inkubator bis zur Entfernung der Zona pellucida legen. Nach der Erwärmung und Erholung der D5 menschlichen Embryonen, bewerten Sie sie für die Re-Expansion und fotografieren Sie jeden Embryo.Bewegen Sie jeden Embryo auf 500 Mikroliter eines MOPS gepufferten Handhabungsmediums mit 5%FCS. Behandeln Sie sie dann mit der sauren Tyrodes Lösung, wie sie im Textmanuskript beschrieben ist. Den Embryo mit der sich auflösenden Zona sofort in 300 Mikroliter erwärmtes MOPS-gepuffertes Medium bewegen, um die Tyrodeslösung zu löschen.Dann bewegen Sie den Embryo in eine zentrale Brunnenorgangewebeschale, die das gleichgestellte BM mit 10% SPS unter dem embryokultursen Öl enthält. Dann kehren Sie den Embryo zum 20-Mikroliter-Regenerationstropfen zurück. Bewegen Sie die Embryonen einzeln mit den gleichgezurrten IVC 1-Medien in die Waschschale, und bewegen Sie dann sorgfältig jeden Embryo in einen Brunnen des kammerkammerierten Deckellips, um den Überblick über die Embryo-Identifikation zu behalten.Geben Sie den kammerierten Deckelrutsch für zwei Tage an einen Inkubator zurück, der auf 37 Grad Celsius, 6% Kohlendioxid und Luftsauerstoff eingestellt ist. Am zweiten Tag des Wachstums, untersuchen Sie sorgfältig die Anhaftung der Embryonen unter dem Mikroskop und tauschen Die Medien aus. Wissen Sie, welcher Embryo an der Schale befestigt ist, indem Sie sanft auf die Platte tippen.Um die Medien zu wechseln, entfernen Sie den Deckel und saugen Sie sorgfältig 150 Mikroliter IVC 1 an, wobei Darauf zu achten ist, dass der angeschlossene Embryo nicht gestört wird. Wenn ein Embryo noch nicht an der Platte befestigt ist, tauschen Sie die Medien nicht aus, da das Serum in IVC 1 bei der Befestigung hilft. Langsam Pipette 150 Mikroliter ausgleich verlängerte Kulturmedien, IVC 2 in jeden Brunnen und Ersetzen Sie den Deckel auf dem Deckel.Sorgfältig den kammerierten Deckelschlupf an den Inkubator zurück. Wiederholen Sie den Medienaustausch und die Anhaftungsprüfung jeden Tag, bis die Embryonen zur Fixierung oder zur einzelzelligen Verdauung bereit sind. Wenn die Sammlung der verbrauchten Medien für die weitere Analyse erforderlich ist, fangen Sie die 150 Mikroliter entfernten IVC 1 in ein steriles 0,5 Milliliter-Rohr ein.Waschen Sie jeden Embryo einmal mit 200 Mikroliter PBS, dann fügen Sie 200 Mikroliter Trypsin-Lösung zu jedem Brunnen. Geben Sie den kammerierten Deckelrutsch für fünf Minuten an den Inkubator zurück. Verwenden Sie eine kleine Pipette oder eine fein gezogene Mundpipette, um ein einzelnes MTB aufzunehmen und dann eine größere Pipette zu verwenden, um den Embryo sanft zu dissoziieren, indem Sie nach oben und unten suchen.Den Embryo vorsichtig und wiederholt mit einer Pipettenspitze mit kleinerem Durchmesser weiter anheben, bis der Embryo insgesamt 10 Minuten lang in Trypsin inkubiert wurde. Um eine Einzelzellauswahl durchzuführen, bewegen Sie die dissoziierten Zellen durch 320 Mikroliter Waschtropfen PBS und 0,1%PVP unter Embryokulturöl, wobei darauf geachtet wird, keine Zellen zu verlieren. Nach dem Waschen der Zellen verwenden Sie eine fein gezogene Glaspipette, um eine Zelle auszuwählen.Pipetten Sie die Einzelzelle vorsichtig in ein steriles 0,2 Milliliter Low-Bind-Rohr mit einem minimalen Volumen von PBS und PVP. Schnappen Sie freie Einzelzellen in flüssigem Stickstoff und speichern Sie sie bei negativen 80 Grad Celsius für die weitere Verwendung. Gesunde Embryonen zeigten im Laufe einer ausgedehnten Kultur eine anhaltende Proliferation, während abnorme Embryonen begannen, sich von ihren äußeren Rändern zurückzuziehen und sich aufzulösen.Am achten Tag nach der Befruchtung waren die meisten Zellen in den Embryonen Zytotrophoblasten oder CTBs, die positiv für den Trophoblastenmarker GATA-3 waren. An der Peripherie des Embryos unterschieden sich die CTBs bereits in mehrkernige Synzytiotrophoblasten, die ein blattähnliches Aussehen hatten und positiv für den Menschen CGB gefärbt waren. Am 10. Tag war die Bildung von CGB-positiven wandernden Trophoblastzellen maximal, was durch den Anstieg der HCG-Produktion zu diesem Zeitpunkt bestätigt wurde.Wandernde Trophoblasten, die für HLA-G positiv gefärbt wurden, begannen ebenfalls zu entstehen und aus dem Embryokörper wegzuwandern. Am 12. Tag war die STB-Differenzierung rückläufig und die MTB-Produktion wurde stärker, was auf eine Verlagerung der Schwerpunkte von der Hormonproduktion am 10. Tag auf die Zellmigration am 12. Tag hindeutet. Diese Veränderungen können in einem Zeitraffervideo der Peri-Implantationszeit beobachtet werden.Das Video zeigt den Zusammenbruch des Blastoceles, die Bildung des STB und die eventuelle Differenzierung und Migration von MTB. Das Wichtigste, was Sie bei Abschluss dieses Verfahrens beachten sollten, ist, dass Sie mit lebenden Embryonen arbeiten, die empfindlich auf Temperatur-, Osmolalitäts- und pH-Wert-Änderungen reagieren. Die Minimierung der Zeit, die die Gerichte ageniert aus dem Brutkasten sind, ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Gesundheit des Embryos.Nach Abschluss dieses Verfahrens können die Forscher isolierte Einzelzellen für nachgeschaltete einzelzellige Omics-Assays wie die sequenziumierende RNA-Sequenzierung einzelner Zellen und die vollständige Genom-Bisulfit-Sequenzierung verwenden, um epigenetische und transkriptomische Veränderungen während der menschlichen Implantation und frühen Plazentabildung besser zu verstehen.

