Nachweis von Phytophthora capsici im Bewässerungswasser mit Loop-Mediad Isothermale Amplifikation

Der Nachweis von Phytopathogenen ist ein entscheidender Schritt im Management von Pflanzenkrankheiten. Dieses Protokoll bietet eine Schnellerkennungsmethode für die Kontamination von Bewässerungswasser aufgrund eines häufigen wasserbasierten Kampferregers. Mit dieser Technik können spezifische Erreger wie Phytophthora capcici aus unserem großen Volumen an Bewässerungswasser verarbeitet und schnell nachgewiesen werden, während sie vor Ort bleiben.

Demonstriert wird das Verfahren von Owen Hudson, einem Master-Studenten aus meinem Labor, und Sumyya Waliullah, einer Postdoktorandin aus dem Labor von Dr.Pingxi G, um eine Pumpe und einen Filter für den Phytophthora capcici-Nachweis vor Ort im Bewässerungswasser einzurichten. Befestigen Sie einen Filterkolben an einem Rohr, das mit einer Handpumpe verbunden ist, und montiert buchner Trichter in den Gummistopfen im Mund des Filterkolbens. Dann passen Sie ein entsprechend großes Stück Filterpapier mit einer Retentionsgröße von 15 Mikrometern in den Trichter.

Um Wasserproben zu erhalten, sammeln Sie Bewässerungswasser aus der Zielquelle. Das Wasser kann kleine Mengen an Schutt haben, aber nicht signifikante Sedimente oder Boden. Gießen Sie langsam zwischen 50 bis 1000 Milliliter Testwasser über das Filterpapier im Trichter, während Sie die Handpumpe verwenden, um eine Absaugung zu erzeugen, um das Wasser durch den Trichter zu ziehen.

Wenn das gesamte Wasser gefiltert wurde, verwenden Sie Zangen, um das Filterpapier aus dem Trichter zu entfernen. Und verwenden Sie sterile Schere, um das Papier in kleine Stücke zu schneiden. Acht bis zwölf Stück Papier in 400 Mikroliter Extraktionspuffer in einem 1,5-Milliliter-Rohr für eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur untertauchen.

Wirbel oder anderweitig das Papier für 10 Sekunden einmal pro Minute aufregen. Verwenden Sie am Ende der Inkubation Zangen, um das Papier mit so wenig Puffer wie möglich zu entfernen. Und wiederholen Sie die Lizenz mit dem nächsten Satz von Filterpapierstücken.

Zur DNA-Extraktion aus den Filterpapierproben wurden der Probe 20 Mikroliter Proteinase K und 10 Mikroliter 10 Nanogramm pro Mikroliter RNAs zugesetzt und die Lösung bei Raumtemperatur 15 Minuten lang mit Wirbeln oder Schütteln alle drei Minuten inkubiert. Am Ende der Inkubation 500 Mikroliter Magnetperlen in Bindungspuffer in die Probe geben und durch Schütteln gut vermischen. Legen Sie nach fünf Minuten bei Raumtemperatur das Rohr und das magnetische Trennträgerfürrack zwei Minuten auf, bevor Sie den Überstand entfernen und entsorgen.

Entfernen Sie das Rohr aus dem magnetischen Separator und hängen Sie die Perlen in 500 Mikroliter Waschpuffer kräftig wieder auf. Nach 30 Sekunden kehren Sie das Rohr zum Magneten zurück und warten Sie zwei Minuten, bevor Sie den Überstand entsorgen. Wiederholen Sie die Wäsche mit 500 Mikroliter Waschpuffer und 500 Mikroliter 80% Ethanol, wie gerade gezeigt.

Und Luft fahren das magnetische Perlenpellet für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation hängen Sie die Perlen in 50 MikroliterElutionspuffer mit Pipettierung für eine Minute wieder auf, bevor Sie das Rohr für zwei Minuten wieder auf den Magneten legen, um die Aufnahme des Überstandes zu ermöglichen. Nach der Vorbereitung der LAMP Primer Mischung, wie in der Tabelle angegeben, fügen Sie bei 2,5 Mikroliter Primer Mix 12,5 Mikroliter eines Lava LAMP Mastermix einen Mikroliter extrahierte DNA und neun Mikroliter doppeldestilliertes Wasser zu einem PCR-Rohr und richten Sie eine positive und eine negative Kontrolle.

alle Proben in einem 64 Grad Celsius Wärmeblog für 45 Minuten oder das genie drei Amplifikationsinstrument am Ende der Inkubation, eine Last von fünf Mikroliterjeder verstärkten Probe auf ein 1%Agarose-Gel zu inkubieren und die resultierenden Bänder auf einer ultravioletten Bildgebungsmaschine abzubilden. Wenn ein kalorimetrischer Farbstoff verwendet wurde, zeigen Sie die Farbänderung an, um die Ergebnisse als positiv oder negativ zu bestimmen. Wenn ein tragbares Verstärkungsinstrument verwendet wurde, zeigen Sie das Amplifikationsdiagramm auf dem Bildschirm an, um die Ergebnisse zu ermitteln.

Die optische Zeit für den Betrieb des LAMP-Assays bei 64 Grad beträgt 45 Minuten, da die niedrigsten Konzentrationen, die positiv für die Detektion waren, erst nach 40 Minuten verstärkt werden, während höhere Konzentrationen bei 20 Minuten verstärkt werden. Die Amplifikation kann auf einem 1%agarose Gel bestätigt werden, das mit einem Nukleinsäurefleck gekennzeichnet ist. Wie dargestellt ist die herkömmliche PCR 40-mal weniger empfindlich als LAMP.

4,8 mal 10 bis die dritten Zoosporen pro Milliliter konzentrationen bei den niedrigsten. Bei dieser Analyse wurden Wasserproben aus sieben Teichen entnommen, die für die kommerzielle Gemüseproduktion in Tift County, Georgia, verwendet wurden. Drei davon zeigten positive LAMP-Ergebnisse.

Als die Proben jedoch mit konventioneller PCR getestet wurden, wurden Zoosporen nur in einer der drei positiven Proben nachgewiesen. In dieser Tabelle werden die Unterschiede zwischen Erkennungsmethoden mit Variablen wie Empfindlichkeit, Zeit, erforderliche Vorbereitung, Materialien und Kosten zusammengefasst. LAMP ist die kostengünstigste Methode unter den getesteten Methoden und ist auch die schnellste, die nur 30 bis 60 Minuten für die Amplifikation im Vergleich zur herkömmlichen PCR-Verstärkung benötigt.

Die Verwendung dieses Protokolls dna aus eng verwandten UMI-Samen-Erregern extrahiert führt zu keinem Nachweis für eine der Proben, bestätigt die Spezifität der Primer. Achten Sie darauf, das Probenwasser nicht zu schnell zu gießen und seien Sie vorsichtig, wenn Sie extrahierte DNA zu den LAMP-Röhren hinzufügen, um die Kontamination zu begrenzen. Sobald andere wasserbasierte Krankheitserreger ihre spezifischen Primer-Sets entwickelt haben, können die Filtrations- und Lampensäuremethoden für andere Krankheitserreger angepasst werden.