single-cell-collection-trophoblast-cells-peri-implantation-stage

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video zeigen wir die Isolierung der Maus Blastozysten und die Ableitung der Trophoblast-Stammzellen aus Blastozysten. Wir beschreiben auch Bedingungen für die Wartung der Stammzell-Eigenschaft sowie die Induktion der Differenzierung in Kultur.

Ableitung der Maus Trophoblast Stammzellen aus Blastozysten

In diesem Protokoll beschreiben wir die Zerlegung der Plazenten von der Maus auf die Schwangerschaft d10.5, durch Isolation von Trophoblastzellen mit einem Percoll-Gradienten folgen. Wir demonstrieren dann Verwendung der isolierten Zellen in einem Matrigel Invasionsassay.

Isolation of Primary Maus Trophoblastzellen und Trophoblastinvasion Assay

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur siRNA effizient transfizieren in frisch isolierten menschlichen villöse Zytotrophoblasten Verwendung Mikroporation und Identifizieren von DNA-Protein-Komplexe in diesen Zellen. Transfizierte Zellen können durch Western-Blot überwacht werden und EMSA-Analysen während der 4-tägigen Kulturzeit.

siRNA-Transfektion und EMSA-Analysen auf frisch isolierten menschlichen Villöse Cytotrophoblasten

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die direkte Umwandlung von murinen embryonalen Fibroblasten in voll funktionsfähige und stabile Trophoblasten-Stammzellen durch zehntägige Überexpression von Tfap2c, Gata3, Eomes und Ets2.

Protokoll für die direkte Umwandlung von murinen embryonalen Fibroblasten in Trophoblast Stammzellen

Trophoblasten-Riesenzellen (TGCs) spielen eine Schlüsselrolle in der Plazenta, um eine gesunde Schwangerschaft zu gewährleisten. Wir stellen ein Protokoll zur Beurteilung des transkriptionellen Status von Genen in TGCs durch naszierende fluoreszierende in situ-Hybridisierung an Kryostatenschnitten von postimplantierten Embryonen oder Kurzzeitkulturen von embryonalen Tag-7-Ektoplazentären Zapfen vor.

Transkriptions-Analyse von RNA Nascent FISH<em&gt; In Vivo</em&gt; Trophoblast-Riesenzellen oder<em&gt; In Vitro</em&gt; Kurzfristige Kulturen von Ectoplacental Cone Explantate

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur effizienten Erzeugung menschlicher trophoblastischer Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung des knochenmorphogenen Proteins 4 und Inhibitoren der Activin/Nodal-Signalwege. Diese Methode eignet sich für die effiziente Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen und kann große Mengen an Zellen für die genetische Manipulation erzeugen.

In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

Hier ist ein Protokoll für die Probenahme der menschlichen Plazenta Zotten Gewebe gefolgt von Isolation der Cytotrophoblasts für die primäre Zellkultur. Behandlung von Trophoblasten mit TNF rekapituliert Entzündung in der übergewichtigen intrauterine Umwelt und ermöglicht die Entdeckung von molekularen Zielstrukturen, geregelt durch eine Entzündung in der Plazenta mit mütterliche Korpulenz.

Eine primäre menschlichen Trophoblast-Modell, die Wirkung der Entzündung mit mütterlichen Fettleibigkeit auf Verordnung der Autophagie in der Plazenta zu studieren

Dieses Protokoll zeigt eine Methode zur Isolierung von primären menschlichen deziduale Zellen gesammelt von den fetalen Membranen der Begriff plazentas, die für eine Vielzahl von Anwendungen (z. B. Immunocytochemistry, Durchflusszytometrie, etc.) verwendet werden können mit dem Ziel zur Untersuchung der Rolle von verschiedenen Zell-Populationen in Komplikationen während der Schwangerschaft.

Isolation von primären menschlichen Deziduale Zellen aus der fetalen Membranen der Begriff Plazentas

Hier präsentieren wir eine hochverfügbare Protokoll für die Bewertung der Zellbewegung in menschlichen Trophoblast Zellen mit drei in-vitro-Tests: der Scratch-Test, Transwell Invasion Assay und der Zelle Verbreitung Assay.

In-vitro-Tests zur Bewertung der Migration, Invasion und Proliferation von verewigt menschlichen Ersttrimester-Trophoblast Zelllinien

Das vorliegende Protokoll ermöglicht die Wiederherstellung von röhrenartigen Strukturen, die im klassischen in vitro Angiogenese-Röhrenbildungsassay gebildet wurden, bei dem Zellen, wie z. B. Trophoblastzellen, in kapillarartigen Strukturen über einer Schicht aus extrazellulärer Basalmembranmatrix organisiert sind. Die gewonnenen Strukturen werden zur RNA- und Proteinisolierung für verschiedene biochemische Analysen verwendet.

Trophoblastenzellgewinnung aus Angiogenese-Röhrchenbildungsassay für die Analyse der Differenzierungsmarkerexpression

Dieses Protokoll ermöglicht die Reinigung, Charakterisierung und Kultivierung primärer HLA-G+-extravillöser Trophoblasten (EVT) aus der Decidua basalis und der chorionischen Membran menschlicher Term-Plazentas. Primäre EVT-Kulturen erhalten die Lebensfähigkeit 96 Stunden lang aufrecht, was eine Kokultivierung mit probengematchten mütterlichen Immunzellen sowie eine anschließende zytometrische und molekulare Analyse ihrer Interaktionen ermöglicht.

Reinigung von HLA-G+ -Extravillen-Trophoblasten aus menschlichen Term-Plazentageweben für Phänotypisierung und funktionelle Analyse

Erfahren Sie die Einzelzellsammlung von Trophoblastenzellen zur Untersuchung menschlicher Implantation und früher Plazentabildung. Diese Methode ermöglicht die Analyse epigenetischer und transkriptomischer Veränderungen während der Embryonalentwicklung.

Einzelzellsammlung von Trophoblastenzellen im Peri-Implantationsstadium menschliche Embryonen

